ويود المؤلفون أن يشكروا نانديني نالابان وشارون يو للمساعدة في الخطوات التقنية. وقد تم تمويل الدراسة من قبل منحة البدء ل كغ من مدرسة لي كونغ شيان للطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية، ومن قبل جائزة عالم السريرية العليا من المجلس الوطني للبحوث الطبية وزارة الصحة في سنغافورة (نمرك) ل لوت (نمرك / سسا / 045/2012 م) ومنحة مقدمة من المركز الوطني لمكافحة الجراد الصحراوي (نمرك) وتدار من قبل المركز الوطني للابتكار الصحي إلى كك و لوت (نهيك-12D-1409007).

تم جمع جميع العينات العين المستخدمة في هذه الدراسة من عيادة العين الجافة في مركز سنغافورة الوطني للعيون التي وافق عليها مجلس مراجعة المؤسسية المؤسسية سينغهيلث ومجلس المراجعة المؤسسية نانيانغ التكنولوجية، سنغافورة. ملاحظة: خضعت مواضيع الاختبارات السريرية لتقييم مدى الالتهاب وشدة الاختلالات المسيل للدموع قبل تنفيذ إيك. وشملت الاختبارات السريرية الوقت غير الغازية للكسر المسيل للدموع (ني-تبوت) 14 واحمرار الملتحمة (احتقان) 15 ، 16 تقييمها مع أداة تشخيصية، واختبار شيرمر 17 ، وتقييم المريض القياسية من جفاف العين الاستبيان (سبيد) 18 ، والقرنية تلطيخ 19 . 1. مجموعة من عينات العين بواسطة إيك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحديد الحالة السريرية، تخديرعيون المشارك عن طريق تطبيق 1 - 2 قطرات من التخدير الموضعي، بروباراكايين هيدروكلوريد، إلى الملتحمة العلوية العلوية والسفلية السفلي. انتظر لمدة 4 - 5 دقائق للإحساس لاذع من مخدر على ارتداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات من كل من الأنف والزمني الملتحمة الشظوية مع اثنين من أجهزة علم الانطباع. ملاحظة: يتم استخدام جهاز واحد لجمع اثنين من عينات الانطباع. هنا، تم استخدام جهازين لجمع أربعة أغشية الانطباع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جهاز علم الانطباع علميا على الملتحمة. اضغط على زر الضغط برفق واستمر لمدة 2 - 3 ثوان. ملاحظة: الجهاز يأتي مع الغشاء. يتم تحرير الضغط تلقائيا بعد الضغط على الزر. يستغرق سوى بضع ثوان للافراج عن الضغط وإزالة الجهاز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن الغشاء في أنبوب ميكروسنتريفوج تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام والثقافة (روزويل بارك المعهد التذكاري المتوسطة (رمي) + 10٪ مصل البقري الجنين(فبس) + 1٪ البنسلين الستربتومايسين (القلم بكتيريا)) من قبل مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا من غشاء الجهاز عن طريق كشط المستمر لمدة 1 دقيقة مع 10 ميكرولتر ماصة طرف. ملاحظة: اكتمال اكتمال عندما يصبح سطح الغشاء متفاوتة. أرقام الخلايا من كل غشاء متغير (100 - 500 خلية / غشاء). معالجة العينات في غضون 2 - 3 ساعة من جمع. </li></ol> 2. الخلايا المناعية من قبل التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة وسائل الإعلام. ريسوسبيند الخلية بيليه مع 50 ميكرولتر من التدفق الخلوي تلطيخ العازلة (الفوسفات مخزنة المالحة (بس) + 0.05٪ ألبومين المصل البقري (بسا)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا اللطخة مع لوحة من الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، CD3 البنفسجي الرائعة (بف) 510 (UCHT1)، CD4 ألوفيكوسيانين-H7 (أبك-H7) (SK3)، CCR7 فيكويريثرين (بي) -A، CD45RO بي سيانين 7 (PE- Cy7) -A، ويعيش / ميت علامة الخلية 7-أد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة فيداكن. استخدام الأجسام المضادة مباشرة من الأسهم وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: لتركيز الأجسام المضادة، واستخدام 2.5 ميكرولتر من CD3-BV510، 1.25 ميكرولتر من CD4-أبك-H7، CD45RO-بي-Cy7، 7-آد و 10 ميكرولتر من CCR7-بي. استخدام خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (بمكس) لمعايرة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة. للمعايرة، واتخاذ تركيز الأجسام المضادة المذكورة في بروتوكول الشركة المصنعة واستخدام نصف وربع التركيز الموصى بها. استخدام الحد الأدنى من تركيز الأجسام المضادة لتجنب تسرب إلى قنوات فلوريكروم أخرى. وقد لوحظت إشارات واضحة مع تركيزات المذكورة من الأجسام المضادة. تم إجراء التعويض عن طريق اختبار بمكس في البداية وفقا للبروتوكول المذكور في ويليامز وآخرون . 20 للاختبار، وحضنت بمكس مع نفس مجموعة من الأجسام المضادة المستخدمة هنا وتعويضها بمقارنة البقع الأجسام المضادة مفردة ومتعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحاضنة بيريأود، إضافة 1 مل من تلطيخ العازلة إلى الأنبوب، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكرولتر من تلطيخ العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل العينات على جهاز التدفق الخلوي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحصول على البيانات، ومعايرة تدفق قناة الجهد الكهروضوئي مع إعداد عداد الكريات وتتبع (كس &amp; T) الخرز لتطبيع اكتساب البيانات في أيام مختلفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح التدفق الخلوي جمع البيانات البرمجيات، انقر فوق &quot;إعداد و مراقبة الجودة&quot; زر، واختيار الصحيح كس &amp; T حبة الكثير عدد، تحميل الخرز، ثم انقر فوق زر &quot;ابدأ&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند الخلايا عن طريق التنصت بلطف أنبوب قبل تحميل العينات إلى الجهاز. افتح برنامج جمع البيانات وانقر على &quot;معاينة&quot;. عندما يكون معدل العتبة مستقرا، انقر على &quot;اكتساب&quot;. مراقبة مستوى العينة وانقر على &quot;إيقاف&quot; عند نفاد العينات. ملاحظة: الحصول على 10،000 الأحداث لكل عينة. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على 10،000 الأحداث، إنشاء سك-A و فسك-A مؤامرة نقطة في ورقة العمل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق زر &quot;بوابة المضلع&quot; ورسم بوابة (وهذا هو P1) على جميع الأحداث مع قيمة فسك-A&gt; 5 × 10 4 لاستبعاد الحطام. انقر فوق &quot;إنشاء نقطة مؤامرة&quot; زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، واختيار &quot;خصائص&quot; لفتح نافذة &quot;محرر المؤامرة&quot;، ثم اختر &quot;P1&quot;. انقر فوق فسك-A على المحور س من P1 نقطة مؤامرة، تغييره إلى CD3-BV510. ارسم &#39;&#39; بوابة مضلع &#39;&#39; لاختيار سكان CD3 + واسمها &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;إنشاء نقطة مؤامرة&quot; زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار &quot;خصائص&quot; لفتح نافذة &quot;محرر المؤامرة&quot;. انقر فوق فسك-A على المحور س من مؤامرة نقطة P2 وتغييره إلى 7-آد. رسم &quot;بوابة مضلع &#39;&#39; لمدة 7-آد - السكان واختيار &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 هنا هو CD3 +الخلايا الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;إنشاء نقطة مؤامرة&quot; زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار &quot;خصائص&quot; لفتح نافذة &quot;محرر المؤامرة&quot;. انقر فوق CD3-BV510 على المحور س و CD4-APCH7 على المحور ص من مؤامرة النقطة P3. رسم مستطيل البوابات على الجانبين العلوي والسفلي من الربع واختيار &#39;&#39; P4 &#39;&#39; و &#39;&#39; P5 &#39;&#39;، على التوالي. P4 يعيش CD3 + CD4 + و P5 يعيش CD3 + CD4 - خلايا T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق &quot;إنشاء نقطة مؤامرة&quot; زر لتوليد مؤامرة نقطة جديدة، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نقطة لطخة، اختيار &quot;خصائص&quot; لفتح نافذة &quot;محرر المؤامرة&quot;. انقر فوق CD45RO بي-Cy7 على المحور السيني و CCR7-بي على المحور الصادي لكل من P4 و P5 المؤامرات. رسم &#39;&#39; بوابة رباعية &#39;&#39; على هذه المؤامرة نقطة. ملاحظة: الجانب الأيسر العلوي، الجانب الأيمن العلوي، الجانب الأيسر السفلي والأرباع الجانب الأيسر السفلي هنا هي السذاجة، والذاكرة المركزية (T سم )، ه(T إم )، ذاكرة متباينة مؤقتا المستجيب (T إمرا ) الخلايا التائية، على التوالي. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+impression+cytology.">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li><li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+dry+eye.">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).</li><li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease.">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li><li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders.">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection.">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li><li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology.">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors:+review+article.">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface:+a+review.">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li><li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+(IC+score)+in+patients+with+dry+eye+syndrome.">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li><li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface.">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid.">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li><li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph.">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li><li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+ocular+bulbar+redness:+a+comparison+of+methods.">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li><li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ocular+Redness+Index:+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection.">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li><li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects.">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li><li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine.">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li><li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+tear+syndrome:+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations.">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li><li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8++T+cells.">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li><li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease.">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312 (2017).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

