We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

תמלול 1. במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל 31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 &#39;כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- mRNA כתרים באמצעות ערכת טיהור. עקוב אחר ההוראות של היצרן. Elute עם H RNase ללא 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של RNA על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. (OD 260 x דילול x 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את RNA ל 100 ng / μl עבור כל H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX עם RNase ללא H 2 O. אם ריכוז RNA הוא נמוך מדי, את הקרינה תפחת או נעדר. דגימות בהירות תקטנה את חשש phototoxicity ואת photobleaching. מצד השני, גם RNA הרבה יכול להיות רעיל ו / או לגרום מחוץ תופעות יעד. הערה: אחסן את הנותריםmRNA מטוהר במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. גידול דג זברה, אוסף עובר, הזרקת mRNA 36-38 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב טנקי רבייה עם מחסום להפריד הטנק לשני אזורים וממלאים כל אקווריום רבייה במי מערכת מדגה בשימוש במתקן דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע רבייה בטרם עת, הנח שני דג זכר בצד אחד של המחסום ושני דגים נקבה בצד השני אמש רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להפשיר את התערובת mRNA הכין בעבר על הקרח. החלף את המים במיכלים רבייה במי מערכת מדגה טריים להסיר את המחסומים. מייד לאחר המחסומים נמשכים, לחמם עובש הזרקה ל -28.5 מעלות צלזיוס, להגדיר את הציוד עבור microinjection. הערה: לקבלת מידע על תבניות להזרקה, עיין גרלך 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים כל 10 - 15 דקות באמצעות מסננת תה ולשטוף את הביצים לתוך צלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי נקי באות E3 כחול (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ&quot;מ, 0.33 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ 4 MgSO, 10 -5% מתילן כחול). E3 הכחול משמש למניעת גידול פטרייתי ולהבטיח התפתחות תקינה של דגי זחל. לקבלת מידע נוסף על הזדווגות ואיסוף עובר, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבץ חד-תאים מבוימים עוברת בתוך תבנית הזרקה חממה ולהזריק את הרנ&quot;א בחלמון בסך הרצוי של עוברים (איור 1 א). חשבון למוות עוברי טבעי עוברים מופרים על ידי ביצוע זריקות עובריות ב -15% יותר עובר מדרוש לצורך הניסוי. לפרטים נוספים על microinjection של עוברי דג הזברה, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. הערה: לשימוש לראשונה של mRNA, מבצע ניתוח מנה-עקום כדי לקבוע את המינון האופטימלי עבור קרינה ואת הכדאיות (המוגדרת אין פגמים התפתחותיים ברוטו עד 5 DPF) לפני ביצוע הדמית 5D. 150 - 200 ng / μlמוזרק לעוברים הוא לעתים קרובות הריכוז האופטימלי, ולכן הוא נקודת התחלה טובה עבור הריכוז הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחלץ את העוברים המוזרקים מהתבנית בעזרת פיפטה פסטרה זכוכית 9 &quot;שונה. כדי לשנות את פיפטה, להמס את הסוף באמצעות מבער בונזן עד שנוצר כדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עוברים מוזרקים בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ב E3 הכחול ובית C חממת 28.5 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש שעות לאחר הזרקה, להסיר כל עוברים מתים או מופרים מהצלחות ולהוסיף נקי E3 הכחול. בית העוברים על 