Agradecemos Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille para participar na criação de base para estes protocolos. Agradecemos também a plataforma de imagem Molecular do IBMB-PCB, Xavier Esteban e membros do laboratório de apoio contínuo. O programa de grupos consolidados da Generalitat de Catalunya e DGI e consolidar subsídios do Ministério da economia e competitividade da Espanha para EMB e DN apoiou este trabalho.

Todas as etapas do protocolo descritas abaixo sigam as orientações de cuidados com animais de nossas instituições.
1. Zebrafish cultura
<ol><li>Criar e manter zebrafish adulto em condições normais. Nota: AB e TL tipo selvagem embriões foram utilizados para este estudo.</li>
	<li>Coletar embriões e cultivá-las a 28,5 ° C na E3 embrião médio24. Estágio-los de acordo com a morfologia como descrito anteriormente,19.</li>
</ol>2. microscopia de força atômica
<ol><li>Manualmente dechorionate encenado zebrafish embriões (de diferentes idades, de acordo com os interesses individuais). Remova chorions com dois pinça fina e afiada (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Segure o córion usando uma pinça e tornar uma lágrima com a outra pinça. Em seguida, segurando o córion numa região oposta do rasgo, empurre o embrião suavemente através da abertura.</li>
		<li>Execute o dechorionation sob um estereomicroscópio dissecação com uma escala ajustável de ampliação entre 8x e 50 X.</li>
	</ol></li>
	<li>Montar os embriões para AFM
	<ol>
<li>Preparar uma solução de agarose 2% no meio do embrião e encher um prato de Petri 35mm com isto. Deixe solidificar. Faça pequenos furos de 1,5 mm de diâmetro (duas vezes o tamanho do embrião) e profundidade de aproximadamente 350 µm (metade do embrião tamanho) com pinça fina na cama do agarose.</li>
		<li>Coloque os embriões no pokes feito na camada de agarose e garantir que eles estão no lugar, espalhando em torno de uma solução de 0,5% de baixa fusão agarose no meio do embrião. Despeje esta solução em torno de apenas os embriões para fixá-los nos buracos.</li>
		<li>Antes que a agarose de baixo ponto de fusão que se solidifica à temperatura ambiente, gire os embriões de tal forma que a região de interesse a ser sondada por AFM enfrentará para cima (figura 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Examinar os embriões por AFM
	<ol>
<li>Localize e os embriões no prato de petri empregando um objectivo X 20 em um microscópio de força atômica invertida da imagem (consulte a Tabela de materiais25) à temperatura ambiente (23-24 ° C). Nota: Os embriões são mantidos vivos imerso no meio do embrião e anexada à sua cama de agarose.</li>
		<li>Sonda de superfície celular de gema de embriões fundidas empregando esferas de poliestireno esféricas de 4,5 µm de diâmetro conectado a um cantilever com uma constante de mola nominal de 0,01 N/m. definir a amplitude pico-a-pico de oscilação do cantilever para 5 µm e sua frequência de 1 Hz.</li>
		<li>Colete dados para cada região a ser testado em posições diferentes e em vários embriões, como uma rotina, para uma média de dados. Nota: Um bom ponto de partida é a sonda de 5 posições, localizadas no meio e nos cantos de um quadrado de µm 10 µm x 10 controlando a posição do cantilever com os XY piezo-atuadores do microscópio AFM. Coleção de imagens e dados levou cerca de 20 min por embrião. Gravação de dados em diferentes regiões da superfície da célula de gema do embrião, por exemplo, o polo vegetal ou diferentes regiões próximas a margem de células EVL (figura 1B e 1C), só pode ser feito empregando distintas espécimes orientadas de forma diferente.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular as forças
	<ol>
<li>Medir o deslocamento vertical do cantilever AFM (z) com sensores de Extensômetro acoplados ao piezo-atuadores e sua deflexão (d) usando um fotodíodo quadrante pelo método óptico de alavanca com o software de controle de microscópio (ver Tabela de materiais 25).</li>