هذه هي تقنية سهلة وسريعة وأقل الغازية التي يمكن استخدامها في العيادات الخارجية لتنميط المناعة نسبيا نسبيا على النقيض من التقنيات التقليدية مثل كشط، مسحة، بيبتينغ أو ورقة تصفية ماصة 1 ، 2 . وهناك نوع آخر من هذه التقنية يستخدم بالفعل في إعدادات البحث 22 . التطبيق المستقبلي للمنهجية المقترحة هو لطبقية المرضى في التجارب السريرية مع أمراض العين، وخاصة تلك التي تتطلب المناعي. التحدي الرئيسي مع هذه التقنية هو عدد قليل نسبيا من الخلايا المناعية استرجاعها بعد جمع الانطباع وكشط. وتراوح العدد الكلي للخلايا CD3 + T المستعادة من أربعة انطباعات لكل فرد من 500 ~ 1000 خلية. تم غسل عينات العين قبل تحليل التدفق الخلوي لعدد ضئيل من المرات لتجنب المزيد من فقدان الخليةالصورة. الخطوات والتحديات الحاسمة التي لا تزال داخل البروتوكول هي جمع كفاءة عينات العين والكشط الصحيح من الغشاء لتحقيق أرقام الخلايا أعلى. ومع ذلك، فإن هذا القيد من غير المرجح أن التحيز تجاه أي النمط الظاهري المناعي محددة. كان استكشاف الأخطاء وإصلاحها أجريت هنا لتحقيق أقصى قدر من العائد من الخلايا للحد من عدد من الخطوات الغسيل بعد وقبل حضانة الأجسام المضادة. هناك قيود أخرى لاستخدام إيك. في المرضى الذين يعانون من سطح العين شديدة الكيراتين أو فيبروزد مثل في متلازمة ستيفن جونسون، قد يكون العائد الخلوي أقل من ذلك في هذه الدراسة. قد تتغير نسبة الخلايا المناعية إذا تم تخزين العينات بدلا من تحليلها في نفس اليوم. ومن الصعب التنبؤ بما إذا كانت أنواع معينة من الخلايا أكثر مقاومة للتخزين من غيرها. وقد ذكرت الدراسات السابقة مستويات مرتفعة من التعبير هلا-در في الخلايا الظهارية الملتحمة 23 ، لذلك سيكون من بينتقييم لتقييم العلاقة بين هلا-در ومستويات الخلايا المناعية المحددة. ويمكن أيضا أن ترتبط الخلايا المناعية مع مستوى التعبير من تشيموكينس. وينبغي معالجة هذه المسائل في الدراسات المقبلة.

