Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.

1. Obtención de genes de interés <ol><li> Diseño de genes sintéticos. <ol><li> Optimizar una secuencia génica para la expresión de E. coli . </li><li> Elimine cualquier sitio de restricción problemático de la secuencia (AvrII, NdeI, EcoRI y XbaI). </li><li> Incorporar sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5&#39;-NdeI y un sitio 3&#39;-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido seleccionado ( Figura S1 - S4 ). Si se desea, incluir una etiqueta de codificación 5 &#39;o 3&#39; para la detección de transferencia Western. </li><li> Ordena comercialmente el gen diseñado. </li><li> Tanto el clon contundente del gen en un vector romo usando un kit de clonación contundente, según las instrucciones del fabricante; Diseñar cebadores para amplificar el gen (luego proceda a la Etapa 1.2.2); O añadir los extremos 5 &#39;y 3&#39; adicionales para la clonación directa en un plásmido pMGX y proceder al Paso 2. Aquí, thLos resultados representativos son de clonación contundente de los genes de interés. </li></ol></li><li> Amplificar el gen deseado (a partir de un gen sintético diseñado y optimizado o de ADN molde que contenga el gen deseado) 15 . <ol><li> Diseño de cebadores con sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5&#39;-NdeI y un sitio 3&#39;-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido seleccionado ( Figura S1 - S4 ). Si se desea, incluya una etiqueta de codificación 5 &#39;o 3&#39; para la detección de transferencia Western. </li><li> PCR amplificar el gen deseado 15 . </li><li> Analizar la PCR por electroforesis en gel de agarosa [ 16] . </li><li> Si hay amplificación inespecífica, limpiar el gen amplificado por extracción de gel. Si no, utilice un kit de limpieza enzimática. </li><li> Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro comprobando el absorbancE a 260 nm; En blanco con tampón de elución 17 . </li></ol></li></ol> 2. Clonación de genes de interés en un sistema de expresión multigénico Vector, pMGX 18 <ol><li> La restricción digiere el gen obtenido de interés y el vector deseado, pMGX, con NdeI y EcoRI. NOTA: Si se obtiene una gran cantidad de plásmidos recircularizados, permita que la reacción NdeI continúe durante 1 h antes de añadir EcoRI. <ol><li> Utilizar una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN y 1 μl de cada enzima con 4 μl del tampón 10x apropiado. </li><li> Para un digesto de NdeI y EcoRI, utilice tampón EcoRI y primero añada endonucleasa NdeI. Recuento durante 1 h a 37 ° C. Luego, añada la endonucleasa EcoRI, y permita que la digestión continúe durante una hora adicional. NdeI es sensible a las divisiones cerca del final del ADN, por lo que la digestión inicial por EcoRI puede prevenir la digestión eficaz por NdeI. </li></ol></li><li> ElectrOphorese la digestión de restricción en gel de agarosa (para un gen de 1 kb, use un gel de agarosa al 0,7% a 110 V durante 55 min, para seleccionar el porcentaje de gel de agarosa para diferentes tamaños de genes, consulte la referencia 16 . </li><li> Inserte las bandas del inserto y del vector usando un bisturí limpio o una cuchilla de afeitar y coloque el segmento de gel extirpado en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Extraer el ADN del gel de agarosa usando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Ligar el gen de interés en el vector pMGX usando una relación de inserto a vector de 3: 1; Establecer una ligación negativa de pMGX digerido sin el inserto. <ol><li> Se prepara una reacción de ligadura de 20 μL que contiene 1 μl de ADN ligasa T4, 0,15-0,5 μg de ADN vector (~ 5 μl) y una cantidad apropiada de inserto basada en una relación inserto-vector de 3: 1 y el tamaño de El gen que se