28.5 ° C. </li></ol> 3. הכנה והטבעה של עוברי דג הזברה חי הדמיה (איור 1B) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי שעות לפני ההדמיה, להקרין את העוברים המוזרקים עבור GFP באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון. מניחים עוברים GFP להביע ירוק בהיר בצלחת 100 x חדש 15 מ&quot;מ פטרי עם E3 כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים פתרון המניות של agarose נמוכה להמיס 1% על ידי הוספת 1 גרם של נמוכה להמיס agarose ל -100 מ&quot;ל של E3 כחול. לאחר שימוש agarose, מכסה את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. הפתרון המניה נשאר שימושי עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 3 מ&quot;ל של אגר מומסת לתוך צינור תרבות 17 x 100 מ&quot;מ. שמור על חם agarose על ידי הנחת צינור תרבות באמבט מים C ° 42 עד מוכן לשימוש. הכן פתרון 15 מ&quot;מ Tricaine במים deionized כדי להרדים את עוברי דג הזברה 36. הערה: אם ההדמיה קודמת זמן נקודות היא רצויה, הריכוז אגר ניתן ירד נמוך כמו 0.3% 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את 15 מ&quot;מ Tricaine, עוברים הוקרן, נמוכה להמיס agarose, E3 כחול, וצלחת תרבות התחתונה coverslip זכוכית 35 מ&quot;מ עד מיקרוסקופ אור לנתיחה. מוציאים בזהירות את של סיסית העובר עם פינצטה 5 #. האם זה במשך שלושה עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים dechorionated במיכל נפרד כדי להיות מורדם. המכסה של המנה coverslip התחתונה משמשת לעתים קרובות למטרה זו. בעזרת פיפטה העברה, להוסיף שלוש טיפות (כ 150 μl)של 15 מ&quot;מ Tricaine כדי בצלחת של כחול 5 מ&quot;ל E3 (אם באמצעות המכסה של צלחת coverslip למטה) או עד עוברים כבר הרדים מספיק. בנוסף, להוסיף 3-4 טיפות (כ 150 - 200 μl) של 15 מ&quot;מ פתרון Tricaine אל הצינור agarose מומסת 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה p200 עם 1 ס&quot;מ של קצה פיפטה מנותקים; להעביר את העוברים בהרדמה כדי בצלחת coverslip בעל תחתית. הסר את כל עודפי E3 כחול: פתרון Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מוסיף 5 - 10 μl של agarose הנמוכה להמס: פתרון Tricaine על עובר, שמירה על כל טיפה נפרדת כדי להבטיח את העוברים לא להיסחף בטעות קרובה אחד לשני. אזהרה: אם agarose חם מדי, זה יגרום נזק לעובר. טמפרטורה טובה כדי לשמור על אגרה היא C ° 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G ½ 1, בעדינות לכוון את העובר ב agarose למיקום הרצוי. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה הדמיה זמן לשגות, כוון את האזור של עניין (ROI) קרוב coverslip כמו possible. הערה: כללית, באזור הזנב מציע וקלות ההתמצאות בהירות עקב (איור 1 א) יחסית רזה רקמות. רקמות אחרות, כגון שכבת האפיתל סביב קפלי חלמון סנפיר, ניתן להשתמש 28,29. רקמות אלה מציעות בבהירות רבה, אולם האזורים אלה הם רק כמה שכבות תאים עבים. לצורך בפרוטוקול זה, זה מועיל לתמונה באזור הזנב לרכוש חלוקות תא רבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כמה דקות עבור מיצוק חלקי של אגר. השתמש מחט להתפרק פיסה קטנה של אגר כדי לבדוק מיצוק שלה. כאשר פיסה אגר ניתן התרחקה הטיפה, המשך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את coverslip כולו עם אגר נמוך להמס ויוצרים כיפה על העוברים המוטבעים. אפשר אגר לגבש לפני הזזת צלחת הדמיה confocal (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך ההתמצקות אגר (לוקח כ -10 דקות), להכין 3 מיליליטר of E3 כחול פתרון עם חמש