		<li>Use a inclinação de uma curva de d-z obtida a partir de dados coletados de uma região nua de uma lamela de vidro para calibrar a correlação entre o sinal do fotodiodo e a deflexão do cantilever (d). Nota: O deslocamento vertical medido é igual a deflexão do cantilever e a inclinação representa a sensibilidade de deflexão da alavanca óptica26.</li>
		<li>Inferi que a constante de mola do cantilever (k) das flutuações térmicas conforme descrito anteriormente27.</li>
		<li>Calcule o recuo da amostra (h) como: h = (z - zc) -(d - dfora)          (1) Nota: Aqui zc é a posição do ponto de contacto e dfora é o deslocamento do fotodiodo.</li>
		<li>Calcule a força (F) no cantilever como: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule a tensão do córtex em termos de um modelo de balão de líquido consistindo de uma camada elástica de tensão cortical Tc encerram um líquido viscoso. Neste modelo, para recuos pequenos (em comparação com o tamanho do embrião), força aumenta proporcionalmente4,28 , como: F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) Nota: Aqui nb R é o raio da esfera e ne R é o raio do embrião. Para o embrião do zebrafish, como o raio do embrião (400 µm) é duas ordens de magnitude maiores do que o grânulo (2.25 µm), esta equação pode ser aproximada como: F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>Calcular o força de tensão-recuo (F-h) curvas em cada região de célula de gema do embrião por cinco diferentes apontam as medições.</li>
		<li>Calcule o Tc para cada F-h curva por não-linear menos-quadrados encaixe. Para análise estatística, a tensão cortical Tc calculado deve ser em média dos diferentes F-h curvas.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir as propriedades viscoelásticas (reologia) do córtex através da aplicação de baixa amplitude (100 nm) oscilações de multifrequência durante AFM é composto por ondas senoidais de diferentes frequências de25.
	<ol>
<li>Calcule um módulo eficaz de complexo g*(ƒ) no domínio da frequência de curvas de recuo de força, como: g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5) aqui é a unidade imaginária e F(f) e h(f) são os espectros de frequência (f) da força e recuo. b é a correção para o arrasto viscoso em cantilever extraído as oscilações aplicadas na superfície.</li>
		<li>Separado g*(ƒ) em partes reais e imaginárias, como: g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f)          (6) em > g'(f) é o módulo de elasticidade e é uma medida da energia elástica armazenada e recuperada por ciclo de oscilação. g' (f) é o módulo viscoso que contabiliza a energia dissipada.</li>
		<li>Calcular a tangente de perda, que fornece um índice de como o sólido (< 1) ou líquido-como (> 1) comportamento do material, como: g' (f) / g' (f)          (7) Nota: Com este tipo de medida, é possível extrair parâmetros indicando como viscoso e elástico como é o material sondado. Embora b ligeiramente depende da distância da extremidade do cantilever à superfície, dado os valores muito baixos de g´´ exibido pela gema de célula (ver Figura 2D abaixo), pequenas variações no b têm um impacto insignificante as medições de29.</li>
	</ol></li>
</ol>3. partícula rastreamento Microrheology
<ol><li>
Executar a microinjeção de partículas na célula de gema
	<ol>
<li>Fabrica sob medidas microagulhas usando um extrator de micropipeta horizontal e vidro de borosilicato capilar (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Preparar microagulhas que têm um diâmetro externo de 1,00 mm, diâmetro interno de 0,58 mm e um comprimento de 10 cm, usando as configurações do extrator: pressão: 500; Calor: 510; Tração: 65; Velocidade: 25; Tempo: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma placa de Petri de injeção através da criação de faixas de recuo em linha reta em um agarose a 1% na cama médio de embrião empregando moldes feitos feitos sob encomenda (consulte a Tabela de materiais).<ol>
