Name: isolation and culture of primary endothelial cells from canine arteries and veins
Uploaded: 2016-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.

Ética declaração: Os vasos sanguíneos utilizados neste estudo foram colhidas como material excedente obtido a partir de cadáveres caninos frescos (n = 4) a partir de cães saudáveis ​​sacrificados para outras pesquisas independentes (a política Universidade 3R). vasos sanguíneos anormais (desvios portossistêmicos intra e extra-hepáticos, n = 1 cada) foram colhidas post-mortem após consentimento informado dos proprietários de cães apresentados com a Clínica Universitária de Animais de Companhia da Universidade de Utrecht. 1. Isolamento e Cultura de pilhas Canine endoteliais <ol><li> Pré-revestir placas de 6 cavidades com 2 ml / poço de 0,5% w / v de gelatina e deixar durante 2 horas num incubador com uma atmosfera humidif içada de 5% de CO2 a 37 ° C. Remova o excesso de solução de gelatina antes de semear as células primárias. </li><li> Assepticamente remover do vaso sanguíneo (s) de interesse (por exemplo, da aorta, da veia cava, da veia porta) a partir de um cadáver fresco canino (Figura 1A). Manter a anatomia do sistema de vasoscolocando fórceps rectas em ambas as extremidades do vaso de interesse. Evitar a manipulação desnecessária do tecido com uma pinça para evitar danos nas células endoteliais. <ol><li> Cortar o navio fixada em ambas as extremidades com tesouras cirúrgicas e remover a partir do cadáver. Transporte em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) em gelo. NOTA: Um comprimento do vaso de cerca de 5 cm é preferida para este procedimento, mas aqueles que medem 1 cm também proporcionará número suficiente de células para a cultura. </li></ol></li><li> Transferir o vaso sanguíneo para uma placa de Petri cheio com HBSS arrefecida em gelo. Utilizando uma tesoura cirúrgica, remover todo o tecido aderente e gordura a partir do exterior do recipiente, mantendo o vaso em si intacta (Figura 1B). Certifique-se o navio está claramente visível em todos os momentos durante o corte: puxe de lado o tecido circundante com uma pinça ou fórceps para visualização ideal. <ol><li> Feche todos os ramos do navio com ligaduras (por exemplo, poliglactina 3-0) e, posteriormente, removê-loscom tesoura cirúrgica ou bisturi. </li></ol></li><li> Cuidadosamente inserir uma extremidade navio com um fórceps curvo mosquito Halsted, prender a ponta do fórceps, na outra extremidade do recipiente e, em seguida, retrai, lentamente, invertendo o recipiente, até que esteja completamente dentro para fora (Figura 1C-G). O exterior consiste agora a camada de células endoteliais. Se alguma dificuldade é encontrada em cima invertendo a embarcação, submergir em HBSS novamente para reduzir o atrito. </li><li> Coloque suturas em bolsa de nas duas extremidades do recipiente para o fechar completamente e para evitar a exposição de qualquer tecido vascular endotelial não para o procedimento de digestão (Figura 1H). Use as pontas da ligadura para manipular o recipiente invertido. </li><li> Se a digestão e a cultura é realizada mais tarde, o navio de criopreservar invertida antes da digestão protocolo (passo 1.7). <ol><li> Colocar o recipiente invertido num criotubo e encher com meio de cultura de células de congelação. Congelamento até -80 ° C utilizando um co congelaçãontainer. Armazenar a -80 ° C, se os recipientes forem para ser usado no prazo de uma semana. Para armazenamento a longo prazo, cryovials lugar a -180 ° C. Ao realizar o isolamento CE, descongelar as criotubos rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocar imediatamente em HBSS arrefecido com gelo. Prosseguir como indicado em 1.7. NOTA: Ter em conta que o rendimento total de ECs após o isolamento será menor devido à perda de viabilidade durante o processo de congelamento. </li></ol></li><li> Transferir o navio para um tubo de 50 ml e lave-o duas vezes em HBSS para remover os eritrócitos (ou meio de congelamento residual em caso de degelo) (Figura 1I). </li><li> Digerir o recipiente em um tubo de 50 ml com uma solução de 30 mL de colagenase tipo II (0,15 U / ml) e dispase (0,15 U / ml) em células caninas endoteliais Meio de Crescimento (CECGM) durante 1 h a 37 ° C com suave intermitente agitação. </li><li> Retirar o recipiente do tubo e centrifuga-se a suspensão de células durante 5 min a 250 x g. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em um CECGMND semente 2 ml de suspensão de células por poço (1 - 3 poços dependendo do tamanho do recipiente). Cultura das células a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 em ar e alterar o meio de cultura duas vezes por semana. </li><li> A passagem das células quando uma confluência de 70-80% é atingido. <ol><li> Lavam-se as células com HBSS pré-aquecido para remover células mortas ou não-ligados. Adicionou-se 200 células-enzima recombinante dissociação ul (1x) a cada poço e colocar de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas. </li><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml e parar tripsinização adicionando 10 ml de meio de cultura (CEGM) incluindo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Centrifugar durante 5 minutos a 250 x g. Continuar a cultura numa placa pré-revestida de gelatina ou balão. </li></ol></li></ol> 2. Caracterização <ol><li> Culturas células caninas aórtica endoteliais (CnAOECs) e comparar a morfologia das linhas celulares primárias e comerciais, duas vezes por semana com um microscópio. NOTA: Tele típica crescente padrão de ECs em manchas pode ser melhor observado quando uma confluência de&gt; 70% é atingido. <ol><li> Cultura CnAOECs em CECGM em um frasco T75 0,5% w / v de gelatina, pré-revestido. células de passagem, uma vez por semana, quando a confluência é de 70 - 80%. <ol><li> Para Passaging, lave as células uma vez com HBSS pré-aquecido e adicionar 1 ml de enzima celular recombinante de dissociação (1x). Colocar o balão de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas. Inactivar a tripsina por adição de meio de cultura de 10 ml (CEGM) incluindo 10% de FCS. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 250 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura de 1 ml. </li><li> Tomar uma aliquota de 10 uL da suspensão de células e diluir 1: 1 com 0,4% de azul de tripano. Contar as células utilizando um contador de células automatizado, e placa para 4,0 x 10 5 células viáveis em um novo frasco T75. Adicionar 10 ml de CECGM pré-aqueceu-se ao balão e cultura a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2. </li></ol></li></ol></li><li> Isolar RNA de passagem 1 dos CaPECs cultivadas e CnAOECs. <ol><li> Recolher pelo menos 1 x 10 3 células como um sedimento, adicionar 20 ul de reagente de preparação da amostra (SPR) e incubar durante 1 min para lisar as células. Após a incubação, recolher cuidadosamente o lisado celular contendo o ARN total e armazenar a -70 ° C. </li></ol></li><li> Converter o ARNm em ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc (por exemplo, iScript) seguindo as instruções do fabricante. ADNc Armazenar a 4 ° C até uma semana, ou a -20 ° C durante a longo prazo até estar pronto para executar o qPCR. </li><li> Medir a expressão do gene do marcador endotelial CD31 para confirmar a origem das células endoteliais. Faça a configuração experimental e quantificação utilizando as diretrizes Precis MIQE 10. Para a normalização, medir a expressão de genes de referência GAPDH, RPS19 e B2MG 11. <ol><li> Prepara-se uma diluição de 10 vezes do ADNc obtido em água isenta de nuclease. </li><li> Prepararuma diluição de 4 vezes a partir de amostras de cDNA reunidos para a linha de padrão e usar a água livre de nuclease, como um controlo não-molde. Dilui-se as amostras cinco vezes para obter um total de diluição de 50 vezes para as reacções qPCR. Pipetar 10 ul reacções em duplicado em um formato de 384 poços utilizando 4 ul de cDNA e 6 uL do fluoróforo misturada com 20 pmol de iniciador directo e inverso (Tabela 1). </li><li> Definir o programa a 95 ° C durante 5 min para a activação da polimerase Taq, seguido por 39 ciclos de 10 seg a 95 ° C para desnaturação, 30 segundos e a Tm para o emparelhamento e alongamento. A Tm para cada conjunto de iniciadores está mostrado na Tabela 1. </li><li> Executar derretendo curva analisa a seguir a cada corrida para garantir que apenas um produto é amplificado. Normalizar os níveis das amostras utilizando o valor médio relativo dos genes de referência da expressão, e calcular a eficiência da reacção ΔCt se estiver compreendida entre 95% e 105%. </li></ol></li><li> Avaliar a funcionalidade CE, com um angiensaio ogenesis. <ol><li> Adicionar 10 ul de matriz extracelular em cada cavidade de uma lâmina pré-arrefecida a angiogénese e espalhar com uma ponta de pipeta para cobrir a superfície do poço. Manter a matriz extracelular em gelo e evitar a introdução de bolhas de ar no gel. Solidificar o gel, colocando a lâmina numa placa de Petri com água embebido toalhas de papel numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 30 min. </li><li> Adicionar 1,0 x 10 4 primário ECs em 50 ul de Crescimento Endotelial de meio por poço. Incubar a lâmina durante 6 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Após 6 horas tirar fotografias com uma ampliação de 20X, certificando-se de incluir todo o bem na imagem. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Failure+Models:+Traditional+and+Novel+Therapy.">Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy.</a> Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).