The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.

Ética declaración: Los vasos sanguíneos utilizados en este estudio fueron cosechadas como material excedente obtenido a partir de cadáveres caninos frescas (n = 4) de los perros sanos sacrificados para otras investigaciones no relacionado (política de la Universidad 3R). vasos sanguíneos anormales (derivación portosistémica intra y extrahepáticas, n = 1 cada uno) fueron cosechadas después de la muerte tras el consentimiento informado de los propietarios de los perros presentados a la Clínica Universitaria de Animales de Compañía de la Universidad de Utrecht. 1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales primaria canina <ol><li> Pre-coat placas de 6 pocillos con 2 ml / pocillo 0,5% w / v de gelatina y se deja durante 2 horas en una incubadora con una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Eliminar el exceso de solución de gelatina antes de la siembra de las células primarias. </li><li> Asépticamente eliminar el vaso sanguíneo (s) de interés (por ejemplo, aorta, vena cava, la vena porta) de un fresco canino cadáver (Figura 1A). Mantener la anatomía del sistema de vasosmediante la colocación de pinzas rectas en ambos extremos del vaso de interés. Evitar la manipulación innecesaria de tejido con unas pinzas para evitar daños en las células endoteliales. <ol><li> Cortar el recipiente sujetado en ambos extremos con tijeras quirúrgicas y retirar del cadáver. Transporte en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en hielo. NOTA: A la eslora del buque de aproximadamente 5 cm es el preferido para este procedimiento, pero los que miden 1 cm también proporcionará suficientes células para la cultura. </li></ol></li><li> Transferir el vaso sanguíneo a una placa de Petri llena de HBSS enfriado con hielo. Usando tijeras quirúrgicas, eliminar cualquier tejido adherente y la grasa de la parte exterior del recipiente, manteniendo el recipiente en sí intacta (Figura 1B). Asegúrese de que el buque es claramente visible en todo momento cuando se corta: tirar de un lado el tejido circundante con una pinza o una pinza para la visión óptima. <ol><li> Cierre todas las ramas de la embarcación con ligaduras (por ejemplo, poliglactina 3-0) y posteriormente eliminarloscon unas tijeras quirúrgicas o un bisturí. </li></ol></li><li> Introducir cuidadosamente un extremo recipiente con un fórceps curvos mosquito Halsted, sujete la punta de las pinzas en el otro extremo del recipiente y luego retraer, invirtiendo lentamente el recipiente hasta que esté completamente dentro hacia fuera (Figura 1C-G). El exterior ahora consiste en la capa de células endoteliales. Si cualquier dificultad se encuentra en la inversión del recipiente, sumergir en HBSS de nuevo para reducir la fricción. </li><li> Coloque suturas en bolsa de tabaco en ambos extremos de la vasija para cerrarla completamente y para evitar la exposición de cualquier tejido vascular no endotelial para el procedimiento de digestión (Figura 1H). Usa los extremos de ligadura para manipular el recipiente invertido. </li><li> Si la digestión y la cultura se lleva a cabo más tarde, criopreservar el recipiente invertido antes de la digestión de protocolo (paso 1.7). <ol><li> Coloque el recipiente invertido en un criovial y se llenan de cultivo celular medio de congelación. Congelar hasta -80 ° C utilizando un co congelaciónntainer. Almacenar a -80 ° C, si los barcos se van a utilizar dentro de una semana. Para el almacenamiento a largo plazo, en lugar crioviales -180 ° C. Al realizar el aislamiento CE, descongelar los crioviales rápidamente en un baño de agua (37 ° C) y colocar inmediatamente en HBSS enfriado con hielo. Proceder como se indica en 1.7. NOTA: Tenga en cuenta que el rendimiento total de los CE después del aislamiento será más bajo debido a la pérdida de viabilidad durante el proceso de congelación. </li></ol></li><li> Transferir el buque a un tubo de 50 ml y