We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. transcrição in vitro <ol><li> Linearizar pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / ou vetores pCS2-mCherry-CAAX por restrição NotI enzima digerir 31. Utilizando um kit de ARN in vitro a transcrição, gerar produtos 5 &#39;de ARNm tapados de cada molde, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Purifica-se o ARNm utilizando um kit tapados purificação. Siga as instruções do fabricante. Eluir com livre de RNase H 2 O. </li><li> Determinar a concentração de ARN por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. (OD 260 x diluição x 40 ug / ml). </li><li> Diluir o RNA a 100 ng / mL para cada H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX com RNase 2 O. Se a concentração de ARN é muito baixa, a fluorescência será diminuído ou ausente. amostras brilhantes vai diminuir as preocupações sobre a fototoxicidade e fotodegradação. Por outro lado, o excesso de ARN podem ser tóxicos e / ou causar efeitos fora do alvo. Nota: guarde o restantemRNA purificado de -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Criação de peixe-zebra, colheita de embriões, e mRNA Injection 36-38 <ol><li> Montar tanques de criação com uma barreira para separar o tanque em duas regiões e encher cada tanque de criação com água sistema de aquicultura utilizados na instalação de peixe-zebra. </li><li> A fim de evitar a reprodução prematura, coloque dois peixes machos em um lado da barreira e dois peixes feminina do outro lado da noite antes de produzir. </li><li> No dia seguinte, descongelar a mistura previamente preparada de ARNm em gelo. Substitua a água em tanques de criação com água sistema de aquicultura frescos e remover as barreiras. Imediatamente após as barreiras são puxados, aquecer um molde de injecção de 28,5 ° C e configurar o equipamento para microinjecção. Nota: Para obter informações sobre moldes de injeção, consulte Gerlach 36. </li><li> Recolher os ovos a cada 10 - 15 minutos utilizando um coador de chá e lavar os ovos em um 100 x 15 mm de prato limpo Petri com E3 Azul (5 mM de NaCl, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33, MgSO4 0,33 mM, 10 -5% azul de metileno). E3 azul é utilizado para evitar o crescimento de fungos e garantir o correcto desenvolvimento de larvas de peixes. Para mais informações sobre o acasalamento e de colheita de embriões, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37. </li><li> Incorporar uma célula-encenado embriões num molde de injecção aquecido e injectar o ARN na gema no valor desejado de embriões (Figura 1A). Conta de morte embrionária natural e embriões não fertilizados por realizar injeções embrionárias em 15% mais embriões do que o necessário para o experimento. Para detalhes adicionais sobre a microinjeção de embriões de peixe-zebra, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37. NOTA: Para uso pela primeira vez de mRNA, realizar uma análise de dose-curva para determinar a dose ideal para a fluorescência e viabilidade (definida como ausência de defeitos de desenvolvimento brutas até 5 dpf) antes da realização de imagiologia 5D. 150-200 ng / ulinjectado em embriões é muitas vezes a concentração óptima, portanto, é um bom ponto de partida para a concentração final. </li><li> Cuidadosamente extrair os embriões injectados desde o molde usando uma versão modificada 9 &quot;pipeta de Pasteur de vidro. Para modificar a pipeta, derreter a fim usando um bico de Bunsen até formar uma bola. </li><li> Coloque embriões injetados em um prato de 100 x 15 mm Petri na E3 azul e casa em um C incubadora de 28,5 °. </li><li> Seis horas após a injecção, retire todos os embriões mortos ou não fertilizados das placas e adicionar E3 azul limpo. Casa dos embriões em 28,5 ° C. </li></ol> 3. Preparação e incorporação da Vivo embriões Zebrafish for Imaging (Figura 1B) <ol><li> Duas horas antes de imagem, a tela de embriões injectados para GFP, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente. Coloque embriões verdes brilhantes que expressam GFP em uma nova placa de 100 mm x 15 Petri com E3 Azul. </li><li> Levar à ebulição uma solução de stock de 1% de agarose de baixa de fusão através da adição de 1 g de agarose a baixo ponto de fusão a 100 ml de E3 azul. Depois de usar a agarose, cobrir o balão com folha de alumínio. A solução permanece útil para até um mês. </li><li> Aliquota de 3 ml de agar derretido em um tubo de cultura de 17 x 100 mm. Manter a quente de agarose, colocando o tubo de cultura em um banho de água a 42 ° C até que esteja pronto para uso. Preparar uma solução de 15 tricaina mM em água deionizada para anestesiar os embriões de peixe-zebra 36. NOTA: Se imagiologia em pontos de tempo anteriores é desejada, a concentração de ágar pode ser diminuída tão baixo quanto 0,3% 39. </li><li> Trazer o mM tricaina 15, embriões selecionados, baixo agarose fundido, E3 