Name: impression cytology of the lid wiper area
Uploaded: 2016-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
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We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.

declaração de ética: Antes da coleta de células de seres humanos, consentimento informado e aprovação ética deve ser obtida. 1. Prepare Stain NOTA: Prepare mancha no dia do experimento. <ol><li> Adicionar 5 uL de etídio (ou 4 mM) e 5 ul de calceína AM (ou 4 mM) a 2,5 ml de tampão fosfato salino (PBS) em 15 ml de tubo de centrifugação; misturar. Embrulhe em papel alumínio para proteger da luz e armazenar a RT até o uso. </li></ol> 2. Células Colete <ol><li> Remover inserções de cultura de células a partir de sua embalagem e rotulagem para cada pálpebra a amostrar. Marca de orientação de recolha de células, no lado do suporte de plástico membrana utilizando marcador permanente. Conduta fenda inspecção lâmpada com uma ampliação moderada (aproximadamente 20X) para confirmar a saúde adequada da região de se submeter IC. </li><li> Dispensar uma gota de anestésico tópico (0,5% de cloridrato de proparacaína) no fundo do saco conjuntival de EAch olho e instruir participante para manter os olhos fechados por um minuto. </li><li> Evert tampa e parte superior do olho manter no lugar pelos cílios; evitar qualquer contato com a área da tampa do limpador. Opcional: a ajuda de um investigador secundária pode ser necessário para executar esta etapa. </li><li> Aplicar membrana perpendicularmente sobre a parte central da região do limpador a tampa com o mínimo de pressão. </li><li> Segure membrana no local por 3-5 seg. Observe a membrana se tornar translúcida na área de contato. Neste ponto, remover suavemente a membrana e permitir tampa do participante para &quot;flip&quot; de volta no lugar. </li><li> Prontamente aplicar uma gota de PBS à amostra, para impedir que sequem. Membrana girará translúcida e opaca não deve ligar a qualquer momento, como isso indica secagem. Têm o investigador secundário prosseguir imediatamente com o processamento de amostras (secção 3). </li><li> Realizar verificação final olho para garantir a integridade da conjuntiva. Dispensar lubrificantes oculares e instruir participantepara evitar esfregar os olhos até que o efeito anestésico desgasta fora (aprox. 15 min). </li></ol> Processamento 3. Amostra <ol><li> Utilizando micro-tesoura, cortar a membrana na metade (metade de cada uma das análises a jusante), perpendicular através do meio da recolha de células. O corte ao longo da margem exterior de uma metade da membrana para separar o do suporte de plástico; evitar a interacção com as células recolhidas na membrana, incluindo assegurar que a membrana não se dobra sobre si própria. </li><li> Garantir a membrana usando uma pinça antes completamente desconectar do titular. Ponto de membrana para dentro do tubo de centrífuga de 2 ml rotulados, contendo 500 ul de 95% (v / v) de etanol e deixa-se fixar durante um mínimo de 20 min a um máximo de 2 horas antes do processamento (secção 4.2). </li><li> segunda metade imediatamente separada da membrana (como descrito na seção 3.2) e proceder imediatamente com a secção 4.1. </li></ol> Coloração 4. Amostra <ol><li> Immunocytochemical coloração <ol><li> Com cuidado, coloque membrana em 35 milímetros de vidro prato de cultura inferior com o lado coleção voltada para baixo; garantir a membrana é plana. </li><li> Pipetar 20 l de composição mancha imunocitoquímica montada na secção 1 para a membrana. Se amostra cachos, use pontas de pipeta descartáveis ​​para achatar cuidadosamente a membrana, empurrando suas bordas para baixo. Evitar o contacto com as zonas de recolha de células. </li><li> Gentilmente cobrir a membrana com tampa de vidro deslizante. Evite movimento desnecessário da amostra. Cubra a assadeira com tampa e vedação com laboratório de película em torno das bordas. Não obstrua a transparência de prato (superior e inferior) e visibilidade da amostra. Etiqueta com marcador de laboratório. </li><li> proceder imediatamente à imagem (secção 5.1), em seguida, voltar a secção 4.2 para continuar com coloração citológica da outra metade da membrana. </li></ol></li><li> citológico coloração <ol><li> Gradualmente hidratar membrana por adição lenta de 500 mL de água destilada para o tubo de retornosed para fixação na secção 3.4. conteúdo aspirado várias vezes na ponta da pipeta para misturar, em