enjuague dos veces en HBSS para eliminar los eritrocitos (o medio de congelación residual en caso de descongelación) (Figura 1I). </li><li> Digerir el recipiente en un tubo de 50 ml con una solución de 30 ml de colagenasa tipo II (0,15 U / ml) y dispasa (0,15 U / ml) en células caninas medio de crecimiento endotelial (CECGM) durante 1 hora a 37 ° C con suave intermitente agitación. </li><li> Retire el recipiente del tubo y centrifugar la suspensión celular durante 5 minutos a 250 x g. </li><li> Resuspender el sedimento celular en un CECGMnd semilla de 2 ml de suspensión celular por pocillo (1 - 3 pozos dependiendo del tamaño del recipiente). Cultivar las células a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 en aire y el cambio del medio de cultivo dos veces por semana. </li><li> El paso de las células cuando una confluencia del 70 - 80% se alcanza. <ol><li> Lavar las células con HBSS precalentado para eliminar las células muertas o no inscritos. Añadir 200 enzima de disociación celular recombinante l (1x) a cada pocillo y colocar de nuevo en la incubadora durante 5 min o hasta que se separan todas las células. </li><li> Transferir las células a un tubo de 15 ml y dejar de tripsinización añadiendo 10 ml de medios de cultivo (CEGM) incluyendo 10% suero fetal de ternera (FCS). Centrifugar durante 5 min a 250 x g. Continuar la cultura en una placa de gelatina pre-recubiertos o frasco. </li></ol></li></ol> 2. Caracterización <ol><li> Cultura células endoteliales aórticas canina (CnAOECs) y comparar la morfología de las líneas de células primarias y comerciales dos veces por semana con un microscopio. NOTA: Tlo típico patrón de crecimiento en los EC parches mejor se puede observar cuando se alcanza una confluencia de&gt; 70%. <ol><li> Cultura CnAOECs en CECGM en un matraz T75 0,5% w / v de gelatina pre-revestido. células de paso una vez a la semana cuando la confluencia puede alcanzar el 70 - 80%. <ol><li> Para los pases, se lavan las células una vez con HBSS precalentado y añadir 1 ml de la enzima de disociación celular recombinante (1x). Colocar el matraz de nuevo en la incubadora durante 5 min o hasta que se separan todas las células. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo 10 ml (CEGM) que incluye 10% de FCS. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 250 xg, descartar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo 1 ml. </li><li> Tomar una parte alícuota de 10 l de la suspensión de células y diluir 1: 1 con 0,4% de azul de tripano. Contar las células usando un contador de células automatizado y se resiembra 4,0 x 10 5 células viables en un nuevo matraz T75. Añadir 10 ml de CECGM pre-calentado al matraz y la cultura a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. </li></ol></li></ol></li><li> Aislar el ARN del paso 1 de los CaPECs cultivadas y CnAOECs. <ol><li> Recoge al menos 1 x 10 3 células como un gránulo, añadir 20 l de reactivo de preparación de la muestra (SPR) y se incuba durante 1 min para lisar las células. Después de la incubación, recoger cuidadosamente el lisado celular que contiene el ARN total y se almacena a -70 ° C. </li></ol></li><li> Convertir ARNm en ADNc usando un kit de síntesis de ADNc (por ejemplo, iScript) siguiendo las instrucciones del fabricante. ADNc se almacena a 4 ° C durante hasta una semana, oa -20 ° C a largo plazo hasta que esté listo para realizar la qPCR. </li><li> Medir la expresión génica de la CD31 marcador endotelial para confirmar el origen de las células endoteliales. Realice la configuración experimental y cuantificación utilizando las directrices de actas MIQE 10. Para la normalización, medir la expresión de genes de referencia GAPDH, rps19, y B2MG 11. <ol><li> Preparar una dilución de 10 veces del cDNA obtenido en agua libre de nucleasa. </li><li> Prepararuna dilución de 4 veces a partir de muestras de cDNA mancomunados a la línea estándar y el uso de agua libre de nucleasa como un control