Azul, e uma 35 milímetros lamela de vidro cultura fundo prato para um microscópio de luz dissecção. Remova cuidadosamente córion do embrião com # 5 pinças. Faça isso por três embriões. </li><li> Colocar os embriões dechorionated num recipiente separado a ser anestesiado. A tampa da placa de fundo lamela é frequentemente utilizado para este fim. Usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas (cerca de 150 mL)tricaina de 15 mM para o prato de 5 ml E3 azul (se utilizar a tampa da lamela prato inferior) ou até os embriões foram suficientemente anestesiados. Além disso, adicionar 3-4 gotas (cerca de 150-200 ul) de 15 mM de solução tricaina ao tubo de agarose fundida a 1%. </li><li> Usando uma pipeta de p200 com 1 cm da ponta da pipeta cortada; transferir os embriões anestesiados para o prato de fundo lamela. Remova qualquer E3 Azul excesso: solução tricaina. </li><li> Lentamente, adicionar 5 - 10 jul de agarose de baixo ponto de fusão: solução tricaina ao longo dos embriões, mantendo cada gota separada para assegurar que os embriões não acidentalmente deriva perto um do outro. Aviso: Se a agarose é muito quente, ele irá danificar o embrião. Uma boa temperatura para manter o agar é a 42 ° C. </li><li> Usando uma agulha de 21 G 1 ½, gentilmente orientar o embrião no agarose para a posição desejada. Ao usar um microscópio invertido para geração de imagens de lapso de tempo, oriente a região de interesse (ROI) tão perto da lamela como possible. Nota: Para fins gerais, a região da cauda oferece facilidade de orientação e clareza devido ao tecido relativamente fino (Figura 1A). Outros tecidos, tais como a camada epitelial em torno das pregas de gema e de aleta, pode ser utilizada 28,29. Estes tecidos oferecem grande clareza, no entanto estas regiões são apenas algumas camadas de células de espessura. Para o propósito deste protocolo, é benéfico para a imagem região da cauda para adquirir como muitas divisões celulares quanto possível. </li><li> Permitir que um min poucos para a solidificação parcial do ágar. Usar a agulha para separar um pequeno pedaço de ágar para testar a sua solidificação. Quando um pedaço de agar pode ser puxado para fora da gota, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Cobrir toda a lamela com baixa agar fundido formando uma cúpula sobre os embriões embutidos. Permitir que o agar solidificar antes de mover o prato para imagiologia confocal (Figura 1A). </li><li> Durante o processo de solidificação de agar (demora cerca de 10 min), 3 ml de o prepararf E3 solução azul com cinco gotas de (aproximadamente 250 ul) tricaina 15 mM a ser colocada sobre os embriões incorporados durante o exame. </li></ol> 4. 5D Imagem Confocal de US Jogos de embriões Zebrafish 40,41 NOTA: Ver Ariga 40 e O&#39;Brien 41 para detalhes sobre como realizar imagem 5D usando outros sistemas confocal. Para Z-intervalo, Z-pilha, profundidade Z, intervalo de tempo, e definições 5D ver Figura 1C. <ol><li> Abra o software de imagem e definir o microscópio para 60X NA 1.4 lente objetiva. Aplicar óleo de imersão para a lente objetiva e coloque o prato de cultura no compartimento de slides no palco microscópio. Usando o controlador de eixo, o centro do embrião de interesse acima da lente objectiva e trazer a lente objectiva para cima ao encontro do prato de cultura. </li><li> Clique no ícone da parte do olho e mudar para o filtro GFP no microscópio. Concentre-se no ROI. Centrando-se no tecido mais próximo da lamela será offer os melhores resultados de imagem. </li><li> Remova o encravamento. Selecionar os canais de GFP e mCherry (comprimentos de onda pré-estabelecidos em software) e definir a linha de opção ao normal média. </li><li> Use &quot;Controles de Ver / Aquisição / A1 Área de Digitalização&quot; comando para abrir a ferramenta A1 Área de Digitalização. </li><li> Iniciar a digitalização. Usando o eixo-controlador, posicionar o embrião de modo que a área de leitura é preenchido com tanto do peixe-zebra quanto possível. A potência do laser não precisa de ser óptima a este ponto. Diminuir a potência do laser para evitar a fotodegradação desnecessário. </li><li> Use os &quot;Controles de Ver / Aquisição / aquisição ND&quot; comando para abrir o painel de controle de aquisição da ND. </li><li> Iniciar a digitalização para definir os parâmetros Z-stack. Defina o limite superior Z-stack para onde as células não estão em foco e limite inferior para onde as células não são mais visíveis. Permitir um espaço de 3 micrómetros acima da amostra para o crescimento e o movimento celular, o que pode expandir-se para o campo de imagem. O Z-stack para as figuras mostradas neste proprotocolo cobriu uma Z-profundidade de 40 mm na cauda do embrião. </li><li> Defina o tamanho do Z-interval passo para 2 mm. Em média, uma célula é de 10 um de diâmetro; portanto, 2 m vai produzir cinco intervalos de dados de