seguida, remover conteúdo. </li><li> Adicionar 500 uL de água destilada. Deixe repousar por alguns segundos, em seguida, remover. Adicionar 500 mL de mancha azul Alcian e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar 3 consecutiva 500 mL de água destilada lavagens ou até que o líquido lavagens claras. </li><li> Adicionar 500 mL de Hematoxilina # 1 mancha e deixe por 3 min. Remover manchas e realizar três consecutivos 500 mL lavagens água destilada ou até que o líquido lavagens claras. Desidratar (inverso do ponto 4.2.1) por aspiração do líquido claro. </li><li> Adicionar 500 mL de Papanicolaou OG-6 mancha e deixe por 3 min. Remover mancha e executar um de 500 ul 95% (v / v) de lavagem etanol. </li><li> Adicionar 500 ul de corante Papanicolaou EA-65 e deixar durante 3 min. Remover mancha e executar três consecutiva de 500 ul de 95% (v / v) de etanol lavagens. </li><li> Totalmente desidratar usando 500 ul três lavagens consecutivas de 100% de etanol. usando tweezers, retirar amostra de solução; evitar áreas de coleta de células tocantes. </li><li> Coloque membrana sobre lâmina de vidro; assegurar que a linha de colheita de células é paralela ou perpendicular a deslizar margem para o alinhamento mais fácil durante o exame. </li><li> Aplique uma gota de etanol 100% e cubra com deslizamento de vidro. proceder imediatamente à imagem (secção 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Amostra de imagem <ol><li> Imagens fluorescentes imunocitoquímicos Stains <ol><li> Use um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) 11 ou microscópio de fluorescência 12, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem. Devido às amostras a ser contido dentro placas de cultura, um microscópio invertido pode ser necessário. </li><li> Defina-se 11,12 microscópio de acordo com espectros de absorção e emissão de etídio homodímero-1 (528/617 nm máximos Ex / Em na presença de ADN) e calceína AM (494/517 nm Ex / Em máximos). </li><li> Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar o sistema de imagem digital; observar a amostra indicada no monitor do computador. </li><li> Inspecione amostra para características celulares de interesse. </li><li> Selecione ampliação microscópio desejado e adquirir imagens usando software de imagem. </li><li> Salvar arquivos em qualquer formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff). </li></ol></li><li> Imagem citológica Stains <ol><li> Use um microscópio padrão de laboratório de campo brilhante sem filtros, equipado com uma câmera de cor digital, conectado a um computador com um software de aquisição de imagem. </li><li> Local e lâmina de vidro bloqueio (do passo 4.2.8) no palco microscópio. Rehidratar amostra com etanol a 100%, conforme necessário, ao longo do procedimento de imagem inteira. </li><li> Selecione menor ampliação do microscópio (por exemplo, objetiva 2,5X) e ativar thsistema de imagem digital e; observar a amostra indicada no monitor do computador. </li><li> Assegurar a recolha de células é alinhado com um dos eixos X ou Y de controle do estágio de microscópio. Ajuste, se necessário, pela remoção da tampa de deslizamento e rotação da amostra, utilizando uma ponta de pipeta ou pinças. </li><li> Usando a imagem (s) de captura de toda a amostra com o microscópio de ampliação menor software de imagem,. </li><li> Mudar para a ampliação do microscópio moderada (por exemplo, 10 - 20X objetiva) e ajustar fonte de luz do microscópio e parâmetros de imagem de software (exposição, contraste, balanço de brancos, etc.), e desativar a sua medição de software automatizado. Salvar essas configurações para uso futuro. </li><li> Determinar pontos inicial e final de varredura (por exemplo, superior esquerdo e direito cantos inferiores de recolha de células). </li><li> Usando a imagem (s) de captura de toda a área de colheita de células dentro dos pontos inicial e final software de imagem,. Certifique-se a 20% lado-a-lado e de cima para baixo sobreposição between todas as imagens adjacentes. </li><li> Salvar arquivos usando o formato de arquivo microscópio nativo ou um formato de arquivo não compactado (por exemplo, * .raw, * .tiff). </li><li> Gerar imagem panorâmica final usando o software automatizado costura de escolha (por exemplo, o Adobe Photoshop Elements). Use imagens de referência tomadas no passo 5.2.5) para confirmar a precisão da costura automatizada na imagem final. </li></ol></li></ol>