sin plantilla. Diluir las muestras cinco veces para llegar a un total de dilución de 50 veces para las reacciones de qPCR. Pipeta de 10 l reacciones por duplicado en un formato de 384 pocillos usando 4 l de cDNA y 6 l del fluoróforo se mezcla con 20 pmol de cebador directo y reverso (Tabla 1). </li><li> Configurar el programa para 95 ° C durante 5 min para la activación de la polimerasa Taq, seguido por 39 ciclos de 10 segundos a 95 ° C para la desnaturalización, y 30 seg a Tm para el recocido y elongación. La Tm para cada conjunto de cebadores se muestra en la Tabla 1. </li><li> Ejecutar un análisis de curva de fusión después de cada carrera que exista un sólo producto se amplifica. Normalizar los niveles de expresión de las muestras usando la cantidad relativa media de los genes de referencia, y calcular el Ct si la eficiencia de reacción está entre 95% y 105%. </li></ol></li><li> Evaluar la funcionalidad CE con un angiogenesis ensayo. <ol><li> Añadir 10 l de matriz extracelular a cada pocillo de un portaobjetos de angiogénesis pre-enfriado y extender con una punta de pipeta para cubrir la superficie del pozo. Mantener la matriz extracelular en hielo y evitar la introducción de burbujas de aire en el gel. Solidificar el gel mediante la colocación de la corredera en una placa de Petri con agua empapada toallas de papel en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 durante 30 min. </li><li> Añadir 1,0 x 10 4 primaria EC en 50 l de Crecimiento Endotelial de medio por pocillo. Incubar el portaobjetos durante 6 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Después de 6 horas tomar fotografías con una ampliación de 20X, asegurándose de incluir todo el bien en la imagen. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

En los estudios que se centran en los EC canina de la línea primaria CnAOEC se utiliza para modelar los linajes endoteliales del perro 3, 12, 13. En estudios en humanos, la cultura HUVEC todavía se considera el estándar de oro. Claramente, centrándose simplemente en ECs derivadas de cordón umbilical es una restricción firme en la investigación cardiovascular. Las células endoteliales tienen un patrón de expresión de genes específicos para determinar la especificación arteriovenosa. Con el fin de dar cuenta de estas diferencias en los vasos postnatales presentamos este nuevo método de aislamiento basado en la ubicación anatómica específica de las células endoteliales. Los métodos comúnmente utilizados para el aislamiento primario CE son rubor el recipiente con una solución enzimática o picado el buque antes de la digestión, dos métodos que ambos tienen un riesgo de contaminación con los no-EC. Hemos establecido una técnica para el aislamiento de células caninas primaria endoteliales (CaPECs) con una menor probabilidad de contaminación que también puede ser usado en vasos pequeños. Este aislamiento método de las células endoteliales se basa en la inversión de la embarcación, lo que evita la digestión de todos los otros tipos de células del vaso. Es importante para eliminar los vasos asépticamente, como se ilustra en la Figura 1A, para evitar la contaminación bacteriana o fúngica de los cultivos endoteliales. En el caso del crecimiento bacteriano un agente antimicrobiano adicional (por ejemplo, gentamicina) se puede añadir al medio de cultivo. En caso de tratamiento de la infección fúngica a menudo no tiene éxito en nuestra experiencia. Para que la inversión para tener éxito, es fundamental para obtener un buque que es de aproximadamente 5 cm de longitud. Un segundo paso importante para facilitar la inversión del vaso sanguíneo es la eliminación de los tejidos adherentes y grasa con tijeras quirúrgicas. Invirtiendo el recipiente se hace con cuidado mediante la sujeción de las pinzas en el extremo opuesto e invirtiendo lentamente el recipiente. Al colocar la bolsa de tabaco suturas asegúrese de tocar la capa endotelial lo menos posible. Damage del endotelio