טיפות של (כ 250 μl) 15 מ&quot;מ Tricaine להציב על העוברים מוטבע במהלך ההדמיה. </li></ol> 4. הדמיה Confocal 5D של 40,41 עוברים דג הזברה חי הערה: ראה Ariga 40 ו אובריאן 41 לפרטים על כיצד לבצע הדמית 5D באמצעות מערכות confocal אחרות. עבור Z-מרווח, Z- מחסנית, Z-עומק, מרווח הזמן, והגדרות 5D ראה תרשים 1C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה ולהגדיר מיקרוסקופ כדי 1.4 עדשה אובייקטיבית 60X NA. החל שמן טבילה אל העדשה האובייקטיבית ומניח בצלחת התרבות מחזיקה שקופיות על במת מיקרוסקופ. באמצעות בקר הציר, למרכז את עובר עניין מעל העדשה האובייקטיבית ולהביא את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה כדי לפגוש את מנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על סמל עין החתיכה ולעבור מסנן GFP על המיקרוסקופ. דגש על ROI. התמקדות הרקמה הקרובה ביותר coverslip יהיה offer תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשתלבים. בחר את ערוצי GFP ו mCherry (אורכי גל שנקבע מראש בתוכנה) ולהגדיר את הקו הממוצע אפשרות לקדמותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;צפה / בקרת רכישה / A1 שטח סריקה&quot; פקודה כדי לפתוח את כלי שטח סריקת A1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בסריקה. באמצעות בקר הציר, עמדה עובר כך את אזור הסריקה מתמלא כמה שיותר דג הזברה ככל האפשר. כוח לייזר לא צריך להיות אופטימלי בשלב זה. מנמיכים את כוח לייזר כדי למנוע photobleaching מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;בקרות צפו / רכישה / רכישת ND&quot; פקודה כדי לפתוח את לוח בקרת רכישת ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין סריקה כדי להגדיר את הפרמטרים מחסנית Z. קבע את הגבול העליון Z- מחסנית למקום שבו התאים הם לא בפוקוס גבול תחתון למקום שבו תאים אינם גלויים. לאפשר מרחב 3 מיקרומטר מעל המדגם לצמיחת תנועת תא, אשר עשוי להתרחב לתחום ההדמיה. The Z-ערימה עבור הדמויות המוצגים פרו זהtocol מכוסה בעומק-Z של 40 מיקרומטר הזנב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל הצעד Z-מרווח 2 מיקרומטר. בממוצע, תא הוא 10 מיקרומטר קוטר; ולכן 2 מיקרומטר יפיקו חמישה במרווחים של נתוני הדמיה להיות מנותחים עבור כל תא. הערה: עומק התמונה שניתן לרכוש תלויה מרווח Z. רזולוצית Z הוא הקריב כדי להשיג עומק הכולל בממד Z כדי תמונה כמו תאים רבים עוברים מיטוזה כמו (Z- עומק גדול) אפשרי. המצב ההפוך הוא נכון, באותה, על ידי הפחתת גודל הצעד, ברזולוציה Z הוא זכה, תוך עומק Z הוא הקריב (Z- עומק קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כוח לייזר תמונה, HV, וקיזזו רמות. עבור הניסויים הפגינו פרוטוקול זה, להשתמש בכוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות להגדיר ברמות המקבילות, בהתאמה, עבור ערוץ ה- GFP; 2 - 5, 120 - 140, ו -9 ל -11. עבור ערוץ mCherry, השתמש כוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות, בהתאמה; 3 - 6, 120 - 140, ו -3 כדי-8. לאחר הפרמטרים נקבעים, לכבות את הסריקה כדי למנוע חשיפת ליזר מיותרת שעלולות לגרום phototoxicity ואת photobleaching של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סמל מיצוע קו 2x. &quot;אין מיצוע&quot; מייצר תמונה מגורענת בזמן &quot;קו 4x הממוצע&quot; מאריך את זמן הסריקה באופן דרסטי. השימוש מיצוע קו 2x מספק את איכות התמונה הגבוהה ביותר וזמן הסריקה המהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את משך המתאים מרווח זמן הזמן הדרוש לצורך הניסוי. עבור חטיבות