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The authors have no relevant funding or conflicts to disclose.

citologia de impressão é tipicamente realizada na conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres de celulose misturados. As amostras são cortadas ao tamanho a partir de folhas de material a granel, esterilizado, aplicado e removido da superfície conjuntival utilizando fórceps. Usando o mesmo material de membrana, um dispositivo de IC controlado-pistão foi recentemente concebido para coincidir com a geometria da superfície da conjuntiva bulbar, e manter a pressão constante entre 13 aplicações. Essas abordagens são ineficientes para a tampa estreita, com destaque curva limpador região (veja a Figura 1). Além disso, as membranas de éster de celulose mista não fornecem a transparência necessária para configurações onde a microscopia de campo claro é necessário alinhar as amostras antes da imagem fluorescente. As inserções de cultura de células propostas neste protocolo são convenientes porque são esterilizadas, de preferência dimensionados e pode ser manuseado manualmente, sem mais equipamento, assegurando colecções rápidas. As membranas são feitas a partir dehidrofílico PTFE, que fornece uma transparência adequada para análise de microscopia confocal. No geral, as características morfológicas das células coletadas coincidem com relatos da literatura anteriores 7,8,14,15. Substituindo a-Schiff ácido mancha comumente usado (e cromaticamente muito intenso) periódico (PAS) com o azul alcian permite corantes Papanicolaou subsequentes para exibir variação mais fina cromática, permitindo uma perspectiva mais detalhada sobre o nível de queratinização celular, do que o relatado antes de 7,8. imagens microscópicas de amostras citológicas geralmente envolve inspeção visual através das oculares, e fotografia de alta ampliação de estruturas consideradas &quot;de interesse&quot;. Com esta abordagem, os aspectos &quot;visão global&quot; de toda a coleção pode ser perdida. Tiros de baixa ampliação são geralmente de qualidade óptica inferior (devido à vinheta, aberrações, etc.) ea resolução é insuficiente para descrever detalhes celularess. O protocolo panorâmica costura proposto aqui, enquanto um pouco mais demorado, é vantajoso, uma vez que fornece uma visão geral da membrana integral, bem como a capacidade de zoom ao detalhe nuclear, tudo em uma imagem. Métricas quantitativas, tais como a contagem de células, nuclear-citoplasmática (NC) relação de 16 e distâncias podem ser computados aqui. Há três passos críticos no âmbito do protocolo que requerem atenção especial: a aplicação correcta da membrana sobre a conjuntiva (secção 2.4), o tempo entre as etapas de processamento de amostras (seções 2.6 e 3 a 5) e parâmetros de imagem consistentes para costura panorâmica ideal (secção 5.2 0,6 - 5.2.8). Ao contrário da conjuntiva bulbar relativamente plana, a tampa do limpador região tem uma curvatura acentuada, abrangendo uma largura estreita de apenas 1 - 2 mm entre epiderme e sulco tarsal. É essencial que a membrana ser aplicada, com o ângulo correcto, tal como isto pode influenciar grandemente do tipo de células recolhidas. Em segundo lugar, MEMpressão brana deve ser consistente entre os aplicativos. O pesquisador deve, portanto, desenvolver a destreza necessária para garantir coleções repetíveis. Uma vez que as amostras são coletadas utilizando a técnica de citologia de impressão, o tempo de processamento torna-se crucial. Amostras nunca deve ser permitida a secar, ou seja, a membrana não deve tornar-se opacos (seções 2.6, 3 a 5). Enquanto a amostra a passar por coloração citológico pode ser deixado no fixador durante um tempo prolongado (20 min - 2 horas), as manchas imunocitoquímicos deve ser adicionado e fotografada, sem atraso, para avaliar a viabilidade celular como a maior precisão possível. Consistência de timing também é essencial para resultados comparáveis ​​entre amostras; deve-se procurar manter o tempo de fixação e coloração igual para todas as amostras a serem comparadas. Finalmente, a fim de obter imagens panorâmicas qualitativos da amostra de citologia, todos os parâmetros de imagem (microscópio de intensidade de luz, exposição da câmera, contraste, balanço de branco, etc.)deve ser calibrado para uma região representativa da amostra, com a maior diversidade de características de interesse (ou seja, tipos de células), e todos de medição automatizada ser desativada para as fotografias subsequentes (seção 5.2.6). O investigador deve também visam orientar a coleta de células de acordo com X ou eixo Y do estágio do microscópio. Isso irá facilitar a aquisição de imagem e processo de costura. Aponte para localizar e utilizar características distintivas da amostra (por exemplo, manchas celulares, meibum, detritos, etc.) nas regiões de sobreposição entre as imagens adjacentes. O foco do microscópio deve ser o único ajustamento que deve ser corrigido entre os disparos. A limitação desta técnica reside na variabilidade das coleções de células, como inicialmente observado por Jalbert 8, que relataram uma taxa de sucesso de 67% na obtenção de manchas confluentes de células tampa do limpador. O ângulo de aplicação determina o número e tipo de células coletadas. Nesta fase, é incerto wuer qualidade da captação (isto é, o número de células na amostra) é correlacionada com a saúde ocular. Os ensaios clínicos com amostras maiores são necessários para comprovar a validade desta técnica. Um outro inconveniente reside na capacidade de invasão inerente à técnica de IC si. As camadas de células superiores são removidos à força a partir da conjuntiva, o que pode induzir danos. Enquanto as manchas imunocitoquímicos destinam-se a reflectir a viabilidade celular (e atividade esterase está presente em todas as coleções), não está claro o que a fluorescência vermelha de núcleos celulares nas nossas colecções indicam. Ocasionalmente, meibum (isto é, lípidos segregados na margem da pálpebra) e outros componentes a partir da superfície ocular ou filme lacrimal tenderá a cobrir características celulares e fazer a análise difícil ou impossível. O protocolo pode ser modificado com uma lavagem adicional em xileno para remover os lípidos meibum. Finalmente, o efeito de gotas de anestésico sobre as células da conjuntiva é desconhecido. <p class="jove_content"&gt; Porque microscopia confocal é demorado, um número suficiente de imagens não é praticamente obtidas para costura panorâmico. Para este fim, a microscopia de epifluorescência regular pode em vez disso ser utilizada para reduzir o tempo de imagiologia à custa da resolução. A obtenção de dados da estrutura celular da região da tampa do limpador irá ajudar a verificar a correlação entre a fricção que ocorre entre estas células e a superfície ocular, e o conforto subjectivo. Isto irá fornecer um conhecimento valioso e permitir que os ensaios clínicos futuros para explorar as particularidades celulares de usuários de lentes de contato, indivíduos com epiteliopatia tampa do limpador, sintomas oculares ou secura secos, em contraste com indivíduos assintomáticos, para lançar espero luz sobre o tema de desconforto ocular.