puede resultar en un pobre rendimiento de células endoteliales viables y el acceso de los medios de digestión para el tejido subyacente. Esto también puede ocurrir si el buque no está completamente cerrada. El recipiente puede ser fácilmente manejado por recogerlo al final de una ligadura. En casos específicos una modificación de la técnica se puede aplicar. En los vasos sanguíneos con un diámetro pequeño a veces es imposible insertar una pinza mosquito con el fin de invertir el recipiente. Una solución es colocar suturas en un extremo de la embarcación y empujar a sus ligaduras a través del vaso sanguíneo utilizando los fórceps. En el otro extremo que a continuación se pueden asegurar con una pinza mosquito y tiró, invirtiendo así la embarcación. A veces, el recipiente se rompa como consecuencia de las suturas adicionales, por lo que esta modificación no es el enfoque preferido. Otro problema que puede surgir es que muchos eritrocitos están presentes en las placas de cultivo sobre la siembra de las células primarias. Esto puede ser el resultado deinsuficientes de lavado del vaso sanguíneo antes de la digestión. Cuando esto ocurre, lavar los pocillos en el día 2 con HBSS caliente es a menudo suficiente para eliminar la mayoría de los eritrocitos. En cualquier caso, los eritrocitos no persistirán en la cultura y se perdió en los pases de los CaPECs. Los CaPECs aislados expresan CD31, lo que indica que la población de células que se digirió desde el vaso sanguíneo es de hecho de origen endotelial. Como recientemente publicado, este marcador también se expresa en las células endoteliales de la válvula mitral canino 14. La formación de colonias en cultivo indica las culturas empiezan desde cualquiera de las células individuales o de pequeños grupos de células. El rápido crecimiento endotelial en los medios de comunicación específica también es indicativo del tipo de célula correcta. Las células primarias se pueden cultivar durante ocho pasajes, después de lo cual los cultivos dejan de expansión. Esto es una indicación de la senescencia y hace que sea menos probable que las células madre / progenitoras son cultivadas con este protocolumna. En un ensayo de angiogénesis, CaPECs de la aorta, la vena cava y la vena porta mostraron ramificación dentro de 6 horas. Esta funcionalidad endotelial proporciona evidencia sólida de su origen. Sobre la base de la disponibilidad fue estudiado único material canino, pero el método de aislamiento tiene posibles aplicaciones para el aislamiento de células endoteliales primarias humanas o células endoteliales de otros organismos. La técnica también es posible para los vasos muy pequeños (1 cm de longitud), pero dará lugar a células menos aislados. Por esta razón CaPECs obtenidos a partir de los vasos pequeños requerirán un paso adicional antes de que hayan alcanzado un número suficiente para los experimentos. La capacidad de realizar el método de aislamiento en vasos pequeños es una gran ventaja para los estudios en la enfermedad vascular. EC puedan ser aislados de vasos enfermos o aberrantes como derivación portosistémica. Estos son los vasos que conectan la vena porta y la circulación sistémica que provoca que la sangre evite el hígado 2 </sarriba&gt;. La derivación en sí mismo puede ser tan pequeño como de 1 cm. La comparación de los EC de un vaso de derivación con células procedentes de una vena cava y el portal de la vena sana podría dar nueva información relevante para la derivación de desarrollo desde la patogénesis todavía no se entiende completamente. Además, los nuevos genes angiogénicos podrían ser investigados a nivel funcional mediante la realización de modificaciones genéticas tales como el silenciamiento de genes mediada por siRNA. En conclusión, este nuevo método de aislamiento puede ser un poderoso modelo para el estudio de las enfermedades cardiovasculares (congénitos), modelado de la enfermedad, y (tumorales) angiogénesis 15, 16.