imagem a ser analisada para cada célula. NOTA: A profundidade da imagem que pode ser adquirida depende do intervalo Z. resolução Z é sacrificado para ganhar profundidade total na dimensão Z, a fim de imagem como muitas células que sofrem mitose possível (grande profundidade Z). O inverso é verdadeiro, na medida em que, ao diminuir o tamanho do passo, a resolução Z é adquirida, enquanto Z profundidade é sacrificado (pequena profundidade Z). </li><li> Ajustar a potência do laser de imagem, HV, e compensar os níveis. Para os experimentos demonstraram neste protocolo, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar níveis fixados nos níveis correspondentes, respectivamente, para o canal de GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Para o canal mCherry, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar os níveis, respectivamente; 3-6, 120-140, e -3 para-8. Uma vez que os parâmetros são definidos, desligue a varredura para evitar a exposição a laser desnecessário que pode causar fototoxicidade e fotodegradação da amostra. </li><li> Selecione o ícone de média linha de 2x. &quot;Não média&quot; produz uma imagem granulada enquanto &quot;linha 4x média&quot; aumenta drasticamente o tempo de verificação. Uso de linha 2x média proporciona a melhor qualidade de imagem e tempo mais rápido de digitalização. </li><li> Seleccione a duração do intervalo de tempo e tempo adequados necessários para o experimento. Para divisões de tipo selvagem, os intervalos de tempo de dois minutos durante 2 horas é o melhor para determinar a duração mitótico (utilizados nas Figuras 1, 2, 3A e 3B). Divisões que activam o ponto de verificação para a montagem do eixo mais longo do que 30 minutos são mais adequados para intervalos de cinco minutos, durante quatro horas, a fim de preservar a fluorescência como demonstrado na Figura 3C. </li><li> Marque a caixa &quot;salvar em arquivo&quot; e nome do arquivo para salvar automaticamente o arquivo tal como ele está sendo adquirido. verifique todos os patros estão definidos corretamente e clique em &quot;começar a correr&quot;. </li><li> Após a aquisição for concluída, para exibir o arquivo em um formato tridimensional, clique no ícone do limiar de volume. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A utilização deste método permite inferir colapso nuclear de envelope, a formação de uma placa de metafase por anexos microtubule-cinetocoro, e a segregação de cromatídeos irmãos para formar duas novas células in vivo e de um modo dependente do tempo. A capacidade de observar a mitose no peixe-zebra é vantajosa em relação a amostras fixadas e sistemas de cultura de células porque as células estão a ser trabalhada na fisiologia natural, o tecido é transparente, o que permite que as proteínas fluorescentes a serem utilizados, eles desenvolvem relativamente rápido, e imagiologia em tempo desfasado podem ser adquiridos. Uso de peixe-zebra adulto para este protocolo é restrito devido ao Z-profundidade limitada que pode ser adquirido devido ao tecido mais grosso que não é a pele ou olhos. Enquanto os animais transgénicos que expressam H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX poderia ser utilizado para o mesmo fim, a versatilidade e a facilidade de as injecções de ARNm em diferentes peixe-zebra mutante é vantajoso sobre cruzamentos genéticos. Em situações em que a análise é mitóticorequerido em três dias após a fertilização (DPF) ou embriões mais tarde, os animais transgénicos seria necessário, devido à meia-vida de ARN neste organismo em rápido desenvolvimento. Outras proteínas fluorescentes para visualizar a mitose são passíveis de este protocolo. Por exemplo, H2B-GFP ARNm é uma alternativa ao H2A.F / Z-EGFP para a cromatina, e fornece rotulagem semelhante. Outras proteínas fluorescentes etiquetadas que podem ser utilizados nesta técnica incluem POM121, Centrin, EB1, Hec1 e EMTB que permitiria imagens ao vivo em embrião dos microtúbulos envelope nuclear, Centríolos, além de ponta, kinetochore, e microtúbulos, respectivamente 32,47-51. Este protocolo tem várias etapas-chave de imagem que devem ser executadas para alcançar resultados de qualidade: 1) Certifique-se de otimizar a qualidade mRNA e concentração para produzir a fluorescência brilhante e nenhuma toxicidade possível. Quanto mais fluorescência levará a uma menor exposição à radiação laser e, portanto, menos photobleaching e fototoxicidade. 2) O embrião deve ser completamente anestesiados e seguro no agar. movimentos menores irá alterar os resultados e poderia arruinar a experiência. 3) A concentração de ágar deve ser apropriado para o estágio de embrião desejado a ser trabalhada. Aos 24 HPF e ainda, 1% de agarose de baixo ponto de fusão é adequado. Se de imagens em 12 hpf ou mais cedo, uma solução de agarose a 0,3% deve ser utilizado 39. 