تم تنفيذ علم الخلايا الانطباع (إيك) لأول مرة في عام 1977 من قبل تاتشر وآخرون 1 . استخدموا قرص انطباع بلاستيكي لجمع خلايا الملتحمة من المرضى بدلا من التقنيات الأخرى المتاحة في ذلك الوقت مثل كشط، مسحة أو بيبتينغ 1 . الأسلوب الحالي من إيك يستخدم ورقة تصفية ماصة 2 لطباعة بصمة والملتحمة الجفن وجمع الطبقة الأكثر سطحية من خلايا الملتحمة. هذه الخلايا، بعد أن وصلت إلى المرحلة النهائية من التمايز، وتسليط باستمرار في البكاء 3 . تم العثور على ثلاث مجموعات رئيسية من الخلايا في عينات إيك: الخلايا الظهارية 4 ، خلايا الكأس 3 ، 5 ، والأنسجة اللمفاوية المرتبطة المخاطية بمعنى ظهارة المرتبطة الخلايا T المستجيب أو الخلايا الجذعية 6 . خلايا سطح العين في إيك سامبليس يمكن تحليلها بواسطة المجهري، المناعية و النشاف و عكس ترانسكريبتاس البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (رت-ير) 7 . وقد استخدمت التدفق الخلوي في الآونة الأخيرة لتحليل الخلايا المناعية التي جمعتها كشط غشاء إيك 8 . ومن المثير للاهتمام، وقد استخدمت إيك 6 ، 9 لتقييم العديد من أمراض السطح العين بما في ذلك التهاب القرنية، التهاب الكبد القرني، ونقص فيتامين (أ)، الفقاع الفقري، مرض التأتبي، متفوقة التهاب القرنية القرنية، التهاب القرنية، التهاب الحلق القرنية الظهاري، والحؤول الحرشفية الظهارية. وقد استخدمت إيك أيضا لتقييم تأثير ارتداء العدسات اللاصقة، والكشف عن الميكروبات سطح العين، واختبار الكفاءة العلاجية والتسامح من التدخلات العلاجية في الدراسات الطولية 10 ، 11 ، 12 . ويدعم الجهاز الطبي (إيبريم) من نوع من بوليإيثرسولفون (بيس) 0.2 ميكرون غشاء، والتي تم التحقق من صحة سابقا لتقنية الخلايا الانطباع العين مع التدفق الخلوي (تدفق أوزيك) ويفتح فرصا لاستخدام العينات الطولية لرصد تطور المرض والاستجابة للعلاج (على سبيل المثال ، مفصلة تحليل الكريات البيض داخل الظهاري المعرفة بأنها علامات المرض المفترضة للتليف الملتحمة التدريجي في الغشاء المخاطي الفقاعي الفقاعي) 13 . استخدم الباحثون في وقت مبكر المرشحات بيس تعقيمها التي تتطلب الانطباع اليدوي. ونتيجة لذلك، كان العائد متغير ويعتمد على المستخدم. ميزة هذا الجهاز الطبي هو سهولة الاستخدام، ضغط موحد (باسكال أو N / م 2 )، وتمكين التكرار، استنساخه، واستعادة الخلوية متسقة. هذه التقنية مفيدة في عيادة للمرضى الخارجيين لأنها غير الجراحية، وسهلة لأداء وسريعة. هذا هو الجهاز الطبي من الفئة الأولى (العقيمة) وفقا للتوجيه 93/42 / سي، سي 0499 (سنش). انها تتطلب فقطتخدير موضعي أثناء العملية، مما يضمن الحفاظ على سلامة سطح العين. بعد إيك، يمكن معالجة الخلايا على الفور لتدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لفنيين غير العيون والممرضات لتدريبهم على عينة من سطح العين. على الرغم من تحسن إيك على تقنيات أخرى، لا تزال هناك العديد من التحديات. على سبيل المثال، قد يكون هناك اختلاف بسبب مجال أخذ العينات والاختلافات الإقليمية في الملتحمة العلوية اعتمادا على موقف إيك. مصدر آخر من الاختلاف يرجع إلى تطبيق كميات مختلفة من الضغط خلال إيك. وتشمل القضايا المنهجية الأخرى توحيد معالجة الخلايا: وهذه تنطوي على مدة وطريقة التثبيت، وظروف التخزين الممكنة، والتي قد تؤثر على استقرار المواد العينة. الهدف العام من هذه التقنية هو تطوير طريقة عزل عينات الانطباع العين ثار هو سهل الاستخدام، غير الغازية ويمكن تطبيقها على توصيف المناعي للعينات السريرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD3 BV510</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">563109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD4 APCH7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">641398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD45RO PECy7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">337168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">7-AAD solution</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">555816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CCR7 PE</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">552176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Pippetes</td>
			<td style="width:300px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Local Anaesthesia</td>
			<td style="width:300px;">Alcaine</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Equipments</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Keratograph 5M</td>
			<td>Oculus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slit lamp BioMicroscope</td>
			<td>Haag Streit</td>
			<td>BM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">EyePrim</td>
			<td>Opia Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Verse</td>
			<td style="width:300px;">BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Softwares</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GraphPad 6.0</td>
			<td style="width:300px;">Prism</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACSVerse analysis software</td>
			<td style="width:300px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

تقليديا، يتم دراسة علم الخلايا السطحية العين مع تقنيات مثل تكنولوجيا ملعقة وتقنية الفرشاة. المشكلة مع هذه التقنيات هي أنها قد تحفز آفات صادمة على سطح العين، والتي يمكن أن تتقدم إلى تندب، تشوه الجفن، نقص الخلايا الجذعية الليمفاوية، وفي بعض الحالات، يسبب عدم الراحة الكبيرة للموضوع. لتجنب هذه المشاكل السريرية، تم تطوير علم الخلايا الانطباع (إيك) لتشخيص مرض جفاف العين والأورام في وقت لاحق، ومرض التأتبي، التهاب القرنية والقرنية الربيعي والتهاب القرنية المخروطية سيكا. عادة، يقوم الأطباء بقطع أوراق الترشيح يدويا إلى الأشكال المطلوبة وتطبيقها على سطح العين. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ إيك باستخدام جهاز طبي متاح تجاريا. يتم شرح هذه التقنية هنا تليها إمونوفينوتيبينغ عن طريق التدفق الخلوي. تتطلب هذه التقنية معالجة يدوية أقل وتسبب إصابة أقل في سطح العين.