Los perros se utilizan como gran modelo animal para la investigación de enfermedades cardiovasculares y también pueden sufrir de anomalías congénitas vasculares (genéticos) 1, 2. Para estudiar estas enfermedades líneas de células endoteliales comerciales a menudo se utilizan para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales (CE). Para los perros hay una línea de células endoteliales comercial disponible (CnAOEC), derivado de la aorta canino. Esta línea celular se utiliza sobre todo en los estudios como el control normal de los EC 3-5. En la investigación cardiovascular humano las líneas de células endoteliales más comúnmente utilizadas son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y de la arteria umbilical humana Las células endoteliales (HUAECs) derivadas de la vena umbilical humana espinal y la arteria, respectivamente. HUVECs se han utilizado como el estándar de oro en la investigación vascular desde la década de 1980 6. Ellos son considerados como el sistema clásico modelo para estudiar la función endotelial y la adaptación de la enfermedad. Las células endoteliales aisladas de diferentes vasos sanguíneos varían en appearance y funcionalidad debido a antecedentes genéticos y la exposición al microentorno 7. Además, HUVECs y HUAECs se derivan de cordón umbilical, una estructura vascular del desarrollo que no pueden vasos sanguíneos adulto completamente imitan con respecto a las condiciones que se exponen a y la respuesta a la enfermedad. Por lo tanto, la traducción de los resultados encontrados en las HUVEC y HUAECs de enfermedades cardiovasculares en general es insuficiente. Cuando se estudia la adaptación y comportamiento de los adultos EC, EC primarias del vaso de interés deben utilizarse como un enfoque más directo. Para aislar estas células, se han descrito varios métodos. Un método ampliamente descrito, que también se utiliza para HUVECs, está vaciando el recipiente con una solución de digestión enzimática 8. Esto a menudo resulta en la contaminación con no ECs tales como las células de músculo liso y fibroblastos 9. Otro método utilizado frecuentemente para el aislamiento es la digestión enzimática de tejido de vasos picada seguido de por fluorescenciade células activadas (FACS) basado en Cluster marcador de células endoteliales de diferenciación (CD) 31 7, 8. FACS clasificación y cultivo celular posterior requiere cantidades relativamente grandes de las células y por lo tanto no es adecuado para el aislamiento de endotelio de los vasos sanguíneos pequeños. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un nuevo método robusto para aislar una población pura de células endoteliales de diversos vasos sanguíneos caninos con alta pureza. Para probar la eficacia del nuevo método de aislamiento, se aislaron y se obtuvieron cultivos puros Canine primaria de células endoteliales (CAPEC) de diferentes arterias y venas canino, tanto grandes como pequeñas. Este método también permite que el cultivo de células endoteliales procedentes de enfermo y / o vasos aberrantes tales como derivaciones portosistémicas intra o extra-hepáticos congénitos, una enfermedad común en los perros 2. El método permite el aislamiento de tipos de células relevantes adicionales de la misma embarcación, tales como células de músculo liso vascular ya que la mayoría de la embarcación permanece intactuar durante el procedimiento.