wild-type, מרווחי זמן של שתי דקות במשך שעה 2. עדיף לקביעת משך mitotic (ששימשו איורים 1, 2, 3 א, ו 3B). חטיבות המפעילות את מחסום הרכבת ציר עבור יותר מ -30 דקות מתאימות יותר של חמש דקות במשך ארבע שעות על מנת לשמר קרינה כפי שמודגם באיור 3C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת &quot;ולשמור את הקובץ&quot; ואת שם הקובץ כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי כפי שהוא נרכש. בדוק היטב את כל parameters הוגדר כהלכה ופגע &quot;התחל הפעלה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה תושלם, כדי לראות את הקובץ בפורמט תלת ממדים, לחץ על סמל סף נפח. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי התאים להיות הדמיה בפיסיולוגיה הטבעית, הרקמה שקופה המאפשר לשמש חלבוני ניאון, הם מפתחים יחסית מהר, הזמן לשגות הדמיה ניתן לרכוש. שימוש דג הזברה מבוגרת עבור פרוטוקול זה מוגבל בשל העומק-Z המוגבל שניתן לרכוש בשל הרקמה העבה שאינה העור או עיניים. בעוד בעלי חיים מהונדסים המבטא H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX יכולים לשמש לאותה מטרה, צדדית וקל זריקות mRNA לתוך דג זברת מוטציה שונה יש יתרון על פני צלבים גנטיים. במצבים בהם ניתוח mitotic הואנדרש לאחר הפרית שלוש ימים (DPF) או עוברי מאוחר יותר, חיות טרנסגניות תהיינה נחוצות בשל זמן מחצית החיים של RNA באורגניזם זה המתפתח במהירות. חלבוני ניאון אחרים המאפשר הדמיה מיטוזה ניתנים בפרוטוקול זה. לדוגמה, H2B-GFP mRNA מהווה חלופה H2A.F / Z-EGFP עבור הכרומטין, ומספק תיוג דומה. חלבוני ניאון מתויג אחרים שניתן להשתמש בטכניקה זו כוללים POM121, centrin, Eb1, Hec1, ו EMTB אשר יאפשר הדמיה ב-העובר חי של המעטפה, צנטריול גרעיני, בתוספת-סוף microtubules, קינטוכור, ו microtubules, בהתאמה 32,47-51. פרוטוקול זה יש צעדי הדמיה מרכזיים כי חייב להיות מוצאים להורג על מנת להשיג תוצאות איכותיות: 1) הקפד למטב את איכות mRNA וריכוז להניב את הקרינה המבריקה לא רעיל ככל האפשר. הקרינה יותר תוביל לחשיפת ליזר פחות ולכן, פחות photobleaצ&#39;ינג phototoxicity. 2) העובר חייב להיות בהרדמה מלאה ובטוחה של אגר. תנועות קלות תגרומנה לשנות את התוצאות ועלולות להרוס את הניסוי. 3) הריכוז אגר חייב להיות מתאים לשלב של עובר רצוי להיות צלם. בגיל 24 hpf ובהמשך, 1% agarose נמוכה להמיס מתאימה. אם הדמיה 12 hpf או קודם לכן, פתרון agarose 0.3% אמור לשמש 39. 4) את ההחזר על ההשקעה בעובר צריך להיות קרוב ככל כדי coverslip ככל האפשר. שלב זה אינו מגביל אחד הדמיה הזנב. העיניים, העור, באזור הגב, חלמון, וקפל סנפיר הם דוגמאות לתחומים אחרים שיכולים להשתמש בפרוטוקול זה. הזמן הוא הגורם המגדיר שמפריד בפרוטוקול זה מעוברים קבוע הדמיה או רקמות. בעת הגדרת מחסנית Z, Z-מרווח, זמן לשגות מרווח, ומשך זמן לשגות, חשוב לזכור בהקשר של הניסוי (איור 1 ג). חלוקת התא wild-type נמשך בדרך כלל כ 25 דקות ב 24 hpf. בשנת הלמשל הוא, 2 מיקרומטר Z-מרווח המכסים 40 מיקרומטר של רקמות בתוך מחסנית Z, עם מרווח זמן של שתי דקות לשני hr הוכח כיעיל. יתר על כן, בעוברים עם מיטוזה פגום, תאי מעצר mitotic יהיו ככל הנראה כיום, באופן דרסטי הגדלת פעמי חלוקת תא. כדי לרכוש חטיבות מלאות מרובות, משך הזמן צריך להיות מוגבר, כלומר, בין 2 hr עד 4 שעות. זמן הרכישה כבר יחשוף המדגם לשלטון לייזר יותר ולהגדיל את הסיכון של photobleaching ו phototoxicity. במקרה זה, את מרווח הזמן בין כל מחסנית Z צריך להיות מוגבר. תנועות כרומוזום דינמיות תוקרבנה על ידי הגדלת מרווח הזמן בין ערימות-Z, אבל משך