<li>Vire os moldes e colocá-los em cima do gel do agarose líquido e remover os moldes, uma vez que o gel tem solidificado. Pipete os embriões nas ranhuras feitas pelo molde no agarose sob um estereomicroscópio dissecação 1.2 ampliação de X. Nota: A largura e o projeto dos moldes permitem que os embriões alinhar o Self.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antes da injeção, remova quase completamente o meio para facilitar a injeção (a tensão de superfície impede que o embrião/córion degola para a agulha quando removê-lo após a injeção).</li>
		<li>Microinjeção de nanopartículas fluorescentes (raio um = 100 nm, consulte Tabela de materiais) diluído em água (1:1, 000) na parte vegetal da célula de gema embrião (Figura 3A).</li>
		<li>Ajustar a micropipeta com Micromanipuladores precisão e injetar os grânulos com um microinjector automático com controles de tempo e pressão (ver Tabela de materiais). Ajustar a pressão entre 10 e 20 libras por polegada quadrada.</li>
		<li>Antes de injectar a solução do grânulo, calibrar o volume para injetar (0,5 nL) medindo o tamanho das gotas, entregue pelo microinjector com um micrômetro de fase 1 x 0.01 mm (ver a Tabela de materiais).</li>
		<li>Emprega uma magnificação de 1.6 X no dissecação estereomicroscópio Visualizar os embriões durante as injeções, que são realizadas à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avaliar o comportamento viscoelástico da gema gravando flutuações térmicas
	<ol>
<li>Dechorionate os embriões microinjected como no passo 2.1 e incorporá-los em uma baixa de 0,5% de fusão ponto de agarose em solução médio de embrião a 30 ° C. Em seguida, transferi-los para placas de fundo de vidro (veja a Tabela de materiais) e orientar e empurrá-los para a lamela, quando a agarose é ainda líquido. Nota: Quando a agarose solidifica à temperatura ambiente, os embriões estão prontos para ser fotografada.</li>
		<li>Coloque os embriões montados nas placas de vidro de fundo no palco de um microscópio confocal invertido 2 h após microinjeção. Capturar imagens das nanopartículas para 26 s a uma taxa de amostragem de 25 Hz com um objetivo X 63 à temperatura ambiente em um microscópio confocal invertido empregando o software microscópio padrão comercial (tamanho de pixel = 166 nm, imagens capturadas a cada 40 ms).</li>
		<li>Calcular a posição dos centroides das partículas a e definir suas trajetórias ao longo do tempo com o plugin TrackMate do open source software ImageJ (Figura 3B).</li>
		<li>Calcule o deslocamento de Mean Square bidimensional (MSD) de cada partícula com software feito por6,30 , como: < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Nota: Aqui t é o tempo decorrido e o intervalo de tempo. Em um líquido viscoso puro, a MSD aumenta inversamente com viscosidade (ν), de acordo com a relação de Stokes-Einstein: < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) onde T é a temperatura absoluta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Aqui nós mostramos que as propriedades do material e alguns parâmetros biomecânicos da célula de gema zebrafish durante epiboly podem ser facilmente estimados pela AFM e nanopartículas microrheology.
Enquanto a AFM tem sido empregada para recuperar características reológicas de células e tecidos em condições fisiológicas,4,5,25,28, aqui nós desenvolvemos um protocolo de aplicação AFM para desenvolver intacta embriões que usamos para testar a superfície de célula de gema do zebrafish embrião durante epiboly.
Para nossas medições de AFM, a orientação dos embriões foi assegurada pela metade, incorporando-os em agarose derretimento baixo. Ainda, incorporação de agarose não afetou as medições de AFM. A rigidez da agarose foi medida por sua superfície com uma ponta esférica de sondagem. Encontramos um módulo de Young (E) de 4,2 0,2 Pa para este gel por encaixe as curvas força-recuo com a Hertz entre em contato com o modelo de uma esfera de recuo de uma superfície plana de um corpo elástico. Dado que E 3g', a agarose foi 50-fold mais suave do que o córtex de célula de gema (Figura 2D). Portanto, considerando-se sua espessura limitada e muito baixa rigidez, as medições de AFM gravadas no topo do embrião parecem ser extremamente confiável.