</li><li>van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+liver+shunts+in+dogs+elucidate+pathways+regulating+embryonic+development+and+clinical+disorders+of+the+portal+vein.">Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein.</a> Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).</li><li>Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phosphorylation+of+the+mTORC2/Akt/4E-BP1+pathway+in+newly+derived+canine+hemangiosarcoma+cell+lines.">Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines.</a> BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).</li><li>Boilson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+circulating+progenitor+cells+in+left+ventricular+dysfunction.">Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction.</a> Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).</li><li>Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinolysis+and+proliferative+endarteritis:+two+related+processes+in+chronic+infections?+The+model+of+the+blood-borne+pathogen+Dirofilaria+immitis.">Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).</li><li>Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+radicals+mediate+endothelial+cell+damage+by+complement-stimulated+granulocytes.+An+in+vitro+model+of+immune+vascular+damage.">Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage.</a> J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).</li><li>Aranguren, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+a+novel+transcription+factor+code+determining+the+human+arterial-specific+endothelial+cell+signature.">Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature.</a> Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).</li><li>van Balkom, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+require+miR-214+to+secrete+exosomes+that+suppress+senescence+and+induce+angiogenesis+in+human+and+mouse+endothelial+cells.">Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells.</a> Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).</li><li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+(HUVEC).">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIQE+precis:+Practical+implementation+of+minimum+standard+guidelines+for+fluorescence-based+quantitative+real-time+PCR+experiments.">MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments.</a> BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).</li><li>Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+canine+reference+genes+for+accurate+quantification+of+gene+expression.">Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).</li><li>Heishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-214+and+MicroRNA-126+Are+Potential+Biomarkers+for+Malignant+Endothelial+Proliferative+Diseases.">MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases.</a> Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).</li><li>Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterisation+of+canine+mitral+valve+interstitial+and+endothelial+cells.">Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells.</a> Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).</li><li>van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canine+congenital+portosystemic+shunts:+disconnections+dissected.">Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected.</a> The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).</li><li>Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+(VEGF)+levels+in+the+blood+serum+of+dogs+with+malignant+neoplasms+of+the+oral+cavity.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity.</a> Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+study+of+hydralazine,+a+potential+anti-angiogenic+agent.">In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent.</a> Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Em estudos com foco em ECs canino a linha primária CnAOEC é usado para modelar as linhagens endoteliais do cão 3, 12, 13. Em estudos humanos, a cultura HUVEC ainda é considerada o padrão-ouro. Claramente, concentrando-se apenas em ECs derivadas do cordão umbilical é uma restrição firme na investigação cardiovascular. As células endoteliais têm um padrão de expressão de genes específicos de determinar especificação arteriovenosa. A fim de levar em conta essas diferenças nos vasos pós-natal apresentamos este método de isolamento de romance com base na localização anatômica específica das células endoteliais. Os métodos vulgarmente utilizados para o isolamento CE primário são a lavagem do vaso com uma solução de enzima ou picagem do recipiente antes da digestão, dois métodos que ambos têm um risco de contaminação por não-CEs. Nós estabelecemos uma técnica para o isolamento de células endoteliais Canino primária (CaPECs) com um menor risco de contaminação, que também pode ser usado em pequenos vasos. Este isolamento método de células endoteliais é baseado na inversão do recipiente, o que evita a digestão de todos os outros tipos de células recipiente. É importante remover os recipientes em condições assépticas, como ilustrado na Figura 1A, para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica das culturas endoteliais. No caso de crescimento bacteriano um agente antimicrobiano adicional (por exemplo, gentamicina) pode ser adicionado ao meio de cultura. Em caso de tratamento de infecção fúngica não é frequentemente bem sucedidos em nossa experiência. Para que a inversão de sucesso, é essencial para se obter um recipiente que é de aproximadamente 5 cm de comprimento. Um segundo passo importante para facilitar a inversão do vaso sanguíneo é a remoção de qualquer tecido aderente e gordura com tesouras cirúrgicas. Invertendo a embarcação é feita cuidadosamente por aperto da pinça na extremidade oposta e, lentamente, invertendo o recipiente. Ao colocar a bolsa-corda suturas certifique-se de tocar a camada endotelial tão pouco quanto possível. Damage do endotélio pode resultar num fraco rendimento de células endoteliais viáveis ​​e acesso da mídia a digestão ao tecido subjacente. Isso também pode acontecer se o navio não está completamente fechada. O recipiente pode ser facilmente manuseado por pegá-la na extremidade de uma ligadura. Em casos específicos, pode ser aplicada uma modificação da técnica. Em vasos sanguíneos com um diâmetro pequeno às vezes é impossível para inserir uma pinça mosquito, a fim de inverter a embarcação. Uma solução consiste em colocar suturas de ancoragem numa extremidade do recipiente e empurrar as suas ligaduras através do vaso sanguíneo usando os fórceps. Na outra extremidade, em seguida, eles podem ser protegidos com um fórceps e puxada contra mosquitos, invertendo desse modo o vaso. Às vezes, o navio vai rasgar como consequência das suturas extras, por isso esta modificação não é a abordagem preferida. Outro problema que pode surgir é quando muitos eritrócitos estão presentes nas placas de cultura de sementeira em cima das células primárias. Isto pode ser o resultado delavagem insuficiente do vaso sanguíneo antes da digestão. Quando isto ocorre, a lavagem dos poços no dia 2 com HBSS quente é muitas vezes suficiente para remover a maioria dos eritrócitos. Em qualquer caso, os eritrócitos não persistirá na cultura e são perdidos Após passagem dos CaPECs. Os CaPECs isolados expressaram CD31, indicando que a população de células que foi digerida a partir do vaso sanguíneo é na verdade, de origem endotelial. Como foi recentemente publicado, este marcador é também expresso em células endoteliais a partir da válvula mitral canino 14. A formação de colónias em cultura indica as culturas começam a partir de qualquer células individuais ou de grupos de células pequenas. O crescimento rápido em mídia específica endotelial também é indicativo do tipo de célula correta. As células primárias podem ser cultivadas durante oito passagens, após o que as culturas cessar expansão. Esta é uma indicação de senescência e torna menos provável que as células-tronco / progenitoras são cultivadas com este protocol. Num ensaio de angiogénese, CaPECs a partir da aorta, a veia cava e veia porta mostrou ramificação dentro de 6 horas. Esta funcionalidade endotelial fornece sólida evidência para a sua origem. Com base na disponibilidade único material canino foi estudado, mas o método de isolamento tem aplicações possíveis para o isolamento de células endoteliais primárias humanas ou de células endoteliais a partir de outros organismos. A técnica também é possível para vasos muito pequenos (1 cm de comprimento), mas irá produzir menos células isoladas. Por esta razão CaPECs obtidas a partir de pequenos vasos exigirá uma passagem extra antes de terem atingido um número suficiente para experiências. A capacidade de executar o método de isolamento em pequenos vasos é uma grande vantagem para os estudos na doença vascular. ECs poderia ser isolado a partir de vasos doentes ou aberrantes como desvios portossistêmicos. Estes são vasos de ligação da veia porta e da circulação sistémica, que faz com que o sangue se desvie do fígado 2 </s-se&gt;. A derivação em si pode ser tão pequena quanto 1 cm. Comparando o ECs partir de um vaso shunt com células provenientes de uma veia veia e portal cava saudável poderia dar novas informações relevantes para o shunt-desenvolvimento desde a patogênese ainda não é totalmente compreendido. Além disso, novos genes angiogénicos poderia ser investigado em um nível funcional através da realização de modificações genéticas, como o silenciamento do gene siRNA mediada. Em conclusão, este novo método de isolamento pode ser um poderoso modelo para estudar doenças (congênitas) cardiovasculares, modelagem doença e (tumorais) angiogênese 15, 16.

Cães são usados como modelo animal grande para a pesquisa da doença cardiovascular e também podem sofrer de anormalidades vasculares (genéticas) inatos 1, 2. Para estudar estas doenças linhas de células endoteliais comerciais são muitas vezes utilizados para avaliar a funcionalidade das células endoteliais (CE). Para os cães que há uma linha de células endoteliais comercial disponível (CnAOEC), derivadas da aorta canino. Esta linha celular é usado principalmente em estudos como controlo normal ECs 3-5. Na pesquisa cardiovascular humano as linhas de células endoteliais mais utilizados são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e umbilical humano, Artéria células endoteliais (HUAECs) derivados da veia do cordão umbilical humano e artéria, respectivamente. HUVECs foram usados como o padrão de ouro na pesquisa vascular desde a década de 1980 6. Eles são considerados como sendo o sistema de modelo clássico para estudar a função endotelial e doença de adaptação. As células endoteliais isoladas a partir de diferentes vasos sanguíneos variam em appearance e funcionalidade devido às características genéticas e exposição ao microambiente 7. Além disso, células HUVEC e HUAECs são derivados a partir do cordão umbilical, uma estrutura vascular do desenvolvimento que não pode vasos sanguíneos adulto totalmente mímica com respeito às condições a que estão expostos e resposta à doença. Assim, traduzindo resultados encontrados em HUVECs e HUAECs a doenças cardiovasculares, em geral, é inadequada. Ao estudar a adaptação e comportamento do adulto ECs, ECs primários do vaso de interesse deve ser usado como uma abordagem mais direta. Para isolar estas células, vários métodos têm sido relatados. Um método amplamente descrito, que também é usada para HUVEC, é a lavagem do recipiente com uma solução de digestão enzimática 8. Isto muitas vezes resulta na contaminação com não-CEs, tais como células de músculo liso e de fibroblastos 9. Outro método frequentemente utilizado para o isolamento é a digestão enzimática do tecido navio picada seguido por fluorescence-de células activadas (FACS) com base no marcador de células endoteliais de Cluster de diferenciação (CD) 31 7, 8. separação por FACS e cultura de células subsequente requer quantidades relativamente grandes de células e, portanto, não é apropriado para o isolamento do endotélio de pequenos vasos sanguíneos. Por conseguinte, objectivo desenvolver um novo método robusto para isolamento de uma população pura de células endoteliais a partir de vários vasos sanguíneos caninos com elevado grau de pureza. Para testar a eficiência do novo método de isolamento, foram isoladas e obteve culturas puras Canine primária de células endoteliais (Capec) de diferentes artérias caninas e veias, grandes e pequenas. Este método também permite a cultura de células endoteliais provenientes do doente e / ou vasos aberrantes, tais como desvios portossistêmicos intra ou extra-hepáticas inatos, uma doença comum em cães 2. O método permite o isolamento de tipos de células relevantes adicionais do mesmo recipiente, tais como as células do músculo liso vascular, uma vez mais da embarcação permanece intagir durante o procedimento.