הזמן הוא זכה. זה הכרחי כאשר הדמית חלוקות תא שעלול להימשך יותר משני hr. למרות שזה לא נדון ישירות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על מנת לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה יותר במישור-Z בצורה מדויקת יותר לדמיין מו כרומוזום פרטvements. לדוגמה, באיור 4A שני כרומוזומים missegregated הם נצפו. הכרומוזום ימינה (שצוין על ידי החץ העבה) הוא בתחילה בהיר בפוקוס אבל מעמעם במסגרות האחרונות. עם מרווח Z 2 מיקרומטר, כרומוזום uncongressed נופל בין מרווח-Z. לכידת תנועות דקות ואירועי כרומוזום יחידים יכולים להיות מושלמות על ידי הגדלת רזולוציית במישור Z. כדי לעשות זאת, להתמקד על תא יחיד שימוש באפשרות שטח סריקת A1. בעת הגדרת הפרמטרים Z- מחסנית, השתמש מרחק Z-מרווח קטן יותר. מגוון מומלץ הוא 0.5 - 1 מיקרומטר. בנוסף, ומקטין את מרווח הזמן בין כל ערימת Z ייצור מעברים חלקים בין כל מסגרת זמן, כלומר, משתי דקות ל -30 שניות - 1 דקות. אזהרה אחת לסוג של הדמיה זו היא העומק-Z המוגבל שניתן להשיג. בשל מרווח Z-מרווח הזמן הקטן, יותר רקמות תיחשפנה הלייזרים בתוך מסגרת זמן קטנה יותר. כדי להתגבר על זה, SMמשך זמן aller יכול לשמש; אולם זה תלוי גם כמה זמן החוקר רוצה ללכוד חטיבות. אנלוגיה שעשויה לעזור עם שינויים אלה היא לחשוב על ערימה-Z כמו אקורדיון. המרחק בין כל קיפול של המפוח הוא המרווח-Z ואת עומק Z מיוצג על ידי אורכו של האקורדיון. בשנת מקרה שבו אחד לא היה רוצה תצבור חשיפה לייזר יותר במדגם, כפי מותח אקורדיון (מגדיל מעמיק Z), המרחק בין הקפלים של המפוח (Z-אינטרוולים) חייב להגדיל גם כן. המצב ההפוך הוא נכון שככל חוזי האקורדיון, העומק-Z פוחת. את הקפלים של חוזה המפוח וכן, מתאים ירידת מרווח Z. אנלוגיה זו ניתן להחיל על דגימות קבועות חיות. המורכבות היא הגדילה בפרוטוקול זה כאשר הזמן להוסיף למשוואה. יש כמות מוגבלת של זמן כי האקורדיוניסט יכול להאריך או לכווץ את האקורדיון. represen זהts את מרווח הזמן. על מנת לכסות יותר מרחק (Z-עומק) את מרווח הזמן חייב לעלות. כמו כן, על מנת לשמוע מוסיקה יותר, צריך להאזין במשך זמן ארוך יותר (משך זמן) במונחים של פרוטוקול זה, כדי להיות עדים יותר חלוקות תא, משך הזמן חייב לעלות. גורם הרכבה לזכור היא שהמוזיקה יותר כי הוא שיחק, ויותר עייף האקורדיוניסט. זה מקביל למימד, הקרינה הסופית. החשיפה לייזר יותר המדגם הוא נתון, יותר photobleaching ו phototoxicity (עייפות) הופכת לנושא. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט שיטה לדמיין מיטוזה בעובר דג הזברה לחיות החלים על ניתוחים שונים; 1) חלוקה מספר 2) חלוקה זמן 3) גורל חטיבה ו -4) דינמיקה הכרומטין ברזולוציה גבוהה. אפשרויות מרובות המאפשרים הדמית רכיבי mitotic החל מצורף microtubule-קינטוכור כדי צנטריול ניתן ליישם דינמיקה. שילוב היכולת שלמיטוזה הדמית in vivo עם התקדמות עריכת הגנום דג הזברה תעשה את זה קל ליצור מוטציות בהיבטים שונים של מיטוזה מודל מחלות אנושיות בתוך האורגניזם חוליות 25,26,52-56.

מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ&quot;א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16. עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ &#39;esco2 מ / מ&#39;, בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27. מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35. בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו &#39;) ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו&#39;) הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.