É importante notar que recuperar valores absolutos para tensão cortical de dados AFM exige extremo cuidado em relação a montagem do modelo mecânico. No caso da célula de gema zebrafish, com sua composição única, com uma camada externa de ricos em microtúbulos citoplasmática englobando uma massa de gema altamente viscoso, podemos contornar esse problema, empregando um modelo de balão de líquido que consiste de um córtex elástico delimitador um líquido viscoso. Este modelo tem sido usado anteriormente para estimar a tensão cortical de leucócitos com micropipeta aspiração28, células progenitoras esférico de embriões de peixe-zebra gastrulating recuados com esférico AFM dicas4e células HeLa com AFM usando encravado vigas22.
Estimamos a tensão cortical da célula gema pelo recuo de sua superfície com uma ponta esférica pequena comercialmente disponível. Esta pequena sonda nos permitiu medir diretamente as diferenças regionais na tensão cortical. Conforme descrito acima, dados de força-recuo foram interpretados em termos de um modelo minimamente líquido-balão (EQ. 2). Curvas de força gravado na superfície do gel e células com uma ponta esférica aumentam com a marca como uma lei de potência com um expoente de 3/2. Por outro lado, encontramos uma relação de força-recuo proporcional muito bem equipada com 2 eq. (Figura 2B). A pequena dependência da Tc na velocidade do cantilever e a baixa g' /g' ratio (Figura 2D) indica que a mecânica do córtex é dominada por um comportamento elástico.
Mecânica de gema foram analisadas independentemente com micropartículas reologia. O aumento linear da MSD observado claramente reflete um comportamento viscoso puro. Note-se que a viscosidade de soluções de polímero depende do tamanho da sonda31. Portanto, o valor de viscosidade de gema medimos com uma sonda de 100 nm raio poderia um pouco diferem molecular (por exemplo, fluorescem despolarização) ou medições macroscópicas. Tomados em conjunto, estes resultados fornecem forte apoio para a adequação do modelo líquido-balão e a robustez das medições de viscosidade tensão e gema corticais.
Podemos argumentar que esta abordagem pode ser facilmente estendida para medir mecânica Drosophila nos embriões mesmos ou a outros pontos de tempo de desenvolvimento no zebrafish e, eventualmente, para outros organismos. Essa aproximação só dependerá de engenharia procedimentos de montagem apropriado (ver referência32) facilitando o acesso do AFM sondas para os lugares certos na hora certa. Ainda, o movimento contínuo da maioria das células e tecidos durante o desenvolvimento deve ser tidos em conta em qualquer aplicação para outros modelos de desenvolvimento. Movimentos de célula fará a aplicação destes métodos muito mais desafiador.
Em alguns casos, AFM na vivo seria inaplicável se problemas de acessibilidade não podem ser superados. Tanto no desenvolvimento de embriões e adultos, as células são largamente inacessíveis. Assim, para testar propriedades biofísicas em situ, é imperativo para empregar métodos não exigindo direto entre em contato. Nanopartículas de rastreamento microrheology cumpre estes requisitos6. Esta técnica baseia-se na análise com alta resolução espacial e temporal dos deslocamentos browniano das partículas individuais. As propriedades micromecânicas local do fluido viscoelástico que rodeia estas nanopartículas é um reflexo direto da extensão e intervalo de tempo-dependência de seus MSDs. Essa abordagem já foi aplicada para o desenvolvimento de organismos e tem ajudado a determinar o caráter altamente viscoso do c. elegans embrião citoplasma30. Descobrimos que uma gema zebrafish exibe propriedades equivalentes com embriões de c. elegans , embora sua viscosidade é duas ordens de magnitude mais baixas. Uma dependência de tempo linear da MSD com valores similares de viscosidade de gema para aqueles da gema zebrafish, recentemente, tem sido relatada em Drosophila33.
Embora não explorar essa possibilidade nos, injetadas revestidas e não revestidas nanopartículas recentemente têm sido empregadas como alvos de Pinça óptica no zebrafish larvas34. Não-invasivos micromanipulação dentro de um todo-organismo pode dar insights-não só diretos em interações célula mas em propriedades mecânicas e actividades não acessíveis usando abordagens existentes.

Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão1 ou vídeo microscopia de força2 permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser3, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas4 ou na vivo 5 ou nanopartículas microrheology6 permitem a antecipação de um tecido propriedades mecânicas e respostas.
AFM é uma técnica topográfica tridimensional com resolução de rugosidade da superfície e conformidade da deflexão de dicas do cantilever em caso de contacto com uma superfície sondado7de alta resolução atômica. Diferentes metodologias empregando AFM foram desenvolvidas para investigar as propriedades da superfície, incluindo medição de atrito, forças de adesão e nas propriedades viscoelásticas de diversos materiais. Recentemente, a AFM tem emergido como uma ferramenta poderosa para recuperar informações sobre as propriedades mecânicas de amostras biológicas. Em particular, AFM não invasiva pode extrair o módulo de cisalhamento complexo de células únicas aplicando recuos oscilatórios com uma ponta de micro ligada a um cantilever de constante flexão conhecido8. Isto permite-nos inferir a resultante de forças. No entanto, AFM não é exclusiva e diferentes metodologias permitem extrair dados reológicos e propriedades mecânicas de células individuais (por exemplo, micropipeta aspiração9, magnético de torção cytometry (MTC)10, ou uniaxial elástica testando a11).
No entanto, a aplicação dessas novas metodologias para processos complexos morfogenéticas não é simples. Os principais desafios enfrentados na determinação das propriedades mecânicas dos tecidos embrionários são os pequenos (µm a mm), macio (no 102 - 10 intervalo de4 Pa) e natureza de visco-elástico (dando origem a fenómenos de tempo-dependente) do material12. Portanto, é importante adaptar os métodos utilizados para a determinação das propriedades mecânicas (rigidez, viscosidade, aderência) para o caso específico de embriões e organismos em desenvolvimento. Duas questões importantes devem ser tomadas em consideração quando analisando reológicas abordagens para estudar o desenvolvimento: para evitar interferência intrusiva e para fornecer fácil acessibilidade. Neste cenário, aspiração micropipeta, MTC e teste de tração apresentam limitações. No primeiro caso, a alta deformação que sofre de uma célula pode alterar suas propriedades fisiológicas e mecânicas9. No segundo caso, a necessidade de aderir firmemente o tecido experimental a um substrato para garantir que as tensões aplicadas deformam o citoesqueleto localmente também poderia apresentar efeitos no estado de ativação das células e, consequentemente, em suas características mecânicas10 . Abordagens de tração uniaxiais, últimas são limitadas pela geometria do desenvolvimento de organismos e acessibilidade11.
AFM parece ser mais adequado para o estudo de processos de desenvolvimento, pois permite o estudo de amostras biológicas diretamente em seu ambiente natural sem qualquer preparação da amostra pesada. Além disso, como a dissociação dos tecidos embrionários é geralmente difícil, o tamanho reduzido das sondas AFM fornece um alto grau de versatilidade com nenhuma limitação na escolha do tipo de meio (aquoso ou aquosos), temperatura da amostra ou produto químico composição da amostra. AFM é versátil o suficiente para ser aplicado a grandes domínios e escalas de tempo e tem sido empregada para recuperar propriedades materiais de tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento ou em condições fisiológicas. Todo nativos tecidos tais como artérias13 ou ossos14 foram estudadas do ponto de vista topográfico e em alguns casos, como a esclera, propriedades mecânicas também foram recuperados15. Topografia também tem sido explorada em embriões ao vivo, permitindo a visualização de, por exemplo, o rearranjo de célula durante a morfogênese em Xenopus16. Protocolos de preparação abrangente, última amostra foram desenvolvidos para determinar parâmetros mecânicos durante os processos de desenvolvimento diferentes. Nanoindentação mapas foram gerados em secções de tecido unfixed nativo para o filhote embrionário do aparelho digestivo,11; propriedades adesivas e mecânicas obtida para células individuais ectoderme, mesoderme e endoderme progenitoras isoladas de gastrulating zebrafish4embriões; realizadas medidas de rigidez para o epiblasto e raia primitiva em explantes de embriões aviários17; e um padrão distinto de gradientes de rigidez definidos diretamente no cérebro embrionário do Xenopus5.