4) O ROI no embrião deve ser tão próxima quanto possível da lamela. Esta etapa não se limitar um a imagem da cauda. Os olhos, pele, região dorsal, gema, e dobre fin são exemplos de outras áreas que podem utilizar este protocolo. O tempo é o fator determinante que separa este protocolo a partir de embriões ou tecidos de imagem fixa. Ao configurar o Z-stack, Z-intervalo, o intervalo de lapso de tempo, e duração de lapso de tempo, é importante ter em mente o contexto do experimento (Figura 1C). A divisão celular do tipo selvagem normalmente dura cerca de 25 min a 24 hpf. em thé exemplo, a 2 mm Z-interval cobrindo 40 mm de tecido em um Z-stack, com um intervalo de tempo dois minutos para duas horas provou ser eficaz. Além disso, em embriões com a mitose defeituoso, as células em uma paragem da mitose provavelmente irá estar presente, drasticamente aumentando os tempos de divisão celular. Para adquirir várias divisões completas, o tempo de duração deve ser aumentada, ou seja, a partir de 2 h a 4 h. Um tempo de aquisição mais longo vai expor a amostra a mais potência do laser e aumentar o risco de fotobranqueamento e fototoxicidade. Neste caso, o intervalo de tempo entre cada Z-pilha deve ser aumentada. movimentos de cromossomos dinâmicas serão sacrificados, aumentando o intervalo de tempo entre Z-stacks, mas tempo de duração é adquirida. Isto é necessário quando imagiologia de divisões celulares, que pode durar mais de duas horas. Embora não tenha sido discutido directamente, este protocolo pode ser optimizado para obter uma imagem de maior resolução, no plano z para visualizar com maior precisão MO cromossomavements. Por exemplo, na Figura 4A dois cromossomas missegregated são observados. O cromossomo para a direita (observado pela seta grossa) é inicialmente brilhante e em foco, mas escurece nos últimos quadros. Com um Z-2 um intervalo, o cromossoma uncongressed cai entre o Z-intervalo. Capturando os movimentos hora e eventos cromossómicas singulares pode ser conseguido através do aumento da resolução no plano z. Para fazer isso, aumentar o zoom em uma célula individual usando a ferramenta A1 Área de Digitalização. Ao configurar os parâmetros empilhar-Z, use uma distância menor Z-intervalo. A faixa recomendada é 0,5-1 m. Além disso, diminuindo o intervalo de tempo entre cada pilha Z vai criar transições suaves entre cada intervalo de tempo, ou seja, a partir de dois minutos e 30 segundos - 1 min. Uma ressalva a este tipo de imagem é o Z-profundidade limitada que pode ser alcançado. Devido ao intervalo de Z-intervalo e tempo menores, mais o tecido vai ser exposto aos lasers em um intervalo de tempo menor. Para superar isto, SMAller tempo de duração pode ser utilizada; no entanto, este também é dependente de quanto tempo o pesquisador gostaria de capturar divisões. Uma analogia que pode ajudar com essas modificações é pensar de um Z-stack como um acordeão. A distância entre cada dobra do fole é a Z-intervalo e a profundidade Z é representado pelo comprimento do acordeão. Em um caso em que não se poderia pretender incorrer em qualquer exposição mais de laser para a amostra, como os trechos de acordeão (aumenta a profundidade Z), a distância entre as pregas do fole (Z-intervalo) deve aumentar também. O inverso é verdadeiro no que à medida que os contratos de acordeão, a profundidade Z diminui. As pregas do fole contrato, bem como, correspondendo a um decréscimo em z-intervalo. Esta analogia pode ser aplicado a amostras fixadas e vivas. A complexidade é aumentada neste protocolo, quando o tempo é adicionado à equação. Há uma quantidade finita de tempo que o sanfoneiro pode estender ou contrair o acordeão. este represents o intervalo de tempo. A fim de cobrir uma distância (profundidade Z) o intervalo de tempo deve aumentar. Como assim, a fim de ouvir mais música, deve-se ouvir por um longo período de tempo (tempo de duração) Em termos deste protocolo, a fim de testemunhar mais divisões celulares, o tempo de duração deve aumentar. Um fator de composição para manter em mente é que, quanto mais a música que é tocada, o mais cansado do acordeonista. Isto é análogo à dimensão final, a fluorescência. A exposição mais de laser da amostra é dado, mais fotodegradação e fototoxicidade (cansaço) torna-se um problema. Em resumo, este protocolo detalha um método para visualizar a mitose em um embrião do peixe-zebra vivo aplicável a diferentes análises; 1) número de divisão 2) por divisão de tempo 3) o destino divisão e 4) a dinâmica da cromatina de alta resolução. Múltiplas possibilidades de visualização de componentes mitóticas que vão desde acessórios de microtúbulos-kinetochore para centríolo dinâmica pode ser aplicada. Combinando a capacidade demitose imagem in vivo com os recentes avanços na edição genoma no peixe-zebra irá tornar mais fácil para gerar mutantes em vários aspectos da mitose para modelar doenças humanas em um organismo vertebrado 25,26,52-56.

A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões ao fim-on fixação dos microtúbulos e forças de tensão orientar os cromossomos que formam uma placa metafásica 1. Se todos os cromossomos estão ligados corretamente, o ponto de verificação de montagem do fuso é satisfeito, anéis coesina segurando as cromátides irmãs em conjunto são clivados, e microtúbulos encurtar a puxar irmãchromatids para pólos opostos durante anaphase 2,3. A fase final, telofase, envolve o alongamento da célula e reformação do envelope nuclear em torno dos dois novos núcleos. A citocinese completa o processo de divisão, separando o citoplasma das duas células filhas novas 4-6. Alteração das vias principais de mitose (ou seja, ponto de verificação de montagem do fuso, a duplicação centrossoma, irmã chromatid coesão, etc.) Pode resultar em prisão metaphase, segregação errada dos cromossomas e instabilidade genômica 7-10. Em última análise, os defeitos nas vias mitose controle pode causar distúrbios do desenvolvimento e câncer, necessitando de visualização de mitose e seus defeitos em um, animal vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16. embriões de peixe-zebra servir como um grande organismo modelo para imagens ao vivo devido ao tecido transparente, facilidade de microinjeção, e desenvolvimento rápido. Usando peixes-zebra, o objetivo geral deste artigo é o dedescrevem um método de 5D vivo (dimensões X, Y, Z, tempo, e comprimento de onda) imagiologia de mitose 17 (Figura 1C). O uso de peixe-zebra mutante defeituoso em diferentes vias mitóticas demonstram a consequência de tais defeitos. Para este protocolo, Aurora B e ESCO2 mutantes foram escolhidos para ilustrar esses defeitos. Aurora B é uma cinase que é parte do complexo do cromossoma de passageiros (CPC) envolvida na formação do fuso e do acessório de microtúbulos. Ele também é necessário para a formação de clivagem sulco na citocinese 18,19. Em peixe-zebra, a deficiência de Aurora B leva a defeitos de indução sulco, citocinese, e segregação cromossomo 20. ESCO2, por outro lado, é uma acetiltransferase que é essencial para a irmã cromatídeos coesão 21,22. Ele acetila cohesin na parte SMC3 do anel estabilizando assim cohesin para garantir a segregação cromossômica adequada na transição metaphase-anaphase 23. Perda de ESCO2 no peixe-zebra leva ao chsegregação errada romosome, irmã separação prematura chromatid, instabilidade genômica e dependente de p53 e apoptose independente 24,25. Devido à disponibilidade, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante (doravante referida como aurB m / m e ESCO2 m / m, respectivamente) será usada para ilustrar esta técnica 25-27. Acoplamento microscopia confocal com maquinaria da célula fluorescente marcado com permitiu visualizar os investigadores a cromatina e a dinâmica da membrana celular durante a mitose 25,28,29. histonas fluorescentes etiquetadas têm sido historicamente usado para visualizar cromatina. As histonas são proteínas nucleares compostas por quatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, e H4), que são responsáveis ​​pela estrutura do nucleossoma que compõe 30 cromossomas. Enquanto H2B é indiscutivelmente a histona mais utilizado para proteínas fluorescentes emrato e a cultura de células, a utilização de Histona 2A, Z Família (H2A.F / Z) revelou-se bem para o uso em peixes-zebra 31,32. Concanavalina A e de caseína-quinase 1-gama por exemplo, localizar na membrana celular e que tenham sido previamente mostrado eficaz em visualizar a membrana celular em Drosophila e ouriços-do-mar 33,34. Outros estudos têm mostrado que a proteína fluorescente marcado com CAAX rotula a membrana celular e foi bem sucedido em peixes-zebra 31. CAAX é um motivo que é reconhecida por enzimas modificadoras de pós-traducionais tais como farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modificações por estas enzimas proteínas causar a tornar-se associada a membrana, rotulagem, assim, a membrana da célula 35. Devido ao uso prévio no peixe-zebra, este protocolo escolheu usar H2A.F / Z e CAAX para rotular cromatina e da membrana celular. A aplicação do presente método permitirá que o investigador para monitorar a mitose ao nível da célula individual ao observar cromossomadinâmica, como monitorar bem como, simultaneamente múltiplas divisões celulares que podem afetar a diferenciação e desenvolvimento do tecido. Este artigo irá se concentrar em imagiologia a dinâmica da segregação dos cromossomos durante a mitose no nível da célula individual. Dentro deste manuscrito, a capacidade de observar várias divisões mitóticas, calcular o tempo de divisão, e decifrar os fenótipos mitóticas serão ilustradas e discutidas. Ao usar estes parâmetros, fisiologicamente relevantes de dados pode ser recolhido e aplicado a vários estados de doenças afectadas por defeitos mitóticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