<html> איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק &#39;(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו -30 תאים המתחלקים בעוברי Aur B מ / מ &#39;(איור 2 ב). כדי להסביר את מספר התאים צילמו, היחס של תאים mitotic למספר התאים צילמו חושבה (איור 2 ג). נתונים אלה מראים כי אין מספר נמוך של תאים עוברים מיטוזה ב עובר Aur B מ / מ &#39;(איור 2 ב) אך פחות המספרים של תאים להיות צלם. היכולת לרכוש מספר משמעותי סטטיסטי של אירועים כגון זה תסייע כוח סטטיסטי. -together.within-page = &quot;1&quot;&gt; איור 3 מרחיב בטכניקה זו כדי לכלול לכימות משך mitotic. לאחר פגישת הזמן לשגות נרכש, תא יחיד יכול להיות מנותח עבור הזמן המושקע מיטוזה עם רזולוציה נאותה על ידי שימוש באפשרות זום ​​(איור 3 א &#39;, ב&#39;). משך mitotic מחושב באופן ידני על ידי לספור כמה מרווחי הזמן תופסים חלוקת תא אחד. מספר מרווחי זמן מוכפל מרווח הזמן בין כל מחסנית Z. לדוגמה, באיור 3C, חלוקת נטל 12 מרווחי הזמן ואת מרווח הזמן בין כל מחסנית Z היה 2 דק &#39;. לכן, בפעם חטיבת עבור תא זה היה 24 דקות. שעת חלוקת wild-type ממוצע AB היא 25 דקות ו -58 דקות עבור מ &#39;/ מ&#39; aurB (איור 3 ב). זמן חלוק ממושך כפי שניתן לראות מ &#39;aurB / m עולה שמחסום הרכבת ציר לא היה מרוצה עקב ומקןה שגויהמצורף tochore 1,2. אם ניקח מבט מקרוב על הגדלה עוברים wild-type, בכל שלב mitotic ניתן להבחין (איור 3 ג, סרט 2). בנוסף, ליקויי mitotic ניתן לצפות בעובר m / m aurB הכולל מעצר mitotic ונכשל cytokinesis וכתוצאה מכך תא binucleated ההיווצרות הבאה של גרעינון (3D איור, סרט 3). זה הגדלה ניתוח מראה פגמי mitotic תומך זמן הענף גדל רכש באיור 3 ב. שונה אחרים פגמי mitotic המגוונת גורלות תא שעשוי להיות נתקלו נחקרים איור 4; הפגינו את העוברים esco2 + / m esco2 m / m. בעובר esco2 + / מ &#39;, תנועות כרומוזום שגויות נלכדים יכולה להיות מוגדרת כ פגם congressionים. פגמי Congression להתרחש כאשר קבצי microtubule פסולים מבוצעים. פגמים אלה יגרמו לכישלון של הכרומוזומים אל נודד לעבר צלחת metaphase. כרומטידה אחות מותאמים, במיוחד לזיהוי ב 20 דקות ו -46, שלא congressed כלפי צלחת metaphase ניתן נצפתה לראשונה דק &#39;14. התפרצות anaphase המפריד בין כרומטידה אחות מיושר על הצלחת metaphase וכן כרומטידה אחות לזווג ימינה, נצפים דקים 50. בנוסף, היווצרות הגרעינון אפשרית הוא ציין גם כרומטידה האחות המופרדת אלה נותרו מבודדת מחוץ לגרעין (T = 50, איור 4 א, ​​סרט 4). באיור 4B, חטיבה רבה-קוטבית היא דמיינה (סרט 5). חטיבות רבות-קוטביות לעתים קרובות להתרחש עקב הגברת centrosome, אך עלולה להתרחש הדרך אחרת פירושה 42. באיור 4C, תא esco2 m / m בתחילה מדגים בהסרת כרומטידה אחות מוקדמתסיבוב יון ציר 9,43,44. גורל תא נוסף מראה בלוח זה מהווה גשר anaphase שבו מצורף merotelic הם 45,46 פתורים. גשר anaphase ניתן לראות ראשון בדקה 62. הכרומטין נראה בטרם עת decondense תוך התא עובר cytokinesis. כפי cytokinesis מתרחשת, הקמט מחשוף פוגעת הכרומוזומים decondensed, וכפי כריתה מתרחשת, מושך את החומר הכרומטין להקים גשר anaphase (איור 4C, סרט 6). אמנם לא מוצג כאן, על מנת לכמת את גורלם הסלולר, להקליט את כל חטיבות mitotic בכל מסגרת וסוג גורל התא הם מפגינים. מחלקים את מספר התאים בכל גורל במספר הכולל של חטיבות רשמה ולהתרבות על ידי 100 כדי לחשב את אחוז גורל התא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig1.jpg" /> איור 1: מתאר שרטוטי פרוטוקול. (א) </stרונג&gt; ציור סכמטי של התקדמות טכניקת דימות החל H2A.F / Z-GFP ו CAAX-mCherry זריקות mRNA, אז על הטבעה של עוברים בתהלוכה מיקרוסקופיה