inserta; Las espinas dorsales pMGX tienen entre 5,312 y 5,504 pb de tamaño. Incluir una reacción de control negativo que contiene todo buT el gen que se está insertando. Asegúrese de que la cantidad de ADN vector es equivalente en la ligación de control negativo y en las reacciones de ligamiento de inserto más vector. </li></ol></li><li> Transformar reacciones de ligación en células de E. coli químicamente competentes XL1-Blue y plásmidos ligados pMGX- yfg1 (que contiene el gen de interés 1), pMGX- yfg2 (que contiene el gen de interés 2) ... pMGX- yfgn (que contiene el gen de interés n). Use técnica aséptica (dentro de un gabinete de bioseguridad o bajo una llama). <ol><li> Descongelar 100 μL de alícuotas de E. coli XL1-Blue químicamente competente en hielo durante 5 min y luego añadir 5 μl de las reacciones de ligación. Incubar durante 30 minutos en hielo. </li><li> Calentar el calor de las células durante 45 s en un baño de agua se mantiene a 42 ° C y luego añadir 200 μ l de frío LB. Incubarlos en hielo durante 2 min. </li><li> Agitar las células a 37 ° C, 220 rpm durante 1 h y luego extender la placa de 100 μL sobre una placa de LB-agar que contiene unMarcador seleccionable apropiado (ya sea ampicilina o kanamicina). </li></ol></li><li> Examinar los clones de los transformantes positivos. <ol><li> Comparar los recuentos de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Se desea una proporción de recuento de colonias mayor que 1: 2. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al Paso 2.1 y revise la nota. </li><li> Se seleccionan 4-8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de cada reacción de ligación de los diferentes genes insertados para el cribado (1 n) e inoculan un LB de 4 ml y el cultivo / colonia individual de antibiótico durante la noche. Cultivar los cultivos durante la noche con agitación a 37 ° C y 220 rpm. </li><li> Aislar el ADN del plásmido usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Se prepara una reacción de digestión con NdeI + EcoRI de 20 μl que contiene 150-500 ng de ADN y 1 μl de cada enzima con 2 μl del tampón 10x apropiado. EnEs caso, añadir NdeI y EcoRI al mismo tiempo que el gen de interés estará entre los sitios de restricción. Se recomienda un control negativo con el vector pMGX vacío. Se realiza la digestión durante 2 ha 37 ° C en un baño de agua. </li></ol></li></ol> 3. Inserción del gen 2 en el vector pMGX que contiene el gen 1, pMGX- yfg1 <ol><li> Restriction digerir pMGX- yfg1 con AvrII y tratar con fosfatasa intestinal de ternera (CIP). <ol><li> Utilice una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN vectorial (~ 5-10 μL de ADN aislado) y 1 μl de AvrII con 4 μl del tampón 10x apropiado. Digerir durante 1,5 h a 37 ° C y luego añadir 1,5 μ l de CIP. Dejar a 37 ° C durante 30 minutos más. </li></ol></li><li> Restriction digerir pMGX- yfg2 con AvrII y XbaI para liberar el gen de interés. <ol><li> Utilizar una reacción digestiva de 40 μl que contenga 0,5-1,5 μg de ADN y 1 μ; L de cada enzima con 4 μl del apropiado tampón 10x. Digerir durante 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> La restricción electroforosa se digiere sobre un gel de agarosa de porcentaje (0,7%) y elimina las bandas de inserto y vector usando un bisturí limpio / cuchilla de afeitar (consulte los pasos 2.2-2.3). </li><li> Extraer el ADN utilizando un kit de extracción de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante y cuantificar el ADN 17 . </li><li> Ligate gen 2 en pMGX- yfg1 utilizando una proporción de inserto a vector de 3: 1. Establezca una ligación negativa de pMGX - yfg1 digerido sin el inserto adicional. Configure como se indica en el Paso 2.5. </li><li> Transformar 5 μL de las reacciones de ligación en células de E. coli químicamente competentes de XL1-Blue, plasmidos ligados pMGX- yfg1,2 (que contienen el gen de interés 1 y 2) y control negativo de pMGX- yfg1 , como se observa en el Paso 2.6. </li><li> Comparar el recuento de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Una proporción de recuento de colonias gMás de 1: 2. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al Paso 3.1 y revise el tratamiento con CIP. </li><li> Se seleccionan 4-8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de la reacción de ligación e inoculan 4 mL de LB más el antibiótico apropiado por colonia individual y crecen durante la noche a 37ºC y 220 rpm. </li><li> Aislar el ADN plasmídico utilizando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante y cuantificar el ADN 17 . </li><li> Examinar la inserción efectiva del segundo gen mediante la realización de una digestión de restricción de pMGX- yfg1,2 con EcoRI. <ol><li> Utilizar una reacción digestiva de 20 μL que contenga 150-500 ng de ADN y 1 μl de enzima EcoRI con 2 μl de tampón EcoRI 10x. Digerir durante 2 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Electroforese el digesto de restricción en un gel de agarosa de porcentaje apropiado; Busca una banda que correspondaS al tamaño del gen 2 (véase el paso 2.2). Un gen puede insertarse en el vector en la orientación no deseada, invertida. </li></ol> 4. Adición de un tercer gen en el vector pMGX que contiene los genes 1 y 2, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Restriction digerir pMGX- yfg1,2 con AvrII y tratar con CIP, como se ve en el paso 3.1. </li><li> Restriction digerir pMGX- yfg3 con AvrII y XbaI, como se ve en el paso 3.2. </li><li> La electroforesis de la restricción se digiere en un gel de porcentaje de agarosa apropiado y en inserciones de inserto y bandas de vectores usando una cuchilla limpia de bisturí / navaja; Consulte los pasos 2.2-2.3. </li><li> Extraer el ADN del gel de agarosa utilizando un kit de extracción de gel y cuantificar el ADN 17 . </li><li> Ligar el gen 3 en pMGX- yfg1,2 usando una relación de inserto a vector de 3: 1 y establecer una ligación negativa de pMGX - yfg1,2 digerido sin un inserto adicional, como se observa en el Paso 3.5. </li><li> Transformar 5 μL de las reacciones de ligación en XLCélulas de E. coli químicamente competentes de 1-Blue, plásmido ligado pMGX- yfg1,2,3 (que contiene genes de interés 1, 2 y 3), y control negativo de pMGX- yfg1,2 , como se observa en el Paso 2.6. </li><li> Comparar el recuento de colonias en las placas de control negativo y ligadura. Si hay un gran número de colonias en la placa de control negativo, vuelva al paso 4.1 y revise el tratamiento con CIP. </li><li> Seleccionar de 4 a 8 colonias individuales (dependiendo del control negativo: relación de ligación) de la reacción de ligación e inocular 4 ml de LB más el antibiótico apropiado por colonia individual; Crecen durante la noche a 37 ° C y 220 rpm. </li><li> Aísle el ADN plasmídico usando un kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Examinar la inserción efectiva del tercer gen mediante la realización de una digestión de restricción de pMGX- yfg1,2,3 con EcoRI, como se observa en el Paso 3.10. </li><li> Electroforese el digesto de restricción en un gel de agarosa de porcentaje apropiado; MiraPara bandas que corresponden a los tamaños del gen 2 y del gen 3 (véase el paso 2.2). Nota: el gen 3 puede insertarse en el vector en la orientación invertida no deseada. Si los genes 2 y 3 son del mismo tamaño, se debe seleccionar otro sitio de digestión de restricción apropiado para el cribado. NOTA: Repita según sea necesario para cada nuevo gen. </li></ol> 5. Producción de proteínas de interés utilizando un sistema de expresión multigénico y evaluación de la