<table><tbody><tr><td>Collagenase type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Canine Endothelial Cells Growth Medium&amp;nbsp;</td><td>Cell Applications</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>CnAOECs</td><td>Cell Applications</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>iScript synthesis kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Freezing Medium</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Keep on ice prior to use</td></tr><tr><td>Freezing container, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps curved</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>polyglactin 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Automated counting chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides, Dual Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Slowly thaw on ice</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary endothelial cells from canine arteries and veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Vasos sanguíneos diferentes foram submetidas com sucesso para o protocolo de isolamento descrito (Figura 2). Foi possível dissecar e inverter aorta, veia cava, veia porta e artéria coronária em cães saudáveis ​​(todos os vasos de cada cão, n = 4). Com os mesmos ECs abordagem foram isolados a partir de dois desvios portossistêmicos congênitos (extra-hepáticas e intra-hepática, n = 1 cada). Embora aorta foi facilmente invertida, segmentos da aorta torácica foram mais desafiador do que aorta abdominal. Em segmentos da aorta torácica tem muitas artérias intercostais ramificação a partir dele, que precisam de ser ligada individualmente para assegurar a exposição estritamente endotelial para a solução de digestão. O segmento dissecada da veia cava caudal incluído o ponto de ramificação das veias renais, que precisavam ser ligado antes da inversão. Para a veia portal do ramo contribuindo do gastroduodenalis cava foi ligada antes da inversão do vaso sanguíneo. o coronary artéria em cães é um vaso sanguíneo muito menor (aproximadamente 1 - 2 mm de diâmetro num cão de tamanho médio), a partir do qual a excisão de um segmento da artéria circunflexa. Porque tem um diâmetro pequeno, ele provou ser mais fácil para inverter uma bastante curto segmento de 1 cm, porque as pinças mosquito não pode ser inserido muito mais longe. pós isolamento células aderidas um dia eram visíveis na placa de cultura. Em cultura, CaPECs tinha uma forma poligonal e exibida uma tendência para crescer em placas, como mostrado na Figura 3 numerosas colónias de células endoteliais pode ser observada. 3 - 6 dias após o isolamento. Depois de aproximadamente 10 dias em cultura uma confluência de 80% foi atingido e células podia ser ultrapassado. Em média, as culturas endoteliais primárias poderiam ser mantidos por um período máximo de 8 passagens (uma vez por semana a uma taxa de divisão de 1: 4) em que ponto eles pararam de crescer. Isolacélulas endoteliais Ted expresso endotelial CD31 marcador de células, tal como indicado por qPCR (Figura 4). A expressão em células endoteliais derivadas da aorta, da veia cava, e veia porta a partir de quatro cães foi comparada com uma cultura de controlo CnAOECs. As células primárias em cultura tinha uma expressão de CD31 comparável com o controlo de ECs (Kruskall-Wallis, p = 0,856). CaPECs derivadas da aorta, a veia cava e veia porta mostrou ramificação após a incubação de 6 horas no slide angiogénese tal como mostrado na Figura 5. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig1.jpg" /> Figura 1: Dissecando e invertendo vasos sanguíneos para o isolamento de células endoteliais. A) O vaso sanguíneo de interesse é removido assepticamente a partir de um cadáver canino fresco. B) do tecido aderente e / ou de gordura em torno do vaso deve ser removed cuidadosamente com uma tesoura cirúrgica, sem danificar o próprio (canino veia cava, segmento abdominal de 5 cm). C navio) Com curvas forceps Halsted Mosquito, o navio pode ser introduzido sem perfurar a camada endotelial. DG) Fixe a pinça na outra extremidade do vaso sanguíneo e suavemente retrair, invertendo assim completamente o vaso sanguíneo. A camada endotelial é agora do lado de fora do recipiente. H) suturas em bolsa de são colocados nas extremidades de fecho para fora da superfície não endotelial do vaso invertido. I) O vaso sanguíneo é transferida para um tubo de 50 mL para lavagem e digestão subsequente. Barras de escala indicam 2 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: Vessels invertido, de origem diversa. A) Um segmento aorta invertida (cão saudável). B) Uma veia porta invertida (cão saudável). C) Um segmento da veia cava invertido (cão saudável). D) Um segmento da artéria coronária invertida (cão saudável). E) Um invertida shunt portossistêmico extra-hepática derivada de um terrier Cairn (idade: 6 semanas de idade). F) um desvio portossistêmico intra-hepático invertida derivada de um wolfhound irlandês (idade: 8 semanas de idade). Barras de escala indicam 2 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig3.jpg" /> Figura 3:.. Morfologia celular imagens foram tiradas duas semanas após a digestão dos vasos FR A) ECs derivadoaorta om canino na passagem 2. B) ECs derivadas de veia cava canino na passagem 2. C) ECs derivadas de veia porta canino na passagem 2. Todas as imagens são tiradas com uma ampliação de 4X originais. As barras de escala indicam a 500 uM. Inserir mostra aumento de 10x. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig4.jpg" /> Figura 4: Gene Expression de CD31. A expressão de CD31 em células endoteliais em uma passagem derivadas da aorta, da veia cava, e veia porta (n = 4 cães). Não foram observadas diferenças significativas entre a expressão CaPECs eo CnAOECs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig5.jpg" /> Figura 5:. Angiogenesis fotografias de CnAOECs e CaPECs de aorta, veia cava e veia porta após incubação de 6 horas em um slide de angiogênese (20x). Formação Branch é visível após 6 horas em b) CaPECs cultura. A) CnAOECs. Derivadas de aorta. C) CaPECs derivadas de veia cava. D) CaPECs derivado de veia porta. Todas as células foram na passagem 3. As barras de escala indicam 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GOI </td><td> Direção </td><td colspan="2"> 5&#39;-Sequence-3 &#39; </strong&gt; </td><td> Tm de recozimento </td><td> Tamanho do produto (pb) </td><td> número Genebank </td></tr><tr><td> CD31 </td><td> para a frente </td><td colspan="2"> GTTCTGCGTGTCAAGGTG </td><td> 59 ° C </td><td> 85 </td><td> XM_005624261.1 </td></tr><tr><td></td><td> Reverso </td><td colspan="2"> TGTCCTTCCCAAACTCCA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> beta-actina </td><td> para a frente </td><td colspan="2"> GATATCGCTGCGCTTGTGGTC </td><td> 58 ° C </td><td> 384 </td><td> NM_001195845 </td></tr><tr><td></td><td> Reverso </td><td colspan="2"> GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> RPS19 </td><td> para a frente </td><td colspan="2"> CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG </td><td> 63 ° C </td><td> 95 </td><td> XM_005616513 </td></tr><tr><td></td><td> Reverso </td><td colspan="2"> GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B2MG </td><td> para a frente </td><td colspan="2"> TCCTCATCCTCCTCGCT </td><td> 63 ° C </td><td> 85 </td><td> AB745507 </td></tr><tr><td></td><td> Reverso </td><td colspan="2"> TTCTCTGCTGGGTGTCG </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: qPCR Primer Define iniciadores de qPCR para genes de referência caninos e CD31..

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

isolation-culture-primary-endothelial-cells-from-canine-arteries

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K visualizações.  Utrecht University. Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Vídeo: Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Biologia

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the reduced long-term patency compared to arterial conduits. The abrupt increase of hemodynamic stress associated with the graft arterialization results in vascular damage, especially the endothelium, that may influence the low patency of the saphenous vein graft (SVG). Here, we describe the isolation, characterization, and expansion of human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). Cells isolated by collagenase digestion display the typical cobblestone morphology and express endothelial cell markers CD31 and VE-cadherin. To assess the mechanical stress influence, protocols were used in this study to investigate the two main physical stimuli, shear stress and stretch, on arterialized SVGs. hSVECs are cultured in a parallel plate flow chamber to produce shear stress, showing alignment in the direction of the flow and increased expression of KLF2, KLF4, and NOS3. hSVECs can also be cultured in a silicon membrane that allows controlled cellular stretch mimicking venous (low) and arterial (high) stretch. Endothelial cells' F-actin pattern and nitric oxide (NO) secretion are modulated accordingly by the arterial stretch. In summary, we present a detailed method to isolate hSVECs to study the influence of hemodynamic mechanical stress on an endothelial phenotype.

We describe a protocol to isolate and culture human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). We also provide detailed methods to produce shear stress and stretch to study mechanical stress in hSVECs.

Isolamento de Células Endoteliais da Veia Samá Humana e Exposição a Níveis Controlados de Tensão de Cisalhamento e Estiramento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Medicina

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolamento e Cultura de Pericitos Cerebrais Primários: Um Procedimento para Isolar e Cultivar Pericitos de Capilares Cerebrais Bovinos Sem Contaminação de Células Endoteliais

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...