confocal. (ב) ציור סכמטי של תהליך הטבעה העובר. עוברים המוזרק יש dechorionated וחומרי הרדמה. עובר מועברים לאחר מכן כדי בצלחת coverslip התחתונה ועודף כחול E3 מוסר. אגר נמוך להמס משמש ליצירת כיפות נפרדות כיסוי כל עובר. אוריינט עובר כך הזנב הוא קרוב ביותר coverslip. מתן שתי דקות לפני ההוספה אגרה כיסוי coverslip כולו. המתן עד אגר הוא התגבש לפני המעבר ל תמונה. (C) ציור סכמטי כדי להגדיר את המונחים Z-מרווח, Z- מחסנית, מעמיק Z, מרווח הזמן, משך זמן 5D המשמשים פרוטוקול ודיון. Z-מרווח מוגדר כמרחק בין כל תמונה כמו מיקרוסקופ נע עמוק לתוך המדגם כדי ליצור מחסנית Z. Z- מחסנית היא כל התמונות שצולמו באמצעותמדגם ב Z-המרווח המוגדר. המרחק נסע בערימה-Z מגדיר את Z- עומק. מרווח הזמן הוא משך הזמן בין מחסנית Z אחד ואת Z-המחסנית הבאה כדי ליצור תמונת הזמן לשגות. משך הזמן הוא הסכום הכולל של זמן המשמש תמונה. 5D מוגדרת ממדי X, Y, Z, זמן, ואת פליטת ניאון. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig2.jpg" /> זמן לשגות הדמיה איור 2. לוכדת אירועים mitotic מרובים בעובר דג הזברה לחיות. (א) סטילס זמן לשגות מניסוי תקריב הדברים לידי ביטוי דג הזברה AB wild-type, 24 hpf מוקרנים אירועי mitotic מרובים. כוכביות מצביעות לכיוון שבעה תאי מיטוזה. t = הזמן שחלף בדקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ב) מספר ce mitoticLLS שנצפתה AB ו aurB m / m זנבות דג הזברה ב 24 hpf. ממוצע ± st. dev., n = 3 עובר / גנוטיפ. (C) היחס בין תאי mitotic לכל מספר כולל של תאי AB ו aurB M / M זנבות דג זברה ב 24 hpf. ממוצע ± st. dev., n = 3 עובר / גנוטיפ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig3.jpg" /> תא יחיד איור 3. ניתוח לוכד כל שלב mitotic ומשך mitotic. (א) תא הנבחר מתצוגת השדה הרחבה של wild-type AB, 24 hpf העובר דג זברה שמוצג איור 2 א. (ב) זמן החטיבה הוא ציין עבור AB ו aurB m / m תאים ומחושב יוכל להסיק BRE מעטפת הגרעיןakdown (חוד) על התצפית הראשונה של הכרומטין המרוכז בתא להיווצרות של שני תאים הבת חדשים. n = 3 עוברים / גנוטיפ, n = 66 אוגדות עבור AB, n = 29 אוגדות עבור מ &#39;מ&#39; / aurB, *** p-value &lt;0.001. (C) AB תא wild-type חתוך לדמיין את התקדמות השלב דרך מיטוזה . t = min. בר סולם = 5 מיקרומטר. (ד) aurB m / m תא חתוך לדמיין התקדמות mitotic באמצעות מיטוזה הכוללת מעצר mitotic לכשל cytokinesis והיווצרות גרעינונים. חצים להצביע לכיוון גרעינונים. t = הזמן שחלף בדקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig4.jpg" /> איור 4.הדמיה של תא חי בודד לוכדת פגמים mitotic מרובים משויכים כרומוזום הפרדה אגף mitotic Mutant דג הזברה. (א) קצוץ תמונה של תא עובר פגמי congression בעובר esco2 + / m. החץ הדק מפקח על כרומוזום שמאל כי משוך לאחור לתוך צלחת metaphase. החץ העבה מפקח על כרומוזום הזכות שאינו נסוג לתוך צלחת metaphase ולהסיק לגבש הגרעינון. על החץ הכפול מציג את ההפרדה של כרומוזום התקין כי לא קונגרס בתחילתה anaphase. ריבועי להראות תקריב בתצוגות של הכרומוזומים שנכשלו לקונגרס. ריבועים היו קצוצים ובהירות משופרת להדמיה טובה יותר. קרינת CAAX הוסרה כדי להמחיש את הכרומוזומים ביתר קלות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ב) קצוץ תמונה של תא עובר מעצר mitotic שתוצאתו חלוקה רבה קוטבית בתוך esco2 </em&gt; + / העובר מ. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ג) תמונה חתוכה של עייפות לכידות עוברים תא וכתוצאה מכך היווצרות גשר anaphase בעיני דמוית החוט מושך בין שני הגרעינים שציינו סוגריים. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. t = הזמן שחלף בדקות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/54218fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">סרט 1. חלוקות תא מרובות ניתן דמיינו נוף רחב של העובר דג הזברה wild-type מוזרק</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">(קליק ימני להוריד).</a> <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie2.jpg"/&gt; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">סרט 2. שלבי מיטוזה ניתן דמיינו בקלות עובר דג זברת wild-type</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">(r</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">ight לוחץ כדי להוריד).</a> פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין לבין התמורה כלפי congression של כרומטידה האחות כדי ליצור צלחת metaphase . הפרדה מדויקת מתרחשת מניב שני לתאי בת חדשים. <img alt="סרט 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">הדמית Live Movie 3.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">עובר m / m aurB מגלה מיס כרומוזום</a>egregation, נכשל cytokinesis, והיווצרות גרעינונים (קליק ימני להוריד). היא להסיק פירוט מעטפת גרעין מהופעתו הסדירה של הגרעין, הכרומוזומים להתפזר קטבים מנוגדים מסוגלים ליצור צלחת metaphase נאותה, והמשך לסובב על ציר הארכת החלוקה זמן של התא. Cytokinesis אינה מתרחשת כתוצאה בתא 4N ו גרעינונים מרובים. <img alt="סרט 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie4.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">סרט 4. פגמי Congression הם שנצפו</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">עובר esco2 + / מ &#39;(קליק ימני להוריד).</a> פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין. לאחר הצלחת metaphase נוצר, כמה אינדיהכרומוזומים vidual לפזר משני צדדיו. אחת כרומוזום הפרט בצד שמאל בסופו של דבר משוך לאחור לתוך הצלחת metaphase ואילו כרומוזום ימינה נשאר מחוץ הצלחת metaphase ניתן לראות הפרדה כרומטידה אחות בתחילת anaphase. התא מפגין זמן חלוק ממושך אך מחלק אולטימטיבי עם היווצרות הגרעינון פוטנציאלית. <img alt="סרט 5" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">סרט 5.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">חלוקה רבה-קוטבית הוא ציין בעובר esco2 + / מ &#39;(קליק ימני להוריד).</a> פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין ולאחר מכן הכרומוזומים למזג לגבש Y-צורת indicativדואר של קטבי 3-ציר. התא מפגין זמן חלוק ממושך אך בסופו של דבר מתחלק 3 לתאים בת. <img alt="סרט 6" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie6.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">סרט 6.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">מוקדמת אחות הפרדת כרומטידה והיווצרות גשר anaphase הם נצפו בעובר מ esco2 m / (קליק ימני להוריד).</a> פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין ולאחר מכן הכרומוזומים לפזר ברחבי התא מסוגל לגבש צלחת metaphase נכונה. הכרומטין decondenses לפני cytokinesis וככל שתא מתחלק, יוצר גשר anaphase בין שני התאים.

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Nanyang Technological University

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Molecular Biology

Anatomy and Physiology

Unit 1

Unit 2

Cell Division

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Views.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Video: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetics

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה