Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Preparação de Soluções e puxou vidro Needle <ol><li> Adicione uma solução de estoque de 25x tricaina (3-amino éster de etilo do ácido benzóico, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato de metilo) a 4 mg / mL em Tris 20 mM, pH 8,8 e trazer esta solução é a pH 7. alíquota, de 4 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: O tricaina anestésico actua preferencialmente nos canais de sódio dependentes da voltagem neurais bloqueando assim espasmos musculares e movimento 6. </li><li> Adicione uma solução de trabalho de tricaina a uma concentração final de 0,17 mg / mL em meio de embrião E3. 7 NOTA: Faça o tricaina solução de trabalho de improviso como o pH desta solução deriva. </li><li> Dissolve-se o de agarose de baixo ponto de fusão até uma concentração final de 1,5% em meio de embrião E3, em um tubo de 50 ml por aquecimento da solução em um forno de microondas. Deixe que esta solução se equilibrar a 42 - 45 ° C em qualquer um banho de água ou de bancada incubadora. Se preparando grandes pratos para verticaisluz folhas de imagem (passo 4), faça um adicional de 25 mL de 1% de fusão padrão de agarose em meio embrião E3. </li><li> Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 mm, 0,69 mm ID, comprimento 10 mm. </li><li> Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento extrator de agulhas descrito na Tabela de equipamentos e reagentes, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 120, Velocity 50, Tempo 225, Pressão 500. Com um par de fórceps afiadas, ruptura a agulha apenas após o ponto em que se flexiona para criar uma agulha limpa e nítida para orientar os embriões e removendo o excesso de agarose. Um micro-bisturi também pode ser utilizado para remover o excesso de agarose. </li></ol> 2. Incorporação de embriões para Invertido ou Microscopia Vertical <ol><li> Levantar os embriões até o estágio adequado em meio embrião E3. 7 </li><li> Na fase necessária, embriões dechorionate com um par de fórceps afiadas debaixo de uma dissecção binocularmicroscópio ting. </li><li> Incubar os embriões dechorionated para, pelo menos, 5 minutos na solução de trabalho tricaina. </li><li> Uma vez que a solução de agarose fundida foi arrefecida até 45 ° C, utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir o embrião dechorionated directamente para o tubo de 50 ml com transferência mínima de meio E3. </li><li> Remover embrião em conjunto com cerca de 1 ml de meio de montagem e adicionar aprox. 100 ul de meio de montagem em conjunto com o embrião ao círculo central de uma placa de Petri com fundo de vidro com 35 milímetros de micropoços de 10 mm. </li><li> À medida que o meio de montagem é a criação, mover o embrião para a borda do círculo de agarose com a cauda virada para fora (Figura 1A). Usar a agulha capilar para manter o embrião na orientação lateral desejada até que o gel é completamente definido. Para a imagem desenvolvimento corporal posterior, ter o cuidado de orientar o embrião de uma orientação que de lateral possível. Assim, manter o embrião nesta posição por adjustmen cuidadosasst com a agulha capilar. NOTA: Múltiplos embriões podem ser adicionados ao prato de montagem neste ponto, se necessário. Se este for o caso, a transferência da agarose de baixa fusão no primeiro prato e adicionar os embriões para o centro da gota de agarose. Em seguida, empurrar os embriões para as extremidades do anel de vidro e orientação para a posição desejada. Até seis embriões pode ser montado desta maneira antes da agarose torna-se solidificou. </li></ol> 3. remoção do excesso de agarose em torno do corpo Posterior NOTA: Esta seção descreve o procedimento pelo qual agarose é removido da região em torno do corpo posterior. No caso do alongamento do corpo posterior, é importante para garantir que a cauda podem crescer-out normalmente. Ao remover a agarose após o embrião tenha sido completamente incluídos por agarose, o embrião é deixado fechado pela região da cabeça e aproximadamente metade do saco vitelino. <ol><li> Uma vez que a queda de agarose definiu, inundar o petri dish com a solução de trabalho tricaina. </li><li> Sob um microscópio de dissecação binocular com uma base de luz de transmissão, ajustar a posição do espelho e o ângulo de luz incidente de tal forma que o contraste forte permite que os cortes na agarose para ser visto claramente por meio da operação. </li><li> Para executar corte 1 (Figura 1), utilizar a agulha capilar ou o micro-bisturi para cortar a meio caminho de agarose ao longo da gema, a partir de uma posição imediatamente posterior ao campo do coração formando para a posição de somito 5 (a 5 th somite anterior). </li><li> Inicie o corte inicial adjacente ao coração formando como mostrado, e a forma total através da agarose ao vidro. </li><li> Mantenha o capilar ou micro-escalpelo nas profundezas da agarose, e, lentamente, viu