<table><tbody><tr><td>Collagenase type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Canine Endothelial Cells Growth Medium&amp;nbsp;</td><td>Cell Applications</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>CnAOECs</td><td>Cell Applications</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>iScript synthesis kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Freezing Medium</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Keep on ice prior to use</td></tr><tr><td>Freezing container, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forceps curved</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>polyglactin 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Automated counting chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides, Dual Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Slowly thaw on ice</td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary endothelial cells from canine arteries and veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Diferentes vasos sanguíneos se sometieron con éxito para el protocolo de aislamiento descrito (Figura 2). Fue posible diseccionar e invierta aorta, vena cava, la vena porta y la arteria coronaria de perros sanos (todos los buques de cada perro, n = 4). Con los mismos ECs de aproximación se aislaron a partir de dos derivación portosistémica congénita (extrahepática y intrahepática, n = 1 cada uno). Aunque aorta se invierte fácilmente, los segmentos de aorta torácica eran más desafiante que la aorta abdominal. En segmentos torácicos la aorta tiene muchas arterias intercostales de ramificación de ella, que deben ser ligado individualmente para asegurar una exposición estrictamente endotelial a la solución de la digestión. El segmento disecado de vena cava caudal incluido el punto de las venas renales, que necesitaban ser ligó antes de la inversión de ramificación. Para la rama de la vena porta el contribuyente de la vena gastroduodenalis se ligó antes de la inversión de los vasos sanguíneos. el coronary arteria en perros es un recipiente mucho más pequeño de sangre (aproximadamente 1 - 2 mm de diámetro en un perro de tamaño medio), de la que extirpados un segmento de la rama circunfleja. Debido a que tiene un diámetro pequeño, que resultó ser más fácil de invertir un segmento más bien corto de 1 cm debido a que las pinzas de mosquito no se podrían insertar mucho más allá. Un día posterior aislamiento células adheridas fueron visibles en la placa de cultivo. En cultivo, CaPECs tenía una forma poligonal y se muestra una tendencia a crecer en parches como se muestra en la Figura 3 numerosas colonias de células endoteliales se pudieron observar 3 -. 6 días después del aislamiento. Después de aproximadamente 10 días en cultivo se alcanzó una confluencia del 80% y las células podría ser superado. En promedio, los cultivos endoteliales primarias podrían mantenerse durante un máximo de 8 pasajes (una vez por semana a una tasa de división de 1: 4) momento en el que dejaron de crecer. Isolacélulas endoteliales expresan ted endotelial CD31 marcador de células como se indica por qPCR (Figura 4). La expresión en las células endoteliales derivadas de aorta, vena cava, y vena porta de cuatro perros se comparó con un cultivo de control de CnAOECs. Las células en cultivo primario tenían una expresión de CD31 comparable con el control ECS (Kruskall-Wallis, p = 0,856). CaPECs derivadas de aorta, la vena cava y vena porta mostraron ramificación después de la incubación de 6 horas en la diapositiva de la angiogénesis como se muestra en la Figura 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig1.jpg" /> Figura 1: La disección de los vasos sanguíneos e invirtiendo para el aislamiento de células endoteliales. A) El vaso sanguíneo de interés se retiró asépticamente de un cadáver canino fresco. B) El tejido adherente y / o la grasa que rodea el recipiente debe ser removed cuidadosamente con unas tijeras quirúrgicas sin dañar el propio buque (canina de la vena cava, segmento abdominal de 5 cm). C) con un curvados fórceps Halsted mosquito, el recipiente se puede introducir sin perforar la capa endotelial. DG) Asegure la pinza en el otro extremo del vaso de sangre y suavemente retraer, de ese modo invertir completamente el vaso sanguíneo. La capa endotelial está ahora en el exterior del recipiente. H) suturas en bolsa de tabaco se colocan en los extremos de cierre de la superficie no endotelial del vaso invertido. I) El vaso sanguíneo se transfiere a un tubo de 50 ml para el lavado y la digestión posterior. Las barras de escala indican 2 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2: Los buques invertida de diferente origen. A) Un segmento de aorta invertida (perro sano). B) Una vena porta invertida (perro sano). C) Un segmento de vena cava invertida (perro sano). D) Un segmento de la arteria coronaria invertida (perro sano). E) Un invertida derivación portosistémica extrahepática derivado de un terrier de mojón (edad: 6 semanas de