Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá.

1. Obtendo Genes de Interesse <ol><li> Desenhe genes sintéticos. <ol><li> Otimize uma sequência de genes para a expressão de E. coli . </li><li> Remova todos os sites de restrição problemáticos da sequência (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI). </li><li> Incorporar sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 &#39;-NdeI e um site 3&#39;-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação 5 &#39;ou 3&#39; para a detecção Western Blot. </li><li> Comercialmente, ordene o gene projetado. </li><li> Ou o clone clone o gene em um vetor contundente usando um kit de clonagem contundente, de acordo com as instruções do fabricante; Projete iniciadores para amplificar o gene (então, avance para o passo 1.2.2); Ou adicionar extremidades 5 &#39;e 3&#39; adicionais para a clonagem direta em um plasmídeo pMGX e passar para o Passo 2. Aqui, thOs resultados representativos são da clonagem brusca dos genes de interesse. </li></ol></li><li> Amplificar o gene desejado (a partir de um gene sintético projetado e otimizado ou de DNA modelo contendo o gene desejado) 15 . <ol><li> Desenhe primers com sites de restrição para clonagem; É recomendado um site 5 &#39;-NdeI e um site 3&#39;-EcoRI. Outros locais podem ser utilizados, se necessário; Referem-se à região de multiclonagem do plasmídeo selecionado ( Figura S1- S4 ). Se desejado, inclua uma etiqueta de codificação de 5 &#39;ou 3&#39; para a detecção de Western Blot. </li><li> PCR amplifica o gene desejado 15 . </li><li> Analisar o PCR por eletroforese em gel de agarose 16 . </li><li> Se houver amplificação inespecífica, limpe o gene amplificado por extração de gel. Caso contrário, use um kit de limpeza de enzimas. </li><li> Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro, verificando o absorventeE a 260 nm; Em branco com tampão de eluição 17 . </li></ol></li></ol> 2. Clonagem de Genes de Interesse em um Vector de Sistema de Expressão Multigênica, pMGX 18 <ol><li> Restrição digerir o gene obtido de interesse e o vetor desejado, pMGX, com NdeI e EcoRI. NOTA: Se uma grande quantidade de plasmídeos recircularizados forem obtidos, permita que a reação de NdeI prossiga por 1 h antes de adicionar EcoRI. <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μL de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado. </li><li> Para um resumo NdeI e EcoRI, use o tampão EcoRI e primeiro adicione a endonuclease NdeI. Digerir por 1 h a 37 ° C. Em seguida, adicione a endonuclease EcoRI e permita que o resumo continue por uma hora adicional. NdeI é sensível às clivagens próximas ao fim do DNA, então a digestão inicial por EcoRI pode prevenir a digestão efetiva pelo NdeI. </li></ol></li><li> ElectrOfora a digestão de restrição em gel de agarose (para um gene de 1 kb, use um gel de agarose a 0,7% a 110 V durante 55 min, para selecionar a porcentagem de gel de agarose para diferentes tamanhos de genes, consulte a referência 16 . </li><li> Inserção de impostos e bandas de vetores usando um bisturi limpo ou uma lâmina de barbear e coloque o segmento de gel excisado em um tubo de 1,5 mL. </li><li> Extrair o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Ligar o gene de interesse para o vector pMGX utilizando uma proporção de inserção para vector de 3: 1; Configurar uma ligação negativa de pMGX digerido sem a inserção. <ol><li> Configure uma reação de ligação de 20 μL contendo 1 μL de T4 DNA ligase, 0,15-0,5 μg de DNA de vetor (~ 5 μL) e uma quantidade apropriada de inserção com base em uma proporção de inserção a vetor de 3: 1 e do tamanho de O gene que está sendo inserido; Os backbones pMGX estão entre 5,312 e 5,504 pb de tamanho. Inclua uma reação de controle negativo que contenha tudoT o gene que está sendo inserido. Certifique-se de que a quantidade de DNA de vetor é equivalente na ligação de controle negativo e as reações de ligação de inserção vetorial mais. </li></ol></li><li> Reagir as reacções de ligação em células de E. coli quimicamente competentes XL1-Blue e plasmídeos ligados pMGX- yfg1 (contendo o gene do interesse 1), pMGX- yfg2 (contendo o gene do interesse 2) ... pMGX- yfgn (contendo o gene do interesse n). Use técnica asséptica (dentro de um gabinete de biossegurança ou sob uma chama). <ol><li> Destilar alíquotas de 100 μL de XL1-Blue E. coli quimicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 5 μL das reações de ligação. Incube durante 30 minutos no gelo. </li><li> Choque de calor das células por 45 s em um banho de água a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar em gelo durante 2 min. </li><li> Agite as células a 37 ° C, 220 rpm durante 1 h e, em seguida, aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo uma aprovaçãoMarcador selecionável adequado (ampicilina ou kanamicina). </li></ol></li><li> Teste os clones para transformantes positivos. <ol><li> Compare as contagens de colônias nas placas de controle negativo e ligadura. É desejada uma relação de contagem de colônias maior que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 2.1 e reveja a nota. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) de cada reação de ligação dos diferentes genes inseridos para rastreio (1 n) e inocule um LB de 4 mL e uma cultura durante a noite de antibiótico apropriada / colônia individual. Cultive culturas durante a noite com agitação a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar o DNA do plasmídeo usando um kit de isolamento do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Configure uma reação de 20 μL NdeI + EcoRI digest contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de cada enzima com 2 μL do tampão 10x apropriado. NaoÉ caso, adicione NdeI e EcoRI ao mesmo tempo em que o gene de interesse estará entre os sites de restrição. É recomendado um controle negativo com o vetor pMGX vazio. Digerir durante 2 h a 37 ° C em banho-maria. </li></ol></li></ol> 3. Inserindo o gene 2 no vetor pMGX contendo o gene 1, pMGX- yfg1 <ol><li> Restrição digerir pMGX- yfg1 com AvrII e tratar com fosfatase intestinal de bezerro (CIP). <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA vetorial (~ 5-10 μL de DNA isolado) e 1 μL de AvrII com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 1,5 h a 37 ° C e depois adicionar 1,5 μL de CIP. Deixe-o a 37 ° C durante 30 minutos adicionais. </li></ol></li><li> Restriction digest pMGX- yfg2 com AvrII e XbaI para libertar o gene de interesse. <ol><li> Use uma reação de digestão de 40 μL contendo 0,5-1,5 μg de DNA e 1 μ; L de cada enzima com 4 μL do tampão 10x apropriado. Digerir por 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> A restrição de eletroforese digere em um percentual apropriado (0,7%) de gel de agarose e adiciona as inserções e bandas de vetores usando um bisturi limpo / lâmina de barbear (consulte as Etapas 2.2-2.3). </li><li> Extraia o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com o protocolo do fabricante e quantifica o DNA 17 . </li><li> Ligate o gene 2 em pMGX- yfg1 usando uma proporção de inserção / vetor 3: 1. Configure uma ligação negativa de pMGX- yfg1 digerido sem a inserção adicional. Configure como acima no Passo 2.5. </li><li> Transforme 5 μL das reações de ligação em células XL1-Blue quimicamente competentes de E. coli , plasmídeos ligados pMGX- yfg1,2 (contendo o gene de interesse 1 e 2) e controle negativo de pMGX- yfg1 , como visto no Passo 2.6. </li><li> Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Uma razão de contagem de colônias gÉ desejável reater do que 1: 2. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte para o Passo 3.1 e reveja o tratamento com CIP. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual e cresça durante a noite a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar DNA de plasmídeo usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante e quantificar o DNA 17 . </li><li> Tira a inserção efetiva do segundo gene, realizando uma digestão de restrição de pMGX- yfg1,2 com EcoRI. <ol><li> Use uma reação de 20 μL de digestão contendo 150-500 ng de DNA e 1 μL de enzima EcoRI com 2 μL de tampão EcoRI 10x. Digerir por 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; Procure uma banda que correspondaS ao tamanho do gene 2 (ver passo 2.2). Um gene pode inserir no vetor na orientação indesejada e reversa. </li></ol> 4. Adicionando um terceiro gene ao vetor pMGX contendo os genes 1 e 2, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Restrição digerir pMGX- yfg1,2 com AvrII e tratar com CIP, como visto no Passo 3.1. </li><li> Restriction digest pMGX- yfg3 com AvrII e XbaI, conforme observado na Etapa 3.2. </li><li> Eletroforese as digestões de restrição em uma porcentagem apropriada de gel de agarose e inserção de impostos especiais de consumo e bandas de vetores usando uma bisturí limpa / lâmina de barbear; Consulte os Passos 2.2-2.3. </li><li> Extraia o DNA do gel de agarose usando um kit de extração de gel e quantifica o