A pálpebra superior humano executa cerca de 10.000 pisca a cada dia 1, com apenas um 1 - região conjuntival 2 milímetros estreita opostos do globo ocular. Devido ao seu movimento de limpeza durante o pestanejar, esta porção da margem da pálpebra foi denominada a &quot;tampa do limpador&quot; região 2. Supõe-se que o atrito é aumentada nessa região durante a piscar habitual, devido à tampa limpar todo o globo. Isto pode desempenhar um papel significativo no conforto ocular. Lente de contato usuários em particular experiência de desconforto ocular e esta é uma das razões principais para cessar o uso das lentes 3. Quando uma lente de contacto é colocada sobre o olho, o coeficiente de atrito entre o material da lente e a superfície ocular foi mostrado para alterar 4. Há evidências que sugerem que os sintomas de secura pode estar relacionado a este atrito alterado 2,5,6. Esta associação também pode ser refletida em fenômenos observáveis ​​clinicamente, nomeadamente wi tampapor epiteliopatia (LWE), também chamado superior da tampa margem de coloração (ULMS) 6. LWE é um sinal precoce de irritação ocular e um preditor potencial para a doença do olho seco. Ele é observado e medido pela coloração vital das regiões superiores e inferiores margem palpebral. Embora este sistema de classificação 2 e sua validade clínica (ou seja, correlação com sintomas subjetivos) ainda estão em debate, desconforto ocular permanece um enigma para os médicos e cientistas e, mais importante, um inconveniente para os pacientes. Até à data, pouco se sabe sobre as variações clinicamente relevantes no (sub) anatomia celular e fisiologia da área do limpador a tampa 7 e apenas um relatório faz uso de métodos citológicos 8. Citologia de impressão (CI) foi utilizada há mais de 40 anos para recolher as células a partir da superfície do epitélio da conjuntiva tarsal bulbar ou por aplicação de uma membrana de 9,10. Após remoção, as células aderentes submeter Cytological coloração e de imagem microscópica. Devido às diferenças anatómicos celulares e na região do limpador a tampa, esta técnica requer a optimização.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>B8438-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin, Gill 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, OG-6</td><td>Sigma</td><td>HT40116-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, Modified EA</td><td>Sigma</td><td>HT40232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes</td></tr><tr><td>Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12&amp;nbsp;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