cima e para baixo, enquanto começando a fazer um longo corte sobre o embrião como mostra a Figura 1. Cortar o mais perto do embrião quanto possível, sem perfurar o embrião ou gema. </li><li> Em seguida, fazer cortes 2 e 3 (Figura 1 </strong&gt;), A partir da posição contra o embrião e com o corte indo todo o caminho até o fundo de vidro prato. Adicione corte 2, de modo que é tangencial aos primeiros 5 somitos, permitindo dorsalward desdobramento completo do corpo posterior. Adicione cortar 3 a um ângulo de 90 ° com a superfície da gema e a partir da HEARTFIELD. NOTA: o corte de agarose até que a extremidade do círculo de vidro (como se mostra na Figura 1) auxiliares na remoção da agarose como um bloco completo (passo 3.6). No entanto, isso não é necessário. </li><li> Começando na intersecção dos cortes 1 e 3, fazer um corte diagonal lento no final do corte 2 enquanto levanta-se lentamente para cima, a fim de desalojar o quadrado de agarose em torno do corpo posterior. Notas: Em alguns casos, este será lançado em um bloco e a conclusão da operação de uma só vez. Em outros, pode levar várias tentativas para dis-lodge toda a agarose em torno do embrião. </li><li> Com um par de pinças cortantes, remover o b desalojadomechas de agarose a partir do meio do embrião. Para ajudar neste processo, movimentar as peças de agarose para o lado do prato e usar a parede da placa de Petri como suporte de elevação enquanto os pedaços de agarose. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de montagem set-ups. (A) O diagrama mostra a posição do embrião montado no interior do anel central de vidro numa placa de Petri. À direita é um zumbido do embrião com cada corte sucessivo através do circunda agarose mostrado com linhas vermelhas dottted. (B) Os embriões montados é diagramado em vista lateral exibindo a facilidade de acesso para ambos os objetivos invertidos e verticais. (C) A digram semelhante mostrando como os embriões podem ser montado para imagiologia folha de luz vertical set-ups. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol start="9"><li> Se espasmos musculares não está completamente bloqueada nesse ponto, adicionar gotas de tricaina a partir da solução stock de 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montagem de embriões para Luz folhas Vertical Microscopia NOTA: Esta é uma variação do método descrito acima, que permite o acesso de múltiplos objetivos para geração de imagens de amostras por SPIM verticalmente orientada. A ideia subjacente a esta variação é a de elevar a amostra ligeiramente maior do que o fundo do recipiente, para permitir o fácil acesso de dois objectivos de imagem. <ol><li> Antes da amostra de montagem, um revestimento 100 milímetros placa de petri de plástico com 1% de agarose em forma E3 a uma altura de 5 mm e deixar solidificar. </li><li> Colocar uma gota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão para o centro do prato e deixar solidificar. </li><li> embriões incorporar em agarose de baixo ponto de fusão como no ponto 2. No entanto, este tempo, retire o embrião a partir do tubo de 50 mlde agarose com uma queda menor de solução (0,5 ml) e colocar esta pequena gota no topo de 1 ml a cair no centro do prato. </li><li> Usar a agulha capilar para colocar o embrião no centro da pequena gota e manter a sua orientação correcta até gel é definido. </li><li> Inundar o prato com solução de trabalho tricaina e remover o excesso de agarose, como na seção 3, mas sem cortar a almofada de 1% de agarose padrão. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Esta técnica de montagem permite que embriões que permanecer estática durante a transferência para o microscópio e mais experimentos com imagens de lapso de tempo de longo prazo destinadas a seguinte alongamento do corpo posterior em várias escalas de comprimento. Além disso, é versátil na medida em que permite a imagem em microscopia invertida na vertical e fixados-ups, e uma sugestão é feita para como isto pode ser ainda adaptado para SPIM orientada verticalmente. Um passo essencial no presente protocolo é a remoção cuidadosa de excesso de agarose em torno do corpo posterior, que é importante para permitir que o normal desenvolvimento desta estrutura. É importante tomar cuidado para não danificar aqui em embrião, particularmente quando remover a agarose em torno da parte superior da gema. Além disso, deve ser tomado cuidado ao remover o bloco de corte de agarose em torno do embrião, como por vezes é possível perder o embrião a partir do molde durante este processo. Por estas razões, este é um método de baixo rendimento THAt não é adequado para a montagem de muitos embriões de peixe-zebra, simultaneamente, em contraste com os métodos já publicados que utilizam moldes de plástico 3D impressa. 8, 9 No entanto, os embriões são altamente estáveis por este método de montagem e, portanto, pode ser transportado para o microscópio muito mais fácil, e conservam a sua orientação 3D alongamento ao longo do corpo posterior. Um outro passo crucial é a precisão da orientação lateral inicial do embrião, evitando qualquer ântero-posterior ou inclinação dorso-ventral. De qualquer inclinação impedirá a visão lateral da extensão do corpo posterior, que é o ângulo mais conveniente de vista para análise posterior. A inclinação ântero-posterior irá em resultado disso no corpo posterior crescente cima ou para baixo em relação ao plano horizontal, o que significa a aquisição de empilhamentos superiores em Z e assim o tempo-lapsos de tempo com uma resolução inferior. Este método é versatile e permitiu para imagiologia de taxas de divisão celular com o uso da linha Fucci 5, 10, bem como análises morfométricas de multi-escalar. 5 No entanto, dado o deslocamento global dramática da tailbud durante o alongamento do eixo do corpo posterior, objectivos apenas relativamente baixas de ampliação podem ser usadas para capturar todo o processo, tal como mostrado na Figura 2. Isto é porque mais elevados resultados de ampliação da região de interesse deixando o campo de visão dentro de 3 - 4 horas de aquisição (Vídeo Figura 1). Portanto, uma forma de melhorar ainda mais a formação de imagens do tailbud é ter um algoritmo de seguimento automático que pode detectar o movimento global do tailbud e ajustar o X, Y, Z posição da platina do microscópio durante a aquisição. Dado o aumento da estabilidade do embrião em todas as dimensões axiais com o método de montagem descrito aqui, deve ser passível deuma tal abordagem.

Posterior alongamento corpo é um processo essencial do desenvolvimento embrionário em que o embrião se estende de modo a formar uma grande parte do eixo do corpo. É um exemplo de um processo morfogenético complexo, através da qual vários comportamentos de células agir coordenadamente para gerar a morfogénese no nível de tecidos individuais. Estas deformações tecido diferencial, em seguida, actuar em conjunto para gerar o alongamento do corpo posterior em todo o nível da estrutura. Para entender como esses processos são controlados e coordenados durante o desenvolvimento, que deve ser capaz de seguir esses processos em múltiplas escalas (ou seja, no nível de moléculas, células, populações de células e tecidos) e relacionar esta diretamente para a morfogênese de toda a estrutura . embriões de peixe-zebra são ideais para imagiologia alongamento posterior do corpo como a sua transparência óptica e pequeno tamanho permite a aplicação de luz de imagens minimamente invasiva abordagens bem adequado para live imagiologia. 1 Isto foi evidenciado por uma série de publicações recentes que lançaram luz sobre o desenvolvimento corporal posterior ao nível de moléculas, 2 células individuais, 3 e inter-tecidos comportamentos, 4, bem como ao nível da população celular e órgão inteiro. 5 técnicas de imagem avançadas, como confocal, microscopia multi-fotão e microscopia de iluminação avião seletiva (SPIM) estão permitindo que a imagem a longo prazo dos processos de desenvolvimento, com efeitos de toxicidade luz e foto-branqueamento diminuiu. técnicas robustas para a montagem de amostras vivas são necessárias para atingir três objectivos: 1) um apoio suficiente para manter as amostras na orientação correcta, durante a transferência para o microscópio e durante a aquisição, 2) liberdade de movimento suficiente da amostra para permitir a excrescência de a região do corpo posterior sem afectar a sua devel normaisvolvimento, e, finalmente, 3) um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Este protocolo apresenta uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento do peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas na agarose, deixando região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Como tal, também é um método adequado para a imagiologia de longo prazo de outras regiões do corpo em desenvolvimento como a agarose permite imagiologia por meio de técnicas de imagiologia de luz padrão. Este protocolo demonstra a montagem de embriões em uma orientação lateral, embora também seja possível a montagem em orientações embriões alternativos. Ela vai mostrar ainda mais como adaptar o método para configurações de microscopia na vertical, invertida e verticais de luz folhas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35-1.5-10-C</td>
			<td>35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td>&#160;Sutter&#160;</td>
			<td>BF 120-94-10</td>
			<td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>P-715</td>
			<td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps&#160;</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&#160;</td>
			<td>11252-30&#160;</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller&#160;</td>
			<td>Sutter&#160;</td>
			<td>P97</td>
			<td>Heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 Apo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