edad). f) una derivación portosistémica intrahepática invertida derivado de un perro lobo irlandés (edad: 8 semanas de edad). Las barras de escala indican 2 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig3.jpg" /> Figura 3:.. Morfología celular fotos fueron tomadas dos semanas después de la digestión de los vasos fr) EC derivadosaorta om canina en el paso 2. B) EC derivado de la vena cava canina en el paso 2. C) EC derivados de la vena porta canina en el paso 2. Todas las imágenes se toman con 4X aumento original. Las barras de escala indican 500 micras. Insertar muestra aumento de 10X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig4.jpg" /> Figura 4: Expresión génica de CD31. La expresión de CD31 en las células endoteliales en el paso 1 derivadas de aorta, vena cava, y vena porta (n = 4 perros). No se observaron diferencias significativas entre la expresión y la CaPECs CnAOECs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54786/54786fig5.jpg" /> Figura 5: La angiogénesis. Las fotografías de CnAOECs y CaPECs de la aorta, la vena cava y la vena porta después de una incubación de 6 horas en una diapositiva de la angiogénesis (20 aumentos). Formación de ramas es visible después de 6 horas en B CaPECs cultura. A). CnAOECs) derivadas de aorta. C) CaPECs derivados de la vena cava. D) CaPECs deriva de la vena porta. Todas las células se encontraban en el paso 3. Las barras de escala indican 1 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54786/54786fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GOI </td><td> Dirección </td><td colspan="2"> Secuencia 5 &#39;-3&#39; </strong&gt; </td><td> recocido tm </td><td> Tamaño del producto (bp) </td><td> número de banco de genes </td></tr><tr><td> CD31 </td><td> Adelante </td><td colspan="2"> GTTCTGCGTGTCAAGGTG </td><td> 59 ° C </td><td> 85 </td><td> XM_005624261.1 </td></tr><tr><td></td><td> Marcha atrás </td><td colspan="2"> TGTCCTTCCCAAACTCCA </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> beta-actina </td><td> Adelante </td><td colspan="2"> GATATCGCTGCGCTTGTGGTC </td><td> 58 ° C </td><td> 384 </td><td> NM_001195845 </td></tr><tr><td></td><td> Marcha atrás </td><td colspan="2"> GGCTGGGGTGTTGAAAGTCTC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> RPS19 </td><td> Adelante </td><td colspan="2"> CCTTCCTCAAAAAGTCTGGG </td><td> 63 ° C </td><td> 95 </td><td> XM_005616513 </td></tr><tr><td></td><td> Marcha atrás </td><td colspan="2"> GTTCTCATCGTAGGGAGCAAG </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B2MG </td><td> Adelante </td><td colspan="2"> TCCTCATCCTCCTCGCT </td><td> 63 ° C </td><td> 85 </td><td> AB745507 </td></tr><tr><td></td><td> Marcha atrás </td><td colspan="2"> TTCTCTGCTGGGTGTCG </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: conjuntos de cebadores qPCR primers qPCR de referencia genes caninos y CD31..

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Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.2K vistas.  Utrecht University. Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

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Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Aislamiento de células endoteliales valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Inmunología e Infección

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the reduced long-term patency compared to arterial conduits. The abrupt increase of hemodynamic stress associated with the graft arterialization results in vascular damage, especially the endothelium, that may influence the low patency of the saphenous vein graft (SVG). Here, we describe the isolation, characterization, and expansion of human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). Cells isolated by collagenase digestion display the typical cobblestone morphology and express endothelial cell markers CD31 and VE-cadherin. To assess the mechanical stress influence, protocols were used in this study to investigate the two main physical stimuli, shear stress and stretch, on arterialized SVGs. hSVECs are cultured in a parallel plate flow chamber to produce shear stress, showing alignment in the direction of the flow and increased expression of KLF2, KLF4, and NOS3. hSVECs can also be cultured in a silicon membrane that allows controlled cellular stretch mimicking venous (low) and arterial (high) stretch. Endothelial cells' F-actin pattern and nitric oxide (NO) secretion are modulated accordingly by the arterial stretch. In summary, we present a detailed method to isolate hSVECs to study the influence of hemodynamic mechanical stress on an endothelial phenotype.

We describe a protocol to isolate and culture human saphenous vein endothelial cells (hSVECs). We also provide detailed methods to produce shear stress and stretch to study mechanical stress in hSVECs.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Medicina

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales primarios: un procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...