impression cytology of the lid wiper area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

A membrana de cultura de células durou mais o suporte de plástico é uma ferramenta conveniente para a recolha de mão de células epiteliais da conjuntiva tampa do limpador. Este método elimina a necessidade de instrumentos esterilizados adicionais tipicamente utilizados para preparar e manipular membranas IC. A Figura 1 representa a área de IC limpador a tampa usando uma inserção de cultura de células. Nós otimizamos dois protocolos de coloração diferentes que se complementam para caracterizar células epiteliais da área do limpador a tampa de uma forma nova. Corantes imunocitoquímicos fluorescentes revelam actividade de esterase, um indicador da viabilidade das células, e os ácidos nucleicos, a coloração das quais reflecte compromisso membrana celular, como mostrado na Figura 2. O protocolo de coloração citológica permite uma fina distinção entre queratinização graus. A Figura 3 mostra a transição entre o baixo queratinização na conjuntiva tarsal e queratina avançadazação na conjuntiva limpador tampa e epiderme. formação de imagens panorâmicas de colecções de células coradas com citologia permite a análise de toda a área de recolha, em oposição a uma região de interesse seleccionados. A resolução da imagem é adequada para aumentar o zoom até o nível nuclear; morfologia celular pode ser determinado com precisão. A Figura 4 mostra a imagem final de uma colecção de células citologicamente coradas, cosida em conjunto, utilizando aprox. 100 arquivos de alta resolução separadas. Essas ferramentas podem ser utilizadas para avaliar os efeitos de atrito e / ou do olho seco de uma nova maneira. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig1.jpg" /> Figura 1. citologia de impressão da tampa do limpador Área. A citologia de impressão realizada na região da tampa do limpador exposta por eversão da tampa superior. Membrana utilizada é de Cultura Celular Inserir, 12 mm, de PTFE hidrofílico. Nota as abas de suporte da membrana, o que pode ser retido (ao contrário préestudos riores sobre a conjuntiva bulbar, em que foram removidos antes da aplicação) como eles não interfiram com a aplicação da membrana na margem palpebral estreita e pode realmente ajudar no alinhamento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54261/54261fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig2.jpg" /> Figura 2. Células fluorescentes da tampa do limpador Região. Microscopia confocal de varrimento laser mostrando variação da morfologia celular entre grandes células escamosas (A) e as células colunares / cubóide menores (b). Fluorescência verde de calceína AM indica a actividade de esterase no corpo da célula (isto é, a viabilidade das células). fluorescência vermelha de Ethidium revela ácidos nucleicos, indicando comprometimento da membrana celular. Poucas células mostram verde intenso e sem fluorescência vermelha, possivelmente em<html> dicative da integridade da membrana celular (c). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54261/54261fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig3.jpg" /> Figura 3. citológica Coloração de IC da amostra. As células da região mostram tampa do limpador morfologia variada e diferentes graus de queratinização. cor azul de células pequenas, cilíndricas e cúbicas com núcleos grandes, encontrados na conjuntiva marginal / tarsal, indica que não há queratinização (a); mancha vermelha / laranja de grandes células escamosas com núcleos condensados ​​da junção muco-cutânea (Linha MCJ / Marx &quot;) e anuclear células da epiderme representa queratinização avançado (c). cor de Transição (vermelho / azul) e morfologia das células na área do limpador conjuntival a tampa sugerem queratinização limitado (b).g3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54261/54261fig4.jpg" /> Figura 4. imagem composta da tampa do limpador Coleção Cell. Citologia de impressão da área do limpador a tampa após a coloração citológica. Imagem costurada usando aprox. 100 fotos individuais tiradas com um microscópio e objetiva 20X. (A) colunar Small / epitélio cúbico do tarsal conjuntiva / marginal. Células aqui exibem cores azul / verde / roxa indicando nenhuma queratinização; (B) as células da conjuntiva tampa do limpador, de transição na morfologia e cor da mancha entre as regiões (a) e (c); (C) grandes células escamosas da linha muco-cutânea junção / Marx &quot;. Cor laranja mancha indica algum grau de queratinização, e vermelho / rosa indicam tarde fase de transição escamosas; (D) Meibum impressão; (E) anuclear, células cornified da epiderme; (F) Limpressão celular oblet ou mucinas do filme lacrimal. Seta para baixo indica tarsal área conjuntival, seta para cima indica tampa exterior. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54261/54261fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Impression Cytology of the Lid Wiper Area

