עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה.

1. קבלת גנים של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב גנים סינתטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייעל רצף גנים עבור ביטוי E. coli . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אתרי ההגבלות הבעייתיים מהרצף (AvrII, NdeI, EcoRI ו- XbaI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5&#39;-NdeI ואתר 3&#39;-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד בגודל 5 או 3 עבור זיהוי כתמים מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מסחרי להזמין את הגן המעוצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או בוטה לשכפל את הגן לתוך וקטור קהה באמצעות ערכת שיבוט קהה, בהתאם להוראות היצרן; פריימרים בעיצוב כדי להגביר את הגן (ולאחר מכן להמשיך לשלב 1.2.2); או להוסיף 5 &#39;ו 3&#39; מסתיים נוספים שיבוט ישיר לתוך pMGX פלסמיד ולהמשיך לשלב 2. כאן,התוצאות הייצוגיות הן מתוך שיבוט קהה של הגנים המעניינים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הגן הרצוי (מגן מתוכנן וממוטב של סינתטי או מדגם DNA המכיל את הגן הרצוי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב primers עם אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5&#39;-NdeI ואתר 3&#39;-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד של 5 או 3 לזיהוי כתמים מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הגן הרצוי 15 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח PCR על ידי agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה 16 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש הגברה unspecification, לנקות את הגן מוגבר על ידי מיצוי ג &#39;ל. אם לא, השתמש ערכת אנזים ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר ידי בדיקת absorbancE ב 260 ננומטר; ריק עם חיץ elution 17 . </li></ol></li></ol> 2. שיבוט גנים של עניין לתוך מערכת ביטוי multigene וקטור, pMGX 18 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת digest הגן שהושג של עניין ואת וקטור הרצוי, pMGX, עם NdeI ו EcoRI. הערה: אם כמות גדולה של פלסמידים recircularized מתקבלים, לאפשר תגובה NdeI להמשיך במשך שעה 1 לפני הוספת EcoRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של ה- DNA ו 1 μL של אנזים עם 4 μL של חיץ 10x המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור Ndei ו- EcoRI digest, השתמש במאגר EcoRI והוסף תחילה endonuclease NDEI. תקציר עבור 1 שעה ב 37 ° C. לאחר מכן להוסיף endrouclease EcoRI, ולאפשר digest להמשיך במשך שעה נוספת. NdeI הוא רגיש מחשופים קרוב לסוף הדנ&quot;א, ולכן העיכול הראשוני על ידי EcoRI יכול למנוע עיכול יעיל על ידי NdeI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשמלOphorese הגבלת digest על agarose ג&#39;ל (עבור גן 1 kb, השתמש ג&#39;ל agarose 0.7% ב 110 V עבור 55 דקות, כדי לבחור את אחוז ג&#39;ל agarose עבור גנים שונים בגן, עיין התייחסות 16 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו להוסיף להקות וקטור באמצעות אזמל נקי או סכין גילוח ומקום קטע ג&#39;ל שנעלמו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית דנ&quot;א מג&#39;ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשר את הגן של עניין לתוך וקטור pMGX באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור; להקים קשירת שלילי של pMGX מתעכל ללא הכנס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובה 20 קשירת μL המכיל 1 μL של ליגז DNA T4, 0.15-0.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5 μL), ואת הכמות המתאימה של הוספה על בסיס יחס של 3: 1 להוסיף וקטור ואת גודל הגן מוחדר; את pMGX backbones הם בין 5,312 ו 5,504 bp בגודל. כלול תגובה שלילית שליטה המכיל הכל buלא את הגן מוחדר. ודא כי כמות ה- DNA הווקטורית היא המקבילה של קשירת שליטה שלילית ואת וקטור פלוס להוסיף קשירת התגובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli ו ligated פלסמידים pMGX- yfg1 (המכיל גן של עניין 1), pMGX- yfg2 (המכיל גן של עניין 2) ... pMGX- yfgn (המכיל גן של עניין n). השתמש בטכניקה aseptic (בתוך ארון biosafety או תחת להבה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה 100 aliquots μL של המוסמכת כימית XL1-Blue E. coli על הקרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 5 μL של התגובות קשירת. דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים הלם התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה אותם על הקרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל&quot;ד עבור 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל אישורסמן לבחירה (או אמפיצילין או קנמיצין). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך שיבוטים עבור transformants חיובי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה סופרת על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבה גדול מ 1: 2 הוא הרצוי. אם יש מספר גדול של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור לשלב 2.1 ולסקור את ההערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילי: קשירת יחס) מכל תגובה קשירת כל הגנים השונים שהוכנסו להקרנה (1 n) ו לחסן 4 מ&quot;ל LB ואת התרבות המתאימה אנטיביוטיקה לילה / מושבה אישית. לגדול תרבויות לילה עם רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת 20 NDEI + תגובה EcoRI digest μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של כל אנזים עם μL 2 של חיץ 10x המתאים. בהוא מקרה, להוסיף NdeI ו EcoRI באותו זמן כי הגן של עניין יהיה בין אתרי הגבלה. שליטה שלילית עם וקטור pMGX ריק מומלץ. תקציר עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li></ol></li></ol> 3. הוספת ג&#39;ין 2 לתוך pMGX וקטור המכיל את ג &#39;ין 1, pMGX- yfg1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת digest pMGX- yfg1 עם AvrII ולטפל עם phosphatase המעי העגל (CIP). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40-μL digest המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5-10 μL של DNA בודד) ו 1 μL של AvrII עם 4 μL של חיץ 10x המתאים. תקציר עבור 1.5 שעות ב 37 ° C ולאחר מכן להוסיף 1.5 μL של CIP. להשאיר אותו על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg2 עם AvrII ו XbaI לשחרר את הגן של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA ו 1 μ, L של כל אנזים עם 4 μL של חיץ המתאים 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה אלקטרופורזה מתעכל על אחוז המתאים (0.7%) agarose ג&#39;ל ובלו את להקות להוסיף וקטור באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח (עיין צעדים 2.2-2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל בהתאם לפרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור גן 2 לתוך pMGX- yfg1 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור. הגדרת קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1 ללא הוספה נוספת. הגדר כנ&quot;ל בשלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה 5 μL של התגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli , פלסמידים ligated pMGX- yfg1,2 (המכיל גן של עניין 1 ו -2), ושליטה שלילית pMGX- yfg1 , כפי שניתן לראות בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבות זReater יותר מ 1: 2 הרצוי. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 3.1 ולסקור את הטיפול CIP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך ההכנסה יעילה של הגן השני על ידי ביצוע digest הגבלה של pMGX- yfg1,2 עם EcoRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 20 לעכל μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של אנזים EcoRI עם μL 2 של חיץ EcoRI 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל; לחפש להקה שמתאימהS לגודל הגן 2) ראה שלב 2.2 (. גן יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה. </li></ol> 4. הוספת ג &#39;ין השלישי לתוך וקטור pMGX המכילים גנים 1 ו -2, pMGX- yfg1,2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg1,2 עם AvrII ולטפל עם CIP, כפי שניתן לראות בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg3 עם AvrII ו XbaI, כפי שניתן לראות בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digests על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל ו הבלו להוסיף ווקטור להקות באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח; עיין בשלבים 2.2-2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA מן ג&#39;ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור גן 3 לתוך pMGX- yfg1,2 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור ולהגדיר קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1,2 ללא הוספה נוספת, כפי שניתן לראות בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה 5 μL של תגובות קשירת לתוך XL1-כחול מוכשר כימית תאים E. coli , ligated פלסמיד pMGX- yfg1,2,3 (המכיל גנים של עניין 1, 2, ו -3), וכן שלילי pMGX- yfg1,2 שליטה, כפי שניתן לראות בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 4.1 ולסקור את הטיפול CIP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט; לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך ההכנסה יעילה של הגן השלישי על ידי ביצוע תקציר digest של pMGX- yfg1,2,3 עם EcoRI, כפי שניתן לראות בשלב 3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל; תראהעבור להקות המתאימות לגדלים של גן 2 ו גן 3 (ראה שלב 2.2). הערה: הגן 3 יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה. אם הגנים 2 ו- 3 הם באותו גודל, יש לבחור אתר אחר של עיכוב הגבלה מתאים להקרנה. הערה: חזור על פי הצורך בכל גן חדש. </li></ol> 5. הפקת חלבונים של עניין באמצעות מערכת ביטוי multigene ו הערכת הייצור על ידי סופג המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את שיבוט חיובי המכיל את כל הגנים של עניין לתוך מוכשר מבחינה כימית, חלבון-ייצור E. coli , כגון BL21- (λDE3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה 100 aliquots μL של BL21- מוכשר כימית (λDE3) E. coli על קרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 μL של DNA פלסמיד משובץ חיובי; דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה על קרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד במשך 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל את סמן לבחירה המתאים (או ampicillin או kanamycin). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביע את החלבון על ידי איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) אינדוקציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה מבודדת מן B21- (λDE3) שינוי צלחת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטי מתאים; לגדול בן לילה, רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 100 מ&quot;ל LB בתוספת תרבות אנטיביוטי מתאים באמצעות 1 מ&quot;ל של תרבות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל&quot;ד ל 600 OD של 0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את התרבות עם 100 מיקרומטר IPTG ולגדול במשך 15 שעות ב 25 ° C ו 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1 מ&quot;ל של התרבות צנטריפוגה זה ב XG 13,000 במשך דקה 1; להשליך את supernatant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה לפי הוראות היצרןו preform כתם המערבי של lysate תא מסיס כדי לקבוע אם כל החלבונים הופקו בהצלחה 19 . </li></ol>

<ol>
	<li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+wave+of+synthetic+biology:+from+modules+to+systems.">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li><li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway.">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li><li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids.">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li><li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli.">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li><li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli.">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li><li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli.">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li><li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylneuraminic+Acid+Production+in+Escherichia+coli+Lacking+N-Acetylglucosamine+Catabolic+Machinery.">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li><li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts:+experimental+procedures,+database+tracking+and+case+studies.">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li><li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli.">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Kim, K. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes.">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li><li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li><li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector.">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5074/molecular-cloning">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016)</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5065/the-western-blot">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016)</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