producción mediante Western Blot <ol><li> Transforma el clon positivo que contiene todos los genes de interés en E. coli de producción de proteína químicamente competente, tal como BL21- (λDE3). <ol><li> Descongelar 100 μL de alícuotas de E. coli BL21- (λDE3) químicamente competente sobre hielo durante 5 min y luego añadir 1 μl del ADN del plásmido clonado positivo; Incubar durante 30 minutos sobre hielo. </li><li> Calentar térmicamente las células durante 45 s en un baño de agua mantenido a 42 ° C y luego añadir 200 μ l de frío LB. Incubar en hielo durante 2 min. </li><li>Agitar las células a 37ºC y 220 rpm durante 1 h y luego extender la placa 100 mu l sobre una placa de LB - agar que contiene el marcador seleccionable apropiado (ya sea ampicilina o kanamicina). </li></ol></li><li> Expresar la proteína por inducción de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). <ol><li> Seleccionar una colonia aislada de la placa de transformación B21- (λDE3) e inocular 4 mL de LB más el antibiótico apropiado; Crecen durante la noche, agitando a 37 ° C y 220 rpm. </li><li> Inocular una LB de 100 mL más el cultivo antibiótico apropiado usando 1 mL de cultivo durante la noche. </li><li> Crecer a 37 ° C con agitación a 220 rpm a un OD 600 de 0,6. </li><li> Inducir el cultivo con 100 μ M IPTG y crecer durante 15 horas a 25 ° C y 220 rpm. </li><li> Eliminar 1 ml del cultivo y centrifugarlo a 13.000 xg durante 1 min; Desechar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Lyse las células utilizando solución de lisis según las instrucciones del fabricanteY preformar una transferencia Western del lisado celular soluble para determinar si todas las proteínas fueron producidas con éxito [ 19] . </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La co-expresión de múltiples genes es cada vez más esencial, en particular en la caracterización y reconstitución complejas, multigénicas vías metabólicas [ 3 , 4 , 5] . El sistema pMGX hace co-expresión multigén en la rutina de E. coli 6 , 7 , 8 y accesible a diversos investigadores. En este estudio, se demostró que cinco proteínas de interés se producían simultáneamente a partir de un único sistema de plásmido usando pMGX-A. Muchos sistemas de coexpresión actualmente disponibles sólo permiten la inserción de dos genes, generando plásmidos bicistrónicos tales como los vectores pET Duet 12 . Si se requiere la adición de más genes, se requieren múltiples vectores bicistrónicos con diferentes marcadores seleccionables. En contraste con otros sistemas de expresión multigénicos, el sistema pMGX permite la fácil clonaciónDe múltiples genes en un plásmido, con la capacidad de reutilizar sitios de restricción sin la necesidad de diferentes plásmidos donantes o para eliminar múltiples sitios de enzimas de restricción de los genes [ 13 , 14] . Los pasos críticos en este protocolo incluyen el diseño de genes, la prevención de la recircularización de fondo de vectores pMGX digeridos individualmente y las pantallas de los vectores policistrónicos para la orientación correcta del gen insertado. Al planificar la estrategia de clonación para construir un sistema policistrónico, es esencial asegurar que los genes de interés no contienen sitios de restricción requeridos para la clonación aguas abajo. En particular, éstos incluyen XbaI y AvrII, que son necesarios para la inserción del segundo y posteriores genes en el vector pMGX que contiene el primer gen de interés (Etapas 3 y 4). Además, es esencial eliminar los sitios de restricción que se utilizarán para la clonación inicial del gDe interés en pMGX (Etapa 2). Típicamente, éstos incluyen NdeI o NheI en el extremo 5 &#39;del gen y BamHI o EcoRI en el extremo 3&#39; del gen, aunque también se pueden usar otros sitios de