DNA 17 . </li><li> O gene de ligato 3 em pMGX- yfg1,2 utilizando uma relação de inserção a vector de 3: 1 e estabeleceu uma ligação livre de pMGX- yfg1,2 digerido sem inserção adicional, como se observa no Passo 3.5. </li><li> Transforme 5 μL das reações de ligação em XLCélulas de E. coli quimicamente competentes de 1-azul, plasmídeo ligado pMGX- yfg1,2,3 (contendo genes de interesse 1, 2 e 3) e controle negativo de pMGX- yfg1,2 , como visto na Etapa 2.6. </li><li> Compare a contagem de colônias nas placas de controle e ligadura negativas. Se houver um grande número de colônias na placa de controle negativo, volte ao Passo 4.1 e reveja o tratamento com CIP. </li><li> Selecione 4-8 colônias individuais (dependendo do controle negativo: relação de ligação) da reação de ligação e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado por colônia individual; Crescer durante a noite a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Isolar o DNA plasmídico usando um kit de isolamento de DNA plasmídico de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Tira a inserção efetiva do terceiro gene executando uma síntese de restrição de pMGX- yfg1,2,3 com EcoRI, conforme observado na Etapa 3.10. </li><li> Eletroforese a síntese de restrição em uma porcentagem adequada de gel de agarose; VejaPara bandas que correspondem aos tamanhos do gene 2 e do gene 3 (ver passo 2.2). Nota: o gene 3 pode inserir no vetor na orientação não desejada, invertida. Se os genes 2 e 3 forem do mesmo tamanho, outro local de restrição de restrição apropriado deve ser selecionado para triagem. NOTA: Repita conforme necessário para cada novo gene. </li></ol> 5. Produção de proteínas de interesse usando um sistema de expressão multigênica e avaliação da produção por Western Blot <ol><li> Transforme o clone positivo contendo todos os genes de interesse em quimicamente competente, produção de proteína E. coli , como BL21- (λDE3). <ol><li> Descongelar alíquotas de 100 μL de E. coli BL21- (λDE3) químicamente competente em gelo durante 5 min e depois adicionar 1 μL do DNA plasmídico clonado positivo; Incubar durante 30 min no gelo. </li><li> Choque térmico das células durante 45 s em banho-maria mantido a 42 ° C e depois adicione 200 μL de LB frio. Incubar no gelo durante 2 min. </li><li>Agite as células a 37 ° C e 220 rpm durante 1 h e depois aplique a placa 100 μL sobre uma placa de LB-agar contendo o marcador selecionável apropriado (ampicilina ou kanamicina). </li></ol></li><li> Expresse a proteína pela indução de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). <ol><li> Selecione uma colônia isolada da placa de transformação B21- (λDE3) e inocule 4 mL de LB mais o antibiótico apropriado; Cresça durante a noite, agitando a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Inocular 100 mL de LB mais a cultura de antibiótico apropriada utilizando 1 mL de cultura durante a noite. </li><li> Crescer a 37 ° C com agitação a 220 rpm para uma DO 600 de 0,6. </li><li> Induzir a cultura com 100 μM de IPTG e crescer durante 15 h a 25 ° C e 220 rpm. </li><li> Remova 1 mL da cultura e centrifugá-la a 13.000 xg durante 1 min; Descarte o sobrenadante. </li></ol></li><li> Lyse as células usando solução de lise de acordo com as instruções do fabricanteE preforme uma mancha de Western do lisado celular solúvel para determinar se todas as proteínas foram produzidas com sucesso 19 . </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

A co-expressão de múltiplos genes é cada vez mais essencial, particularmente na caracterização e reconstituição das vias metabólicas complexas multigênicas 3 , 4 , 5 . O sistema pMGX faz co-expressão multigene na rotina 6 , 7 , 8 de E. coli e acessível a diversos pesquisadores. Neste estudo, mostraram-se cinco proteínas de interesse que foram produzidas simultaneamente a partir de um único sistema plasmídico usando pMGX-A. Muitos sistemas de coexpressão atualmente disponíveis apenas permitem a inserção de dois genes, gerando plasmídeos bicistrônicos, como os vetores 12 do pET Duet. Se alguém requer a adição de mais genes, são necessários múltiplos vetores bicistrônicos com diferentes marcadores selecionáveis. Em contraste com outros sistemas de expressão multigene, o sistema pMGX permite a clonagem fácilDe múltiplos genes em um plasmídeo, com a capacidade de reutilizar os locais de restrição sem a necessidade de diferentes plasmídeos doadores ou para a remoção de múltiplos locais de enzimas de restrição dos genes 13 , 14 . Os passos críticos neste protocolo incluem o desenho do gene, a prevenção da recircularização de fundo de vetores pMGX digeridos individualmente e as telas dos vetores policistrônicos para a orientação correta do gene inserido. Ao planejar a estratégia de clonagem para construir um sistema policistrônico, é essencial garantir que os genes de interesse não contenham sites de restrição necessários para a clonagem a jusante. Em particular, estes incluem XbaI e AvrII, que são necessários para a inserção do segundo e subsequente genes no vector pMGX contendo o primeiro gene de interesse (Passos 3 e 4). Além disso, é essencial eliminar locais de restrição que serão utilizados para a clonagem inicial do gInteresse em pMGX (Passo 2). Tipicamente, estes incluem NdeI ou NheI na extremidade 5 &#39;do gene e BamHI ou EcoRI na extremidade 3&#39; do gene, embora outros locais de restrição também possam ser utilizados para esta etapa, se necessário. A eliminação de locais de restrição extra e indesejáveis ​​pode ser realizada facilmente no estágio de síntese de genes ou, no caso de genes clonados de outras fontes, por substituições sinônimas de nucleotídeos via mutagênese dirigida ao local 20 . A adição de subsequentes genes de interesse em pMGX contendo o primeiro gene de interesse requer a linearização de pMGX- yfg1 com AvrII (Passo 3.1, note que também pode ser linearizado com XbaI). Este vetor linearizado se religará rapidamente durante a inserção do segundo gene de interesse (Passo 3.5), levando a um número extremamente elevado de clones de fundo. Para evitar isso, é essencial tratar o vetor linearizado com uma fosfatase para desfosforilar o 5 °2; Extremidades do vetor linearizado. Normalmente, o CIP é usado, embora outros estejam disponíveis. A otimização de ambas as unidades de fosfatase e o tempo de incubação podem ser necessárias para otimizar as ligaduras dos subseqüentes genes de interesse no vetor linearizado. Por último, ao gerar um sistema policistrônico, o gene de interesse é inicialmente excisado pela digestão com XbaI e AvrII, gerando extremidades coesivas complementares nas extremidades 5 &#39;e 3&#39; do gene (Etapas 3.2 e 4.2). Esta inserção pode ser ligada no vetor linearizado na direção direta ou reversa. Como todas as extremidades coesivas são idênticas, nenhuma direccionalidade é aplicada através do recozimento complementar das extremidades coesivas. É, portanto, necessário exibir os clones resultantes para a direção de inserção correta do gene de interesse. Isto pode ser feito facilmente através da triagem de clones com um dos locais de restrição utilizados para clonar o gene original de interesse em pMGX (Passo 2). Tipicamente,EcoRI é usado, pois o site de restrição está na extremidade 3 &#39;do gene e, portanto, é apropriado selecionar a direção, como mostrado na Figura 6 . Na maioria dos casos, 50% dos clones contendo o gene de interesse possuem o gene na orientação correta e 50% têm o gene na orientação oposta. Infrequentemente (~ 10% das ligaduras), todos os clones de uma ligadura particular podem ter o gene de interesse inserido em apenas uma direção. Este resultado parece ser dependente da sequência, uma vez que é altamente reprodutível nestas instâncias específicas. Se isso ocorrer, e o gene de interesse está inserindo continuamente na orientação inversa, o vetor desejado geralmente pode ser acessado alternando a direção da clonagem. Por exemplo, em vez de clonar yfg2 no site AvrII de pMGX- yfg1 , yfg1 pode ser clonado no site XbaI de pMGX- yfg2 . Observe que isso dá o vetor final idênticosistema. Esta flexibilidade adicional que permite o acesso ao mesmo sistema a partir de diferentes estratégias de clonagem é altamente vantajosa. Uma limitação importante desta metodologia é que as proteínas codificadas na extremidade 3 &#39;do transcrito policórónico são tipicamente expressas em níveis inferiores às proteínas codificadas na extremidade 5&#39; da transcrição, e esse efeito é mais pronunciado quanto mais a transcrição for . Isso significa que mudar a ordem dos genes de interesse no operão sintético pode afetar os níveis de expressão relativa das proteínas que codificam, proporcionando um mecanismo para ajustar os níveis de expressão relativa. Em resumo, o sistema pMGX fornece um método confiável para a co-expressão de múltiplas proteínas a partir de um único plasmídeo em E. coli , que pode ser usado para uma variedade de aplicações de biologia sintética e para a caracterização da via bioquímica.