A mitose é essencial para o crescimento do organismo e diferenciação. O processo é muito dinâmico e requer ordenou eventos para realizar a condensação adequada cromatina, o apego microtúbulos-kinetochore, segregação cromossômica, e citocinese em um pequeno período de tempo. Erros no delicado processo pode resultar em doenças humanas, incluindo defeitos de nascença e câncer. As abordagens tradicionais investigam estados de doença mitótico humanos muitas vezes dependem de sistemas de cultura celular, que não têm a fisiologia natural e contexto de desenvolvimento / específicas do tecido vantajoso quando estudar doenças humanas. Este protocolo supera muitos obstáculos, fornecendo uma forma de visualizar, com alta resolução, a dinâmica de cromossomos em um sistema de vertebrados, o peixe-zebra. Este protocolo irá detalhar uma abordagem que pode ser usada para obter imagens dinâmicas de células em divisão, que incluem: a transcrição in vitro, produção de peixe-zebra / registo, a incorporação de embrião e de imagem time-lapse. Otimização e modifications deste protocolo também são explorados. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas cromatina) e mCherry-CAAX (membrana celular etiquetas) embriões com injecção de mRNA, mitose em AB-tipo selvagem, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante é visualizado. Alta resolução de imagem ao vivo no peixe-zebra permite observar várias mitoses quantificar estatisticamente defeitos mitóticas e tempo de progressão da mitose. Além disso, a observação de aspectos qualitativos que definem processos inadequados de mitose (ou seja, defeitos congression, segregação errada dos cromossomas, etc.) e os resultados cromossômicas imprópria (isto é, a aneuploidia, poliploidia, micronúcleos, etc.) são observados. Este ensaio pode ser aplicado para a observação de tecido diferenciação / desenvolvimento e é receptivo à utilização de peixe-zebra mutante e agentes farmacológicos. Visualização de como defeitos na mitose levar a distúrbios de câncer e de desenvolvimento será muitomelhorar o entendimento da patogênese da doença.

A Figura 2 demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares utilizando uma ampla visão de campo de um tipo selvagem de cauda de peixe-zebra AB. Mais de sete células mitóticas são gravadas em um prazo de 14 min (Filme 1). Dentro de duas horas tempo de curso, mais de 40 eventos de mitose foram capturados. Em média, 50 células em divisão foram observados no AB e 30 células que se dividem em AUR B M / m embriões (Figura 2B). Para ter em conta o número de células trabalhada, a proporção de células mitóticas com o número de células fotografadas foi calculado (Figura 2C). Estes dados sugerem que não há um menor número de células que atravessam a mitose nas aur B M / m embriões (Figura 2B), mas um menor número de células a ser trabalhada. A capacidade de adquirir um número estatisticamente significativo de eventos, como isso vai ajudar no poder estatístico. A Figura 3 expande-se sobre esta técnica para incluir quantificar duração mitótico. Depois de uma sessão de lapso de tempo é adquirido, uma célula individual pode ser analisado pelo tempo gasto na mitose com a resolução adequada, utilizando a ferramenta de zoom (Figura 3A, B). duração mitótico é calculado manualmente, contando quantos intervalos de tempo levar até uma divisão celular. O número de intervalos de tempo é então multiplicado pelo intervalo de tempo entre cada Z-pilha. Por exemplo, na Figura 3C, a divisão levou-se 12 intervalos de tempo e o intervalo de tempo entre cada Z-pilha foi de 2 min. Portanto, o tempo de divisão para esta célula foi de 24 min. O tempo médio de divisão de tipo selvagem AB é de 25 min e 58 min para aurB m / m (Figura 3B). Uma divisão de tempo prolongado, como visto na aurB m / m sugere que o posto de montagem do fuso não foi satisfeita devido a vacas erradaanexos tochore 1,2. Dando uma olhada mais de perto no zoom em embriões de tipo selvagem, cada fase mitótico pode ser distinguido (Figura 3C, Movie 2). Além disso, os defeitos de mitose pode ser observado na aurB m / m embrião que incluem a paragem da mitose e a citocinese não resultando em uma célula binucleadas e subsequente formação de um micronúcleo (Figura 3D, filme 3). Este ampliada análise mostrando defeitos mitóticas apoia a divisão de tempo aumentou adquirida na Figura 3B. Vários outros defeitos diversificada de mitose e destinos celulares que podem ser encontrados são exploradas na Figura 4; demonstrada na ESCO2 + / M e ESCO2 m / m embriões. Numa ESCO2 + / embrião m, movimentos cromossómicas erradas são capturados e pode ser definido como defeito congressions. defeitos Congression ocorrer quando anexos microtúbulos impróprias são feitas. Estes defeitos causará falha dos cromossomos para migrar em direção à placa metafásica. cromátides