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

A citologia de impressão da Área Wiper a tampa

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

impression-cytology-of-the-lid-wiper-area

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K visualizações.  University of Waterloo. We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort. 

Vídeo: Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Pesquisa do câncer

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Neurociência

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Preparação e Análise Morfológica das Culturas celulares da crista neural do pintinho

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Biologia do Desenvolvimento

Avaliação da Neoplasia Escamosa da Superfície Ocular Usando HR-OCT do Segmento Anterior

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. Traditionally, the diagnosis of OSSN relies on histopathological confirmation followed by a full-thickness biopsy. However, in the past two decades, the therapeutic approach to OSSN has shifted from surgical intervention to topical chemotherapy regimens in clinical settings. This shift emphasizes the need for less invasive or non-invasive methods to diagnose ocular surface pathologies. Among various imaging devices, commercially available high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) has emerged as a powerful tool for the characterization of OSSN. HR-OCT provides an in vivo, cross-sectional view of ocular surface lesions, offering an "optical biopsy" for OSSN with high sensitivity and specificity. It provides valuable information in differentiating intraepithelial or invasive OSSN from other benign lesions. Additionally, HR-OCT can be used to monitor the response to topical chemotherapy and to detect subclinical OSSN during follow-up visits. In this article, the scanning protocol for image acquisition is presented, and image interpretation for OSSN is outlined. This standardized, practical, and reproducible approach is recommended in clinical workflows and is expected to assist clinicians in the management of OSSN.

Autor em destaque: FC-OCT anterior como ferramenta não invasiva para caracterização da neoplasia escamosa da superfície ocular

Anterior segment high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) is a promising non-invasive modality for the diagnosis and therapeutic evaluation of ocular surface squamous neoplasia (OSSN). Here, the system setup, scanning technique, and representative diagnostic results are presented.

Tomografia de Coerência Óptica de Alta Resolução Anterior no Diagnóstico e Monitorização Terapêutica da Neoplasia Escamosa da Superfície Ocular

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. ...

Engenharia

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Imunologia e Infecção

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

Amostragem e processamento de escovação nasal usando videomicroscopia ciliar digital de alta velocidade – adaptação para a pandemia de COVID-19

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

A citologia de impressão da Área Wiper a tampa

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Tomografia de Coerência Óptica de Alta Resolução Anterior no Diagnóstico e Monitorização Terapêutica da Neoplasia Escamosa da Superfície Ocular

Tomografia de Coerência Óptica de Alta Resolução Anterior no Diagnóstico e Monitorização Terapêutica da Neoplasia Escamosa da Superfície Ocular

Tomografia de Coerência Óptica de Alta Resolução Anterior no Diagnóstico e Monitorização Terapêutica da Neoplasia Escamosa da Superfície Ocular

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

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