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial, particularmente em aplicações de biologia sintética, onde vários módulos funcionais devem ser expressos 1 ; No estudo dos complexos proteína-proteína, onde a expressão e função muitas vezes requerem co-expressão 2 , 3 ; E na caracterização e aproveitamento de caminhos biossintéticos, onde cada gene na via deve ser expresso 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Vários sistemas foram desenvolvidos para coexpressão, particularmente no organismo hospedeiro Escherichia coli , o cavalo de trabalho para a expressão de proteína recombinante em laboratório 9 . Por exemplo, múltiplos plasmídeos com diferentes marcadores selecionáveis ​​podem ser usados ​​para expressar proteínas individuais usando uma riqueza de diferentes ex<html> Vetores de pressão 10 , 11 . Os sistemas plasmídicos únicos para expressão múltipla de proteínas utilizaram múltiplos promotores para controlar a expressão de cada gene 10 , 12 ; Operões sintéticos, onde múltiplos genes são codificados em uma única transcrição 2 , 13 ; Ou, em alguns casos, um único gene que codifica um polipéptido que é processado de forma proteolítica, produzindo as proteínas desejadas de interesse 14 . <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Figura 1: fluxo de trabalho pMGX que mostra a construção de um vetor policristão. O sistema pMGX fornece uma estratégia flexível e fácil de usar para a construção de operões sintéticos sob o controle de um promotor T7 indutível.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Neste manuscrito, é descrito o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigene sob o controle de uma ARN polimerase T7 indutível ( Figura 1 ). Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. É baseado em um sistema de plasmídeo, originalmente chamado pKH22, que foi utilizado com sucesso para várias aplicações diferentes 6 , 7 , 8 . Aqui, este conjunto de plasmídeo é expandido para incluir quatro vetores relacionados: pMGX-A, um vetor de expressão que não possui quaisquer marcas C ou N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-hisA, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à ampicilina; PMGX-K, um vetor de expressão lObtendo quaisquer tags C ou N-terminal e com o marcador de resistência à kanamicina; E pMGX-hisK, um vetor de expressão que codifica uma etiqueta de hexahistidina N-terminal e com o marcador de resistência à canamicina. Neste estudo, o método para a geração de um vetor policristão contendo cinco genes usando o sistema pMGX, especificamente pMGX-A, é demonstrado juntamente com a produção bem-sucedida de cada proteína individual em Escherichia coli .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Enzymes</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AvrII</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NdeI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XbaI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;">600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Reagents</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 kb DNA ladder</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">456-8095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 x TAE</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1332-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>PI78243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Supplied with polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D2500-02</td>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td>
			<td style="width:312px;">GenScript</td>
			<td style="width:139px;">A00612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td style="width:312px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:139px;">WBKLS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A411-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteurized instant skim milk powder</td>
			<td style="width:312px;">Local grocery store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>No-name grocery store milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:312px;">Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td style="width:139px;">10600007</td>
			<td>Membrane PT 0.45 &#181;m 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D6943-02</td>
			<td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMGX</td>
			<td style="width:312px;">Boddy Lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td style="width:312px;">Intergrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design primers as needed for desired gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic Gene</td>
			<td style="width:312px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design and optimize as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick Blot Filter Paper</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base</td>
			<td style="width:312px;">BioShop</td>
			<td style="width:139px;">TRS001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL1-Blue chemically competent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Equipment</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioSpectrometer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">RK-83600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel box - PAGE</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1658005</td>
			<td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Imager</td>
			<td style="width:312px;">Alpha Innotech</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>AlphaImager EC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-oven</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11-690-650D</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">SHKE6000-7</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personna Razors</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S04615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power Pack</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">S65533Q</td>
			<td>FB300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator</td>
			<td style="width:312px;">VWR International</td>
			<td style="width:139px;">M-10E,6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocylcer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td>Z316091</td>
			<td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Face-Shield</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;">18-999-4542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">15-460-2SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Transfer Apparatus</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703935</td>
			<td>Mini-Trans Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

A co-expressão de múltiplas proteínas é cada vez mais essencial para a biologia sintética, estudando complexos proteína-proteína e caracterizando e aproveitando os caminhos biossintéticos. Neste manuscrito, descreve-se o uso de um sistema altamente eficaz para a construção de operões sintéticos multigenes sob o controle de uma polimerase de ARN T7 induzível. Este sistema permite que muitos genes sejam expressos simultaneamente a partir de um plasmídeo. Aqui, um conjunto de quatro vetores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, com o marcador selecionável por resistência à ampicilina ou kanamicina (A e K) e possuindo ou não uma hexahistidina N-terminal A tag (his) é divulgada. São fornecidos protocolos detalhados para a construção de operões sintéticos usando este sistema de vetores juntamente com os dados correspondentes, mostrando que um sistema baseado em pMGX contendo cinco genes pode ser facilmente construído e usado para produzir todas as cinco proteínas codificadas em Escherichia coli . Este sistemaEm e protocolo permite que os pesquisadores rotineiramente expressam módulos complexos de múltiplos componentes e caminhos em E. coli .

Neste estudo, o objetivo era co-expressar cinco proteínas de um único plasmídeo. Os fragmentos de gene sintético otimizados com cinco codões que codificam as marcas de hexahistidina N- ou C-terminal foram adquiridos comercialmente. Os genes sintéticos foram amplificados por PCR e clonados individualmente em um vetor PCR-blunt e sequenciados. Para gerar o plasmídeo policórónico, os cinco genes de interesse foram primeiro clonados num plasmídeo pMGX adequado, pMGX-A. A Figura 2 mostra PCRBlunt- yfg1 e PCRBlunt- yfg2 além de pMGX-A digerido com NdeI + EcoRI (ver Etapa 2). Para clonar os dois primeiros genes em pMGX-A, o plasmídeo foi digerido com NdeI + EcoRI ( Figura 2 ). Após a clonagem dos genes de interesse em pMGX-A, os plasmídeos recém construídos, designados como pMGX- yfg1 e pMGX- yfg2 , foram digeridos com AvrII + XbaI para confirmar que foram obtidos clones bem-sucedidos, comoMostrado nas bandas de 1,1 kb e 1,3 kb obtidas na Figura 3 . <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig2.jpg" /> Figura 2: Clonagem de plasmídeos pMGX. Os resultados esperados de PCR plasmídeos contundentes contendo yfg1 e yfg2 após digestão com NdeI + EcoRI são mostrados em um gel de agarose 0,7% (110 V, 55 min). Pista 1, escala de DNA de 1 kb; Pista 2, PCRBlunt- yfg1 ; Pista 3, PCRBlunt- yfg2 ; Lane 4, controle pMGX-A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig3.jpg" /> Figura 3: rastreio de pMGX- yfg1 e pMGX- yfg2. O gel de agarose a 0,7% (110 V, 55 min) mostra<html> As duas bandas que são geradas por pMGX- yfg1 e pMGX- yfg2 após a digestão com AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA ladder; Pista 2, pMGX- yfg1 ; Pista 3, pMGX- yfg2 ; Lane 4, controle pMGX-A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Com ambos os genes no vector pMGX apropriado, construiu-se o plasmídeo policistrônico. Para gerar o plasmídeo pMGX- yfg1,2 , pMGX- yfg1 foi digerido com AvrII, como mostrado na Figura 4 . PMGX- yfg2 foi digerido com AvrII + XbaI e o gene de 1,3 kb que contém o fragmento foi ligado ao sítio AvrII de pMGX- yfg1 linearizado, gerando pMGX- yfg1,2 . A digestão de pMGX- yfg1,2 com EcoRI confirmou a clonagem bem sucedida do plasmídeo desejado e é mostrada em&gt; Figura 5. <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig4.jpg" /> Figura 4: Geração do plasmídeo bicistrônico pMGX-yfg1,2. Os resultados de eletroforese em gel de agarose a 0,7% (110 V, 55 min) de pMGX- yfg1 digeridos com AvrII e pMGX- yfg2 digeridos com AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA ladder; Pista 2, pMGX- yfg1 digerido com AvrII; Pista 3, pMGX- yfg2 digerido com AvrII + XbaI; Lane 4, controle pMGX-A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig5.jpg" /> Figura 5: rastreio de clones pMGX- yfg1,2 . O 0,7% de gel de agarose resultante (110 V, 55 min) de pMGX- yfSão mostrados clones de g1,2 digeridos com EcoRI. Os clones bem sucedidos gerarão duas bandas, uma para o gene efg2 inserido e outra correspondente ao backbone + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Pista 1, escala de DNA de 1 kb; Pista 2, pMGX- yfg1,2 digerido com EcoRI, clone 1; Pista 3, pMGX- yfg1,2 digerido com EcoRI, clone 2; Lane 4, controle pMGX-A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Ao gerar um plasmídeo policistrônico contendo dois ou mais genes, pode-se encontrar uma inserção reversa indesejável do gene clonado no site AvrII. A Figura 6 é um gel que destaca a diferença entre os resultados de um plasmídeo digerido com um gene inserido na orientação correta em oposição a um gene inserido na orientação invertida. Se o gene forLigada e clonada na orientação indesejada, o sítio EcoRI no final do gene será inserido ao lado do site EcoRI do gene anterior. Isso produziria um tamanho de fragmento que é praticamente indetectável por eletroforese em gel de DNA (menos de 50 pb). Além disso, o último gene inserido apareceria na espinha dorsal, o que é facilmente identificável devido ao tamanho da espinha dorsal ser maior do que o esperado. A diferença no tamanho da espinha dorsal do tamanho esperado indicará o tamanho do último gene inserido. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig6.jpg" /> Figura 6: rastreio de clones pMGX- yfg1-5 . É mostrado um gel de agarose a 1,3% (110 V, 65 min) que representa os resultados de pMGX- yfg1-5 digerido com EcoRI. Os clones bem-sucedidos (pista 2) gerarão uma faixa correspondente ao último gene inserido ( yfg neste caso, 1,1 kb). LanE 1, escada de DNA de 1 kb; Pista 2, clone positivo de pMGX- yfg1-5, digerido com EcoRI; Pista 3, clone negativo de pMGX- yfg1-5, digerido com EcoRI; Lane 4, controle pMGX- yfg1-4 . <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Para completar o vector de expressão policristonal de cinco genes, os três genes restantes foram clonados um após o outro em pMGX- yfg1,2 para gerar pMGX- yfg1-5 (ver Etapa 5). Este plasmídeo foi então transformado em BL21- (λDE3), e a expressão das proteínas foi induzida numa cultura de fase de log intermediário pela adição de IPTG. A Figura 7 é uma transferência Western de lisados ​​celulares, confirmando que todas as cinco proteínas de um único plasmídeo contendo vários genes num único operão podem ser expressas. A expressão de pMGX- yfg1 (contendo 1 gene),PMGX- yfg1,2 (contendo 2 genes), e pMGX- yfg1-5 (contendo 5 genes) são mostrados. <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig7.jpg" /> Figura 7: Análise de transferência de Western da expressão multi-gene usando o sistema pMGX. A incorporação de marcas de hexahistidina N- ou C-terminal permitiu a detecção de Western blot da expressão da proteína. As amostras foram separadas em géis de acrilamida sem deformação a 4-20% pré-moldados (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm), e depois uma transferência (40 V, 90 min) sobre uma membrana de nitrocelulose (0,45 μm, 10 cm x 7 cm). O anticorpo monoclonal anti-His conjugado com HRP, que não requer um anticorpo secundário, foi utilizado. Os tampões de bloqueio, transferência e diluição de anticorpos foram preparados conforme recomendado pelo fabricante do anticorpo. A detecção foi realizada com o substrato Western Chemiluminescent HRP seguindo o ins da fabricanteTrucções. A membrana resultante foi visualizada usando uma imagem sem filtro. Pista 1, padrão de duas cores transferido para a membrana (não quimioluminiscente); Pista 2, His6pMGX- yfg1 ; Pista 3, His6pMGX- yfg1,2 ; Lane 4, His6pMGX- yfg1-5. Nota: A proteína produzida por yfg5 é do mesmo tamanho que a proteína produzida por yfg1 (ambos são 36 kDa) e não podem ser separados no gel. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Figuras suplementares: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/supplemental_figure_S1_jove.pdf">clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX.

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K visualizações.  University of Ottawa.  Este estudo descreve métodos para a co-expressão mediada por T7 de múltiplos genes de um único plasmídeo em Escherichia coli usando o sistema de plasmídeo pMGX. 

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genética

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

Guia de Clonagem de RNA para Sistemas de Mamíferos por CRISPR

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...