irmãs emparelhados, particularmente identificáveis ​​min 20 e 46, que não tenham congressed em direção à placa metafásica pode ser observada pela primeira vez em min 14. Anaphase início separa as cromátides irmãs alinhados na placa metafásica, bem como as cromátides irmãs emparelhados para a direita, observados no minuto 50. Além disso, é possível a formação de micronúcleos é observado como estes cromátides irmãs separadas permanecem isoladas fora do núcleo (T = 50, Figura 4A, filme 4). Na Figura 4B, uma divisão multipolar está visualizado (Filme 5). Divisões multi-polares ocorrem frequentemente devido à amplificação do centrossoma, mas pode ocorrer através de outros meios 42. Na Figura 4C, um m / m celular ESCO2 demonstra inicialmente irmã prematura chromatid separation eo eixo de rotação 9,43,44. Outro destino celular demonstrado neste painel é uma ponte anaphase em que anexos merotelic não estão resolvidas 45,46. A ponte anaphase pode ser visto pela primeira vez no minuto 62. A cromatina parece prematuramente decondense enquanto a célula está passando por citocinese. Medida que ocorre a citocinese, o sulco de clivagem colide com os cromossomas descondensada e, como ocorre abscisão, puxa o material de cromatina para formar uma ponte de anafase (Figura 4C, Filme 6). Embora não seja mostrado aqui, a fim de quantificar os destinos celulares, gravar todas as divisões mitóticas em cada quadro e do tipo de célula destino eles exibem. Dividir o número de células em cada destino ao número total de divisões gravadas e multiplicar por 100 para calcular a percentagem de destino celular. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig1.jpg" /> Figura 1: Protocolo de desenhos de contorno. (UMA) </strong&gt; Desenho esquemático da progressão técnica de imagem a partir das injeções CAAX-mCherry mRNA H2A.F / Z-GFP e, em seguida, para a incorporação de embriões e procissão para microscopia confocal. (B) Desenho esquemático do processo de embrião incorporação. Os embriões injectados deve ser dechorionated e anestesiados. Os embriões são então transferidos para o prato lamela de fundo e o excesso de azul de E3 é removido. agar baixo ponto de fusão é usado para criar cúpulas separadas relativas a cada embrião. Orientar os embriões de modo que o caudal é o mais próximo de lamela. Aguarde dois minutos antes da adição de agar cobrindo toda a lamela. Aguarde até que o ágar é solidificada antes de se mudar para a imagem. (C) Desenho esquemático para definir os termos Z-intervalo, Z-stack, profundidade Z, intervalo de tempo, tempo de duração e 5D que são usados ​​no protocolo e discussão. Z-intervalo é definido como a distância entre cada imagem como o microscópio move-se mais profundamente na amostra para criar um Z-pilha. Z-stack é todas as imagens tomadas através de umamostra no Z-intervalo definido. A distância percorrida em um Z-stack define o Z-depth. intervalo de tempo é a quantidade de tempo entre um Z-stack e no próximo Z-stack para criar uma imagem time-lapse. tempo de duração é a quantidade total de tempo utilizado para a imagem. 5D é definida como as dimensões X, Y, Z, tempo e emissão fluorescente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig2.jpg" /> Figura 2. Time-Lapse de imagem Captura Múltiplos Eventos mitóticas em um embrião de peixe-zebra ao vivo. (A) alambiques de lapso de tempo de uma experiência ampliada para fora em um tipo selvagem AB, 24 peixes-zebra hpf mostrando vários eventos de mitose. Os asteriscos apontam para sete células em mitose. T = tempo decorrido em minutos. Barra de escala = 5 m. (B) O número de ce mitóticolls observados em AB e aurB m / m caudas de peixe-zebra a 24 HPF. A média ± st. dev., n = 3 embriões / genótipo. (C) A proporção de células mitóticas por número total de células em AB e aurB M / M caudas de peixe-zebra a 24 HPF. A média ± st. dev., n = 3 embriões / genótipo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig3.jpg" /> Figura 3. célula individual Análise Capturas cada fase de mitose e mitótico Duração. (A), numa célula seleccionada entre o grande campo de visão AB de tipo selvagem, 24 HPF embrião do peixe-zebra mostrado na Figura 2A. (B) Tempo Divisão é observado para AB e aurB m / m células e calculada a partir inferir bre envelope nuclearakdown (NEB) na primeira observação de cromatina condensada numa célula para formação de duas novas células filhas. n = 3 embriões / genótipo, n = 66 divisões para AB, n = 29 divisões para aurB m / m, *** p &lt;0,001. células do tipo selvagem (C) AB é cortada para visualizar a progressão fase por meio de mitose . t = min. Barra de escala = 5 uM. (D) aurB m / m célula é cortada para visualizar a progressão mitótico através de mitose que inclui paragem da mitose resultando em falha citocinese e formação de micronúcleos. As setas apontam para a micronúcleos. T = tempo decorrido em minutos. Scale