Um salto qualitativo significativo para a aplicação de AFM para explorar o desenvolvimento embrionário pode vir de aproximação simples processos morfogenéticas acessíveis. Zebrafish epiboly é um evento essencial e conservado, em que diferentes tecidos coordenam em um espaço restrito esférico para direcionar a expansão da Drosophila em poucas horas. No início da epiboly zebrafish (fase esférica), uma camada superficial de células, a camada envolvente (EVL), abrange um boné semi-esférico de blastómeros centrada no polo animal do embrião sentado em uma cela sincicial gema maciça. Epiboly consiste a expansão cortical ala vegetal do EVL, as células profundas (DCs) da Drosophila e a camada externa da célula em torno da gema gema sincicial (E-YSL). Epiboly termina com o encerramento do EVL e as DCs no polo vegetal18,19,20. Como e onde as forças são geradas durante a epiboly e como eles são acoplados globalmente ainda não está claro1,21.
Aqui descrevemos detalhadamente como aplicar AFM para inferir Propriedades tecido mecânico passivo durante progressão epiboly a gema de zebrafish celular na vivo. Para isso, usamos pequenas microesferas anexadas a AFM cantilevers como sondas. Isto permite a recuperação de informações locais precisas dentro da superfície de células não-uniforme de gema e estudar gradientes tensionais e sua dinâmica ao longo do tempo. AFM alternativo aproxima-se como aqueles que usam Cunha cantilevers22, will não processar dados local que é suficientemente precisos. A técnica de cunha, que requer habilidades de manipulação muito cuidado para colar um pedaço maior do que o tamanho da amostra no final do cantilever, não é adequada para sondar o embrião (~ 2 dobras maiores que o comprimento do cantilever) mecânica.
Modelagem e caracterizar as propriedades viscoelásticas de células de forma qualitativa e quantitativa permitem uma melhor compreensão da sua biomecânica. Do ponto de vista biomecânico, é essencial para compreender a epiboly e não apenas a demanda conhecimento em medições de tensão cortical e dinâmica, que pode ser extraída por AFM; assim, não há necessidade de informações sobre as propriedades biofísicas do tecido. Para extrair essas informações, uma variedade de técnicas de reologia celular foram desenvolvidos ao longo dos anos para caracterizar os diferentes tipos de células sob diferentes condições fisiológicas23. Eles incluem AFM, MTC e pinças ópticas (OT). Esses métodos, no entanto, têm provados inadequados para mesoscópica análises na escala de embriões ou órgãos. Como alternativa, adaptámos com êxito acompanhamento de nanopartículas microrheology6 para medições reológicas na vivo . Esta técnica analisa os deslocamentos browniano das partículas isoladas e infere Propriedades micromecânicas local.
Junto microrheology AFM e nanopartículas permite a definição de dinâmica tensional cortical e propriedades mecânicas internas da gema durante epiboly. Esta informação apoia plenamente um modelo no qual anisotrópica stress desenvolve-se em consequência as diferenças na resposta de deformação do EVL e a camada citoplasmática de gema (YCL) para a contração isotrópica actomyosin do córtex E YSL é essencial para o movimento líquido direcional da EVL e epiboly progressão1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Elucidar os