إيك من قبل هذا الجهاز السريري سمح لنا لعزل الخلايا المناعية سطح العين مع الحفاظ على سطح العين سليمة. ويصف الشكل 1 كيفية تنفيذ إيك. تم وضع علامة على المواقع المختلفة للعين من حيث تم جمع العينات. ويبين الشكل 2 نتيجة ممثل التدفق الخلوي التي تم جمعها من 10 الضوابط الصحية. للتباعد، واستخدام سك و 7-آد للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. 7-آد - يتم تحديد الخلايا كخلايا حية. وتتميز هذه الخلايا الحية أيضا من قبل CD3 + و CD4 + علامات. وعلاوة على ذلك، تم وصف كل من CD4 + و CD4 - السكان كما مزيد من السذاجة، T إم ، T سم و T إمرا مع علامات CCR7 و CD45RO. بين الخلايا CD3 + T، الخلايا المستجيب الذاكرة T تهيمن على سطح العين البشرية. في وقت سابق هزبيريمنتس، وقد تبين أيضا أن خلايا الذاكرة CD8 + هي السكان الرئيسيين في الخلايا التائية الظهارية الملتحمة بين الأفراد الأصحاء 20 . ويبين الشكل 3 أن CD4 + و CD8 + المستجيب خلايا T الذاكرة (T إم و T إمرا ) هي المجموعة الفرعية الرئيسية في سطح العين البشرية في 10 ضوابط صحية درس. يتم إخطار كل السكان المذكورة في الشكل مع النمط الظاهري علامة وأسماء (نايف، T سم ، T إم ، T إمرا ). الأرقام باللون الأحمر تدل على النسبة المئوية للسكان. يتم تمثيل البيانات في هذا الرقم كما يعني ± سيم <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> الشكل 1: جمع عينات إيك من سطح العين من قبل جهاز علم الانطباع. تم جمع العينات من اللمبة الزمنيةأر كما هو مبين. <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> الشكل 2: نقطة مؤامرة الرسم البياني باستخدام التدفق الخلوي. ليف 7-آد - تم اختيار الخلايا. وكانت الخلايا CD3 + أول بوابات، وبعد ذلك كانت هذه البوابة السكان إلى CD4 + و CD4 - مجموعات فرعية. تم تحديد نسب السذاجة (CCR7 + CD45RO - ) والذاكرة المركزية (CCR7 + CD45RO + ) والذاكرة المستجيبة (CCR7 - CD45RO + ؛ CCR7 - CD45RO - ) بمساعدة علامات CCR7 و CD45RO. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> Fإيغور 3: الخلايا المناعية أنواع فرعية في CD4 + و CD8 + خلايا T من صحة الإنسان سطح العين. توزيع الملتحمة CD4 + و CD8 + السذاجة، والذاكرة المركزية (T سم )، والذاكرة المستجيب (T إم و T إمرا ) مجموعات فرعية في ضوابط الإنسان صحية؛ كل نقطة بيانات تمثل متوسط ​​فردي منفصل ± سيم يظهر. وتظهر النسبة المئوية للسكان على أنها حمراء تحت اسم كل من السكان. وتبلغ النسبة الإجمالية للسكان 98 في المائة، لأن سكان CD4 + T إمرا لم يدرجوا في مخطط الانتثار المذكور (المعدل من بوس وآخرون 21 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

يتكون سطح العين الطبيعي المكشوف من القرنية والملتحمة. الخلايا الظهارية، وخلايا الكأس والخلايا المناعية موجودة في الملتحمة. هنا، يتم وصف غير الغازية، وتقنية الخلايا الانطباع باستخدام جهاز علم الانطباع والتدفق الخلوي لتحليل الخلايا المناعية في الملتحمة.

وهناك طريقة غير الغازية لعزل والنمط الظاهري الخلايا من الملتحمة

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  Nanyang Technological University.  يتكون سطح العين الطبيعي المكشوف من القرنية والملتحمة. الخلايا الظهارية، وخلايا الكأس والخلايا المناعية موجودة في الملتحمة. هنا، يتم وصف غير الغازية، وتقنية الخلايا الانطباع باستخدام جهاز علم الانطباع والتدفق الخلوي لتحليل الخلايا المنا...

Video: A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

غير الغازية التصوير من المبيضات المنتشر في يرقات اسماك الزرد

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

التيموس كاملة في الجرذان الكبار مع غير الغازية التنبيب الرغامي

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...