restricción para esta etapa, si es necesario. La eliminación de sitios de restricción adicionales no deseados puede realizarse fácilmente en la etapa de síntesis de genes o, en el caso de genes clonados de otras fuentes, mediante sustituciones de nucleótidos sinónimas mediante mutagénesis dirigida 20 . La adición de genes posteriores de interés en pMGX que contiene el primer gen de interés requiere la linealización de pMGX- yfg1 con AvrII (Etapa 3.1, nota que también se puede linealizar con XbaI). Este vector linealizado se volverá a religar rápidamente durante la inserción del segundo gen de interés (Etapa 3.5), dando lugar a un número extremadamente elevado de clones de fondo. Para evitar esto, es esencial tratar el vector linealizado con una fosfatasa para desfosforilar el 5 2; Extremos del vector linealizado. Normalmente, CIP se utiliza, aunque otros están disponibles. La optimización tanto de las unidades de fosfatasa como del tiempo de incubación puede ser necesaria para optimizar las ligaciones de genes posteriores de interés en el vector linealizado. Por último, al generar un sistema policistrónico, el gen de interés se excita inicialmente por digestión con XbaI y AvrII, generando extremos cohesivos complementarios en los extremos 5 &#39;y 3&#39; del gen (Etapas 3.2 y 4.2). Este inserto puede ser ligado en el vector linealizado en la dirección hacia delante o hacia atrás. Como todos los extremos cohesivos son idénticos, no se impone direccionalidad a través del recocido complementario de los extremos cohesivos. Por lo tanto, es necesario tamizar los clones resultantes para la dirección de inserción correcta del gen de interés. Esto puede hacerse fácilmente mediante la selección de clones con uno de los sitios de restricción usados ​​para clonar el gen original de interés en pMGX (Etapa 2). Típicamente,Se usa EcoRI, ya que el sitio de restricción está en el extremo 3 &#39;del gen, y por lo tanto es apropiado examinar la direccionalidad, como se muestra en la Figura 6 . En la mayoría de los casos, el 50% de los clones que contienen el gen de interés tienen el gen en la orientación correcta y el 50% tienen el gen en la orientación opuesta. Con poca frecuencia (~ 10% de ligaciones), todos los clones de una ligación particular pueden tener el gen de interés insertado en una sola dirección. Este resultado parece ser dependiente de la secuencia, ya que es altamente reproducible en estos casos específicos. Si esto ocurre, y el gen de interés se está insertando continuamente en la orientación inversa, normalmente se puede acceder al vector deseado cambiando la dirección de clonación. Por ejemplo, en lugar de clonar yfg2 en el sitio AvrII de pMGX- yfg1 , yfg1 puede clonarse en el sitio XbaI de pMGX- yfg2 . Obsérvese que esto da el vector final idénticosistema. Esta mayor flexibilidad que permite el acceso al mismo sistema desde diferentes estrategias de clonación es altamente ventajosa. Una limitación importante de esta metodología es que las proteínas codificadas en el extremo 3 &#39;de la transcripción policistrónica se expresan típicamente a niveles inferiores a las proteínas codificadas en el extremo 5&#39; de la transcripción y este efecto es más pronunciado cuanto más larga sea la transcripción . Esto significa que el cambio del orden de los genes de interés en el operón sintético puede afectar los niveles relativos de expresión de las proteínas que codifican, proporcionando un mecanismo para ajustar los niveles relativos de expresión. En resumen, el sistema pMGX proporciona un método fiable para la co-expresión de múltiples proteínas a partir de un solo plásmido en E. coli , que puede usarse para una variedad de aplicaciones de biología sintética y para la caracterización de vías bioquímicas.