bar = 5 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig4.jpg" /> Figura 4.Single Cell imagens ao vivo Captura múltiplos defeitos mitóticos Associados com Chromosome Segregação e Divisão em mitótico Mutant Peixe-zebra. (A) imagem de uma célula sofrer defeitos congression em um ESCO2 + / m embrião Um cortada. A seta fina monitora o cromossomo esquerda que é puxado de volta para a placa metafásica. A seta grossa monitora o cromossomo direito que não é puxado de volta para a placa metafásica e inferido para formar um micronúcleos. A seta dupla mostra a separação do cromossomo direito que não o Congresso no início anaphase. Inserções mostram ampliada vistas dos cromossomos que falharam ao Congresso. Inserções foram cortadas e melhor luminosidade para melhor visualização. CAAX fluorescência foi removido para visualizar os cromossomas mais facilmente. Barra de escala = 5 uM. (B) Uma imagem de uma célula cortada passando por paragem da mitose que resulta em uma divisão multipolar num ESCO2 </em&gt; + / M embrião. Barra de escala = 5 m. (C) Uma imagem recortada de uma célula sofrer fadiga coesão resultando em anaphase formação de ponte visto pelo thread-como puxar entre os dois núcleos apontadas pelos suportes. Barra de escala = 5 uM. t = tempo decorrido em minutos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">Filme 1. divisões celulares múltiplos podem ser visualizados em uma visão ampla de um embrião de peixe-zebra com injecção de tipo selvagem</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">(clique direito para fazer o download).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie2.jpg"/&gt; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">Filme 2. Fases da mitose pode ser facilmente visualizado em um embrião de peixe-zebra de tipo selvagem</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">(r</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">ight clique para baixar).</a> Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e prossegue em direção congression das cromátides irmãs para formar uma placa metafásica . segregação precisa ocorre e produz duas novas células filhas. <img alt="filme 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">Filme 3. Imagens ao vivo da</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">aurB m / m embrião revela cromossomo falta</a>egregation, falhou citocinese, e formação de micronúcleos (clique direito para fazer o download). desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo, cromossomos espalhar para pólos opostos incapazes de formar uma placa metafásica adequada, e prossiga para girar sobre o eixo estendendo-se a divisão tempo da célula. A citocinese não ocorre, resultando numa célula 4N e múltiplos micronúcleos. <img alt="filme 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie4.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">Filme 4. defeitos Congression são observados em um</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">ESCO2 + / m embrião (clique direito para fazer o download).</a> Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo. Depois de a placa de metafase é formado, alguns INDIcromossomos indivi- espalhar para os lados. Um cromossoma para a esquerda, eventualmente, é puxado de volta para a placa metafásica enquanto o cromossomo para a direita permanece fora da placa metafásica e pode ser visto separando cromatídeos irmãos no início da anáfase. A célula exibe uma divisão de tempo prolongado, mas divide finais com potencial formação de micronúcleos. <img alt="filme 5" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">Filme 5.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">divisão multi-polar é observado em um ESCO2 + m embrião / (clique direito para fazer o download).</a> Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e, em seguida, os cromossomos se fundem para formar um indicativ em forma de Ye de pólos 3-fuso. A célula exibe uma divisão de tempo prolongado, mas, em última análise se divide em 3 células filhas. <img alt="filme 6" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie6.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">Filme 6.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">irmã prematura separação chromatid e formação de ponte anaphase são observados em um ESCO2 m / m embrião (clique direito para fazer o download).</a> Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e, em seguida, os cromossomos se espalham por toda a célula incapaz de formar um placa metafásica adequada. A cromatina decondenses antes da citocinese e como a célula se divide, cria uma ponte anafase entre as duas células.

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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11.9K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Vídeo: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...