embriões de peixe-zebra oferecer um sistema experimental ideal para estudar processos morfogenéticos complexas devido à sua facilidade de acessibilidade e transparência óptica. Em particular, o alongamento do corpo posterior é um processo essencial do desenvolvimento embrionário, através da qual múltiplos deformações tecido agir em conjunto para dirigir a formação de uma grande parte do eixo do corpo. A fim de observar esse processo por meio de imagens de lapso de tempo de longo prazo, é necessário utilizar uma técnica de montagem que permite um apoio suficiente para manter amostras na orientação correta durante a transferência para o microscópio e aquisição. Além disso, a montagem também deve proporcionar liberdade suficiente de movimento para a excrescência da região do corpo posterior, sem afectar o seu desenvolvimento normal. Finalmente, deve haver um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Aqui, apresentamos uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento de posterior elongatio corpon no peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas no agarose, deixando de fora região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Vamos mostrar como isso pode ser adaptado para microscopia de luz folhas na vertical, invertida e vertical set-ups. Embora este protocolo centra-se na montagem de embriões para a imagem latente para o corpo posterior, poderia ser facilmente adaptado para a imagem ao vivo de vários aspectos do desenvolvimento do peixe-zebra.

O protocolo descrito acima detalha uma técnica versátil para a montagem de embriões de peixes-zebra para imagiologia de lapso de tempo de longa duração. Um exemplo disto é mostrado na Figura 2A e na animação / vídeo Figura 1. Os embriões foram injectados no estádio de uma célula com o ARNm que codifica a proteína fluorescente photoconvertible kikumeGR. Na fase de 15 somito eles foram montados como descrito acima e trabalhada durante 12 horas em um microscópio invertido confocal com uma objectiva 10X. As pilhas confocal resultantes foram maximamente projetada para ser exibido como mostrado. Este filme mostra claramente que o corpo posterior é permitido circular livremente por toda a duração do filme e mostra mudanças similares na morfologia como visto em embriões que estão autorizados a desenvolver-se livremente de sua córion em condições de cultura normais. Um exemplo adicional é mostrado na F igura 2Be de animação / vídeo Figura 2. Aqui, os embriões foram injectados na fase celular 16 com uma combinação de mRNAs que codificam a proteína histona 2B-mCherry (que rotula os núcleos) e eGFP: a caixa CAAX (que rotula membranas; para detalhes ver referência 5). Eles foram então visualizados num microscópio multifotônica na posição vertical com uma imersão em água objectiva 25X conforme representado na Figura 1B. As imagens foram tiradas durante 3 horas a partir da fase de 10 somito, a fim de visualizar os comportamentos celulares durante a formação tailbud. As células podem ser visto para ser gerar saliências activas e movimentos direccionais como as formas tailbud normalmente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplos de imagens em tempo-lapso de Posterior Alongamento corpo em 10 X ampliação. (A) quadros consecutivosde um filme cobrindo o processo representativo do alongamento axial. Os embriões são mostradas em vista lateral com posterior para o lado direito da imagem. (B) quadros consecutivos de um filme maior ampliação mostrando comportamentos de células individuais durante a formação tailbud. Os embriões são mostradas em vista lateral com posterior e à direita. As linhas pontilhadas delinear o tailbud formando. linhas coloridas pequenas mostrar faixas de núcleos para seguir os movimentos de células individuais. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> Animated / Video Figura 1: Time-lapse filme de Posterior alongamento do corpo de um mRNA KikumeGR injetado embriões Zebrafish por microscopia confocal. Embrião é mostrado com anterior à esquerda e cartazior para a direita. As imagens foram tiradas em intervalos de 10 min a 10X de ampliação. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> Animated / Video Figura 2: Time-lapse filme de Posterior alongamento do corpo de um embrião Nuclear-mCherry e Membrane-GFP etiquetado Zebrafish fotografada pela microscopia de dois fótons. Embrião é mostrado com o anterior para posterior direita e para a esquerda. As imagens foram tiradas em intervalos de 2 min a 25X. Linhas coloridas exibir faixas de células para os últimos dez passos de tempo para cada célula rastreado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K visualizações.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Vídeo: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

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Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...