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial, particularmente en las aplicaciones de biología sintética, donde se deben expresar múltiples módulos funcionales 1 ; En el estudio de complejos proteína-proteína, donde la expresión y la función a menudo requieren co-expresión 2 , 3 ; Y en la caracterización y el aprovechamiento de las vías biosintéticas, en las que cada gen en la vía debe expresarse 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Se han desarrollado varios sistemas para la co-expresión, particularmente en el organismo huésped Escherichia coli , el caballo de trabajo para la expresión de proteínas recombinantes en laboratorio 9 . Por ejemplo, se pueden usar múltiples plásmidos con diferentes marcadores seleccionables para expresar proteínas individuales utilizando una gran cantidad de diferentes ex<html> Vectores de presión 10 , 11 . Los sistemas individuales de plásmido para la expresión de múltiples proteínas han utilizado múltiples promotores para controlar la expresión de cada gen 10 , 12 ; Operones sintéticos, donde múltiples genes se codifican en un solo transcrito 2 , 13 ; O, en algunos casos, un solo gen que codifica un polipéptido que se procesa en última instancia proteolíticamente, produciendo las proteínas deseadas de interés 14 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo pMGX mostrando la construcción de un vector policistrónico. El sistema pMGX proporciona una estrategia flexible y fácil de usar para la construcción de operones sintéticos bajo el control de un promotor T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible ( Figura 1 ). Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. Se basa en un sistema de plásmidos, originalmente llamado pKH22, que se ha utilizado con éxito para un número de diferentes aplicaciones 6 , 7 , 8 . En este caso, este conjunto de plásmidos se amplía para incluir cuatro vectores relacionados: pMGX-A, un vector de expresión que carece de etiquetas C o N-terminales y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-hisA, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-K, un vector de expresión lMarcar cualquier marcador C o N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina; Y pMGX-hisK, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina. En este estudio, se demuestra el método para generar un vector policistrónico que contiene cinco genes usando el sistema pMGX, específicamente pMGX-A, junto con la producción exitosa de cada proteína individual en Escherichia coli .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1224">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Enzymes</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0290S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AvrII</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NdeI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XbaI</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;">600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Reagents</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 kb DNA ladder</td>
			<td style="width:312px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">456-8095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 x TAE</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1332-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>PI78243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:312px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Supplied with polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D2500-02</td>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td>
			<td style="width:312px;">GenScript</td>
			<td style="width:139px;">A00612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td>
			<td style="width:312px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:139px;">WBKLS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A411-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteurized instant skim milk powder</td>
			<td style="width:312px;">Local grocery store</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>No-name grocery store milk is adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:312px;">Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td>
			<td style="width:139px;">10600007</td>
			<td>Membrane PT 0.45 &#181;m 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:312px;">Omega</td>
			<td style="width:139px;">D6943-02</td>
			<td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMGX</td>
			<td style="width:312px;">Boddy Lab</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers</td>
			<td style="width:312px;">Intergrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design primers as needed for desired gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic Gene</td>
			<td style="width:312px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Design and optimize as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick Blot Filter Paper</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris base</td>
			<td style="width:312px;">BioShop</td>
			<td style="width:139px;">TRS001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:312px;">Sigma-Alrich</td>
			<td style="width:139px;">P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL1-Blue chemically competent cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:448px;">Comeptent cell prepared in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Name</td>
			<td style="width:312px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Equipment</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioSpectrometer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">RK-83600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel box - PAGE</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1658005</td>
			<td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Imager</td>
			<td style="width:312px;">Alpha Innotech</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>AlphaImager EC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-oven</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11-690-650D</td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">SHKE6000-7</td>
			<td>MaxQ 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personna Razors</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S04615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Power Pack</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">S65533Q</td>
			<td>FB300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator</td>
			<td style="width:312px;">VWR International</td>
			<td style="width:139px;">M-10E,6W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocylcer</td>
			<td style="width:312px;">Eppendorf</td>
			<td>Z316091</td>
			<td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV Face-Shield</td>
			<td style="width:312px;"></td>
			<td style="width:139px;">18-999-4542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td style="width:312px;">Fisher Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">15-460-2SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western Transfer Apparatus</td>
			<td style="width:312px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:139px;">1703935</td>
			<td>Mini-Trans Blot Cell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial para la biología sintética, estudiando los complejos proteína-proteína, y caracterizando y aprovechando las vías biosintéticas. En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible. Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. En este caso, un conjunto de cuatro vectores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K y pMGX-hisK, con el marcador seleccionable de resistencia a la ampicilina o la kanamicina (A y K) y que poseen o carecen de una hexahistidina N-terminal Etiqueta (su) se describen. Se proporcionan protocolos detallados para la construcción de operones sintéticos usando este sistema vectorial junto con los datos correspondientes, mostrando que un sistema basado en pMGX que contiene cinco genes puede ser fácilmente construido y usado para producir las cinco proteínas codificadas en Escherichia coli . Este sistemaEm y el protocolo permite a los investigadores a rutinariamente expresar complejos módulos de múltiples componentes y vías en E. coli .

En este estudio, el objetivo era co-expresar cinco proteínas de un solo plásmido. Los fragmentos de gen sintéticos optimizados con cinco codones que codifican etiquetas de hexahistidina N- o C-terminal se compraron comercialmente. Los genes sintéticos se amplificaron por PCR y se clonaron individualmente en un vector PCR-blunt y se secuenciaron. Para generar el plásmido policistrónico, los cinco genes de interés se clonaron primero en un plásmido pMGX adecuado, pMGX-A. La Figura 2 muestra PCRBluntyfg1 y PCRBluntyfg2 además de pMGX-A digerido con NdeI + EcoRI (véase el Paso 2). Para clonar los dos primeros genes en pMGX-A, el plásmido fue digerido con NdeI + EcoRI ( Figura 2 ). Tras la clonación de los genes de interés en pMGX-A, los plásmidos recién construidos, denominados pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2 , se digirieron con AvrII + XbaI para confirmar que se obtuvieron clones exitosos, comoMostrado en las bandas de 1,1 kb y 1,3 kb obtenidas en la Figura 3 . <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig2.jpg" /> Figura 2: Clonación de plásmidos pMGX. En un gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) se muestran los resultados esperados de los plásmidos de PCR blunt que contienen yfg1 y yfg2 después de la digestión con NdeI + EcoRI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, PCRBluntyfg1 ; Carril 3, PCRBluntyfg2 ; Pista 4, control de pMGX - A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig3.jpg" /> Figura 3: Selección de pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2. El gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) muestra<html> Las dos bandas que son generadas por ambos pMGX- yfg1 y pMGX- yfg2 después de la digestión con AvrII + XbaI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX - yfg1 ; Carril 3, pMGX - yfg2 ; Pista 4, control de pMGX - A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Con ambos genes en el vector pMGX apropiado, se construyó el plásmido policistrónico. Para generar el plásmido pMGX- yfg1,2 , pMGX- yfg1 se digirió con AvrII, como se muestra en la Figura 4 . PMGX- yfg2 se digirió con AvrII + XbaI, y el gen de 1,3 kb que contenía el fragmento se ligó en el sitio AvrII de pMGX - yfg1 linealizado, generando pMGX- yfg1,2 . La digestión de pMGX- yfg1,2 con EcoRI confirmó la clonación exitosa del plásmido deseado y se muestra en&gt; Figura 5. <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig4.jpg" /> Figura 4: Generación del plásmido bicistrónico pMGX - yfg1,2. Resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (110 V, 55 min) de pMGX- yfg1 digerido con AvrII y pMGX- yfg2 digerido con AvrII + XbaI. Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX- yfg1 digerido con AvrII; Carril 3, pMGX- yfg2 digerido con AvrII + XbaI; Pista 4, control de pMGX - A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig5.jpg" /> Figura 5: Selección de clones pMGX - yfg1,2 . El gel de agarosa al 0,7% resultante (110 V, 55 min) de pMGX - yfSe muestran g1,2 clones digeridos con EcoRI. Los clones exitosos generarán dos bandas, una para el gen yfg2 insertado y la otra para el backbone + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Carril 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, pMGX- yfg1,2 digerido con EcoRI, clon 1; Carril 3, pMGX- yfg1,2 digerido con EcoRI, clon 2; Pista 4, control de pMGX - A. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Cuando se genera un plásmido policistrónico que contiene dos o más genes, se puede encontrar una inserción invertida indeseable del gen clonado en el sitio AvrII. La Figura 6 es un gel que resalta la diferencia entre los resultados de un plásmido digerido con un gen insertado en la orientación correcta en oposición a un gen que se inserta en la orientación inversa. Si el gen esLigados y clonados en la orientación no deseada, el sitio EcoRI al final del gen se insertará justo al lado del sitio EcoRI del gen anterior. Esto daría un tamaño de fragmento que es prácticamente indetectable por electroforesis en gel de ADN (menos de 50 pb). Además, el último gen insertado aparecería en la columna vertebral, que es fácilmente identificable debido a que el tamaño de la columna vertebral es mayor de lo esperado. La diferencia en el tamaño de la columna vertebral del tamaño esperado indicará el tamaño del último gen insertado. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig6.jpg" /> Figura 6: Selección de clones pMGX - yfg1-5 . Se muestra un gel de agarosa al 1,3% (110 V, 65 min) que representa los resultados de pMGX- yfg1-5 digerido con EcoRI. Los clones exitosos (carril 2) generarán una banda correspondiente al último gen insertado ( yfg5 en este caso, 1,1 kb). LanE 1, escala de ADN de 1 kb; Carril 2, clon positivo de pMGX- yfg1-5, digerido con EcoRI; Carril 3, clon negativo de pMGX- yfg1-5, digerido con EcoRI; Pista 4, control de pMGX - yfg1 - 4 . <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para completar el gen de cinco genes de expresión polycistronic, los tres genes restantes fueron clonados uno tras otro en pMGX- yfg1,2 para generar pMGX- yfg1-5 (véase el paso 5). Este plásmido se transformó a continuación en BL21- (λDE3), y la expresión de las proteínas se indujo en un cultivo de fase de registro medio mediante la adición de IPTG. La Figura 7 es una transferencia Western de lisados ​​celulares, que confirma que se pueden expresar las cinco proteínas de un solo plásmido que contiene múltiples genes en un solo operón. La expresión de pMGX - yfg1 (que contiene 1 gen),PMGX- yfg1,2 (que contiene 2 genes), y pMGX- yfg1-5 (que contiene 5 genes). <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig7.jpg" /> Figura 7: Análisis de Western blot de la expresión de múltiples genes usando el sistema pMGX. La incorporación de marcadores de hexahistidina N- o C-terminales permitió la detección de transferencia de Western de la expresión de proteína. Las muestras se separaron en geles de acrilamida sin deformación de gradiente 4-20% pre-moldeados (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm), y después una transferencia (40 V, 90 min) sobre una membrana de nitrocelulosa (0,45 μm, 10 cm x 7 cm). Se usó anticuerpo monoclonal anti-His conjugado con HRP, que no requiere un anticuerpo secundario. Los tampones de bloqueo, transferencia y de dilución de anticuerpos se prepararon según lo recomendado por el fabricante de anticuerpos. La detección se realizó con Western Chemiluminescent HRP substrato siguiendo las instrucciones del fabricanteTrucciones. La membrana resultante se visualizó utilizando un generador de imágenes sin filtro. Carril 1, patrón de doble color transferido sobre la membrana (no quimioluminiscente); Carril 2, His6pMGX - yfg1 ; Carril 3, His6pMGX - yfg1,2 ; Carril 4, His6pMGX - yfg1 - 5. Nota: La proteína producida por yfg5 es del mismo tamaño que la proteína producida por yfg1 (ambos son de 36 kDa) y no puede separarse en el gel. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/55187fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figuras suplementarias: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55187/supplemental_figure_S1_jove.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K vistas.  University of Ottawa.  Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX. 

Video: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Investigación

Genética

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...