ביטוי משותף של גנים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד באפיון מחדש מסלולים מורכבים, multigene מטבולי 3 , 4 , 5 . מערכת pMGX עושה ביטוי multigene שיתוף ב E. קולי שגרת 6 , 7 , 8 ונגיש לחוקרים מגוונים. במחקר זה, חמישה חלבונים של עניין הוצגו להיות מופק בו זמנית ממערכת פלסמידית אחת באמצעות pMGX-A. הרבה מערכות ביטוי ביטוי זמין כרגע רק לאפשר החדרת שני גנים, יצירת פלסמידים bicistronic כגון וקטורים PET Duet 12 . אם אחד דורש תוספת של גנים נוספים, וקטורים bicistronic מרובים עם סמנים לבחירה שונים נדרשים. בניגוד למערכות ביטוי multigene אחרות, מערכת pMGX מאפשרת שיבוט פייסילישל מספר גנים לתוך פלסמיד אחד, עם היכולת לעשות שימוש חוזר באתרי הגבלה ללא צורך פלסמידים התורם שונים או להסרת מספר רב של אתרי אנזים הגבלה מן הגנים 13 , 14 . צעדים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים תכנון גנים, מניעת recircularization רקע של וקטורים pMGX מתעכל יחיד, ומסכים של וקטורים polycistronic עבור כיוון הנכון של הגן מוכנס. בתכנון אסטרטגיית שיבוט לבניית מערכת polycistronic, זה חיוני כדי להבטיח כי הגנים של עניין אינם מכילים אתרי הגבלה הנדרשים שיבוט במורד הזרם. בפרט, אלה כוללים XbaI ו AvrII, אשר נדרשים להחדרת גנים השני ואחריו לתוך וקטור pMGX המכיל את הגן הראשון של עניין (שלבים 3 ו -4). בנוסף, חיוני לחסל אתרי הגבלה שישמשו לשיבוט הראשוני של gEnes של עניין לתוך pMGX (שלב 2). בדרך כלל, אלה כוללים NdeI או NheI בסוף 5 &#39;של הגן BamHI או EcoRI בסוף 3&#39; של הגן, אם כי אתרי הגבלה אחרים יכולים לשמש גם בשלב זה, במידת הצורך. חיסול של אתרי הגבלה נוספים, לא רצויים ניתן לבצע בקלות בשלב סינתזה הגן או, במקרה של גנים משובטים ממקורות אחרים, על ידי תחליפים נוקליאוטידים נרדף באמצעות mutagenesis מכוונת האתר 20 . תוספת של גנים הבאים של עניין לתוך pMGX המכיל את הגן הראשון של עניין דורש linearization של pMGX- yfg1 עם AvrII (שלב 3.1, שים לב כי זה יכול להיות גם linearized עם XbaI). זה וקטור לינארית יהיה במהירות religate במהלך החדרת הגן השני של עניין (שלב 3.5), המוביל למספר גבוה מאוד של שיבוטים ברקע. כדי למנוע זאת, חשוב לטפל וקטור לינארית עם phosphatase כדי dephosphorylate 52; הקצוות של וקטור לינארי. בדרך כלל, CIP משמש, אם כי אחרים זמינים. אופטימיזציה של שתי יחידות phosphatase ואת זמן הדגירה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את ligations של גנים הבאים של עניין לתוך וקטור לינארי. לבסוף, בעת יצירת מערכת polycistronic, הגן של העניין הוא נכרת בתחילה על ידי עיכול עם XbaI ו AvrII, יצירת הקצוות מלוכדות משלימה על 5 &#39;ו&#39; 3 &#39;הקצוות של הגן (שלבים 3.2 ו 4.2). זה יכול להיות ligated ligated לתוך וקטור ליניארי בכיוון קדימה או לאחור. כמו כל הקצוות מלוכדות זהים, אין כיווניות נאכף באמצעות חישול משלים של הקצוות מלוכדת. לכן יש צורך לסנן את שיבוטים וכתוצאה מכך בכיוון ההכנסה הנכון של הגן המעניין. זה יכול להיעשות בקלות על ידי שיבוטים הקרנה עם אחד האתרים הגבלה המשמש לשכפל את הגן המקורי של עניין לתוך pMGX (שלב 2). בדרך כלל,EcoRI משמש, כמו אתר ההגבלה הוא בקצה 3 &#39;של הגן, ולכן הוא מתאים המסך עבור כיווניות, כפי שמוצג באיור 6 . ברוב המקרים, 50% של שיבוטים המכילים את הגן של עניין יש הגן בכיוון הנכון ו 50% יש את הגן בכיוון ההפוך. לעתים רחוקות (~ 10% של ligations), כל שיבוטים מן קשירת מסוים עשוי להיות הגן של עניין מוכנס רק בכיוון אחד. תוצאה זו נראה תלוי רצף, שכן הוא לשחזור מאוד במקרים ספציפיים אלה. אם זה קורה, ואת הגן של עניין הוא מוסיף ברציפות בכיוון ההפוך, וקטור הרצוי בדרך כלל ניתן לגשת על ידי החלפת כיוון שיבוט. לדוגמה, במקום שיבוט yfg2 לתוך האתר AvrII של pMGX- yfg1 , yfg1 ניתן לשכפל לתוך האתר XbaI של pMGX- yfg2 . שים לב כי זה נותן את הקטור הסופי זההמערכת. גמישות נוספת זו המאפשרת גישה לאותה מערכת משיטות שיבוט שונות היא יתרון רב. מגבלה חשובה של מתודולוגיה זו היא כי החלבונים המקודדים בקצה 3 &#39;של התעתיק polycistronic בדרך כלל באים לידי ביטוי ברמות נמוכות יותר מאשר חלבונים מקודדים בסוף 5&#39; של תמליל, ואת האפקט הזה בולט עוד את התעתיק הוא יותר . משמעות הדבר היא ששינוי סדר הגנים של עניין באופרון הסינתטי עלול להשפיע על רמות הביטוי היחסי של החלבונים שהם מקודדים, ומספקים מנגנון לכוונון עדין של רמות הביטוי היחסי. לסיכום, מערכת pMGX מספק שיטה אמינה עבור ביטוי משותף של חלבונים מרובים מ פלסמיד בודד ב E. coli , אשר ניתן להשתמש עבור מגוון רחב של יישומים ביולוגיה סינתטית לאפיון מסלול ביוכימי.

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד ביישומים ביולוגיה סינתטית, שבו מודולים פונקציונליים מרובים חייב לבוא לידי ביטוי 1 ; בחקר חלבונים חלבונים, שבו הביטוי ואת הפונקציה דורשים לעתים קרובות שיתוף ביטוי 2 , 3 ; וכן אפיון ורתום מסלולים ביוסינתטיים, שבו כל גן במסלול חייב לבוא לידי ביטוי 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . מספר מערכות פותחו עבור שיתוף ביטוי, במיוחד האורגניזם המארח Escherichia coli , סוס העבודה עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מעבדה 9 . לדוגמה, פלסמידים מרובים עם סמנים לבחירה שונים ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים בודדים באמצעות שפע של שונים לשעבר<html> 12 הצ 12 , 12 . מערכות פלסמיד יחיד עבור ביטוי חלבון מרובים השתמשו גם מספר האמרגן לשלוט על הביטוי של כל גן 10 , 12 ; אופטונים סינתטיים, שבהם מקודדים גנים מרובים על תמליל יחיד 2 , 13 ; או, במקרים מסוימים, גן יחיד קידוד פוליפפטיד כי הוא מעובד proteolytically בסופו של דבר, מניב את החלבונים הרצוי של עניין 14 . <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה pMGX מראה את הבנייה של וקטור polycistronic. מערכת pMGX מספקת אסטרטגיה גמישה וקלה לשימוש לבניית אופרונים סינתטיים בשליטתו של מקדם T7.&quot;לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.&quot; Target = &quot;_ blank&quot; בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene אופטונים סינתטיים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducible ( איור 1 ) מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הוא מבוסס על מערכת פלסמיד, שנקרא במקור pKH22, כי כבר בשימוש בהצלחה עבור מספר יישומים שונים 6 , 7 , 8 . הנה, זה להגדיר פלסמיד מורחבת לכלול ארבעה וקטורים הקשורים: pMGX-A, וקטור ביטוי חסר כל C- או N- מסוף תגים עם סמן עמיד ampicillin; PMGX-heA, ביטוי וקטור קידוד תג N- מסוף hexahistidine ועם סמן עמיד ampicillin; PMGX-K, וקטור ביטוי lAcking כל C או N- מסוף תגים עם סמן התנגדות kanamycin; ו pMGX-hek, ביטוי וקטור קידוד N- מסוף hexahistidine תג עם סמן התנגדות kanamycin. במחקר זה, השיטה להפקת וקטור polycistronic המכיל חמישה גנים באמצעות מערכת pMGX, במיוחד pMGX-A, הוא הפגינו יחד עם הייצור המוצלח של כל חלבון הפרט Escherichia coli .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Enzymes</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AvrII</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NdeI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XbaI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;">600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Reagents</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 kb DNA ladder</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">456-8095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 x TAE</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1332-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>PI78243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Supplied with polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D2500-02</td>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td>
			<td style="width:312px;">GenScript</td>
			<td style="width:139px;">A00612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td style="width:312px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:139px;">WBKLS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A411-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteurized instant skim milk powder</td>
			<td style="width:312px;">Local grocery store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>No-name grocery store milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:312px;">Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td style="width:139px;">10600007</td>
			<td>Membrane PT 0.45 &#181;m 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D6943-02</td>
			<td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMGX</td>
			<td style="width:312px;">Boddy Lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td style="width:312px;">Intergrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design primers as needed for desired gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic Gene</td>
			<td style="width:312px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design and optimize as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick Blot Filter Paper</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base</td>
			<td style="width:312px;">BioShop</td>
			<td style="width:139px;">TRS001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL1-Blue chemically competent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Equipment</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioSpectrometer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">RK-83600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel box - PAGE</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1658005</td>
			<td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Imager</td>
			<td style="width:312px;">Alpha Innotech</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>AlphaImager EC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-oven</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11-690-650D</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">SHKE6000-7</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personna Razors</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S04615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power Pack</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">S65533Q</td>
			<td>FB300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator</td>
			<td style="width:312px;">VWR International</td>
			<td style="width:139px;">M-10E,6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocylcer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td>Z316091</td>
			<td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Face-Shield</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;">18-999-4542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">15-460-2SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Transfer Apparatus</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703935</td>
			<td>Mini-Trans Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר עבור ביולוגיה סינתטית, חקר קומפלקסים חלבונים חלבון, אפיון ורתום מסלולים biosynthetic. בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene סינתטי אופרנים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducable מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הנה, קבוצה של ארבעה וקטורים הקשורים, pMGX-A, pMGX-hea, pMGX-K, ו pMGX-hek, עם או ampicillin או קנמיצין התנגדות סמן לבחירה (A ו K) או גם בעל או חסר N- מסוף hexahistidine התג (שלו) נחשפים. פרוטוקולים מפורטים לבניית אופטונים סינתטיים באמצעות מערכת וקטורית זו מסופקים יחד עם הנתונים המתאימים, מראים כי מערכת pMGX מבוסס המכיל חמישה גנים ניתן לבנות בקלות ומשמש לייצר את כל חמש חלבונים מקודדים ב Escherichia coli . זה systEm ופרוטוקול מאפשר לחוקרים באופן שגרתי להביע מורכבים מרובי רכיב רכיבים ומסלולים ב E. coli .

במחקר זה, המטרה היתה לשיתוף חמישה חלבונים מתוך פלסמיד אחד. חמש קודון אופטימיזציה שברי גנים סינתטיים קידוד או N- או מסוף hexahistidine תגים נרכשו מסחרית. הגנים הסינתטיים היו מוגבר על ידי PCR ו משובטים בנפרד לתוך וקטור PCR-blunt ו sequenced. כדי ליצור את polycistronic פלסמיד, חמשת הגנים של עניין היו משובטים הראשון לתוך pMGX פלסמיד מתאים, pMGX-A. איור 2 מראה את PCRBlunt- yfg1 ו- PCRBlunt- yfg2 בנוסף ל- pMGX-A המעוכל ב- NDRI + EcoRI (ראה שלב 2). כדי לשכפל את שני הגנים הראשונים לתוך pMGX-A, פלסמיד היה מתעכל NDEI + EcoRI ( איור 2 ). עם שיבוט גנים של עניין לתוך pMGX-A, פלסמידים שנבנו לאחרונה, המיועדים pMGX- yfg1 ו pMGX- yfg2 , היו מתעכל עם אברי + XbaI כדי לאשר שיבוטים מוצלחים התקבלו, כמושמוצג ב 1.1 קילו ו 1.3-Kb להקות שהושגו באיור 3 . <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig2.jpg" /> איור 2: שיבוט של פלסמידים pMGX. התוצאות הצפויות של PCR- blunt פלסמידים המכילים yfg1 ו yfg2 לאחר עיכול עם NdeI + EcoRI מוצגים על ג&#39;ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות). נתיב 1, 1 kb סולם DNA; נתיב 2, PCRBlunt- yfg1 ; נתיב 3, PCRBlunt- yfg2 ; נתיב 4, pMGX-A שליטה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig3.jpg" /> איור 3: הקרנה של pMGX- yfg1 ו- pMGX- yfg2. ג &#39;ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות) מראה<html> שתי להקות שנוצרו על ידי שניהם pMGX- yfg1 ו pMGX- yfg2 לאחר עיכול עם AvrII + XbaI. נתיב 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1 ; נתיב 3, pMGX- yfg2 ; נתיב 4, pMGX-A שליטה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עם שני הגנים של וקטור pMGX המתאים, הפלסמיד polycistronic נבנה. כדי ליצור את פלסמיד pMGX- yfg1,2 , pMGX- yfg1 היה מתעכל עם AvrII, כפי שמוצג באיור 4 . PMGX- yfg2 היה מתעכל עם אברי + XbaI, ואת 1.3-Kb גן המכיל את השבר היה ligated לתוך האתר AvrII של ליניארי pMGX- yfg1 , הפקת pMGX- yfg1,2 . עיכול של pMGX- yfg1,2 עם EcoRI אישר שיבוט מוצלח של פלסמיד הרצוי והוא מוצג ב&gt; איור 5. <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig4.jpg" /> איור 4: יצירת picistronic פלסמיד pMGX- yfg1,2. 0.7% agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה תוצאות (110 V, 55 דקות) של pMGX- yfg1 מתעכל עם AvrII ו pMGX- yfg2 מתעכל עם אברי + XbaI. נתיב 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1 מתעכל עם AvrII; נתיב 3, pMGX- yfg2 מתעכל עם AvrII + XbaI; נתיב 4, pMGX-A שליטה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig5.jpg" /> איור 5: הקרנת pMGX- yfg1,2 שיבוטים . וכתוצאה מכך ג&#39;ל agarose 0.7% (110 V, 55 דקות) של pMGX- yfG1,2 שיבוטים מתעכל עם EcoRI מוצג. שיבוטים מוצלחים יפיק שתי להקות, אחת עבור yfg2 הגן שהוכנס והשני המתאים עמוד השדרה + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). נתיב 1, 1 kb סולם DNA; נתיב 2, pMGX- yfg1,2 מתעכל עם EcoRI, שיבוט 1; נתיב 3, pMGX- yfg1,2 מתעכל עם EcoRI, clone 2; נתיב 4, pMGX-A שליטה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כאשר מייצרים פלסמיד polycistronic המכיל שני גנים או יותר, אפשר להיתקל החדרת הפוך רצוי של הגן משובטים לאתר AvrII. איור 6 הוא ג&#39;ל המדגיש את ההבדל בין התוצאות של פלסמיד מתעכל עם גן מוכנס בכיוון הנכון לעומת הגן מוכנס בכיוון בכיוון הפוך. אם הגן הואLigated ו משובטים באוריינטציה לא רצויה, האתר EcoRI בסוף הגן יוכנס ממש ליד האתר EcoRI של הגן הקודם. זה יניב גודל שבר, כי הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה ג&#39;ל (פחות מ 50 BP). בנוסף, הגן האחרון שהוכנס יופיע בעמוד השדרה, אשר ניתן לזהות בקלות בגלל גודל עמוד השדרה להיות גדול מהצפוי. ההבדל בגודל עמוד השדרה מהגודל הצפוי יציין את גודלו של הגן האחרון שהוכנס. <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig6.jpg" /> איור 6: הקרנה של שיבוטים pMGX- yfg1-5 . ג&#39;ל agarose 1.3% (110 V, 65 דקות) המתארים את התוצאות של pMGX- yfg1-5 מתעכל עם EcoRI מוצג. שיבוטים מוצלחים (נתיב 2) יפיק להקה המתאימה לגן שהוכנס לאחרונה ( yfg5 במקרה זה, 1.1 kb). לאןE 1, 1-kb סולם DNA; נתיב 2, שיבוט חיובי של pMGX- yfg1-5, מתעכל עם EcoRI; מסלול 3, שיבוט שלילי של pMGX- yfg1-5, מתעכל עם EcoRI; נתיב 4, pMGX- yfg1-4 שליטה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי להשלים את חמשת גנים ביטוי polycistronic וקטור, שלושת הגנים הנותרים היו משובטים בזה אחר זה לתוך pMGX- yfg1,2 כדי ליצור pMGX- yfg1-5 (ראה שלב 5). פלסמיד זה הפך לאחר מכן לתוך BL21- (λDE3), ואת הביטוי של החלבונים היה המושרה בתרבות שלב באמצע יומן על ידי תוספת של IPTG. איור 7 הוא כתם המערבי של lysates התא, המאשר כי כל חמש חלבונים מ פלסמיד יחיד המכיל גנים מרובים אופרון אחד יכול לבוא לידי ביטוי. הביטוי של pMGX- yfg1 (המכיל 1 גן),PmGX- yfg1,2 (המכיל 2 גנים), ו- pMGX- yfg1-5 (המכיל 5 גנים) מוצגים. <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig7.jpg" /> איור 7: ניתוח כתם המערבי של ביטוי רב גנים באמצעות מערכת pMGX. שילוב של N או C- מסוף hexahistidine תגים מופעלת איתור כתם המערבי של ביטוי חלבון. הדגימות הופרדו על טרום יצוק 4-20% מדורג נטול זן acrylamide זן (200 V, 35 דקות, 10 ס&quot;מ x 8.5 ס&quot;מ), ולאחר מכן העברה (40 V, 90 דקות) על קרום nitrocellulose (0.45 מיקרומטר, 10 ס&quot;מ x 7 ס&quot;מ). נוגדן חד-נוגדני של HRP-מצומדות, שאינו דורש נוגדנים משניים, נמצא בשימוש. חסימה, העברה, דילול נוגדנים הוכנו כפי שהומלץ על ידי היצרן נוגדנים. גילוי בוצע עם המצע המערבי Chemiluminescent HRP בעקבות של היצרןמבנים. הקרום שהתקבל היה דמיינו באמצעות imager ללא מסנן. נתיב 1, תקן צבע כפול הועבר על הממברנה (לא chemiluminescent); נתיב 2, His6pMGX- yfg1 ; מסלול 3, His6pMGX- yfg1,2 ; ליין 4, His6pMGX- yfg1-5. הערה: חלבון המיוצר על ידי yfg5 הוא באותו גודל כמו חלבון המיוצר על ידי yfg1 (שניהם 36 kDa) ולא ניתן להפריד על הג&#39;ל. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> נתונים משלימים: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/supplemental_figure_S1_jove.pdf">אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX at JoVE.com

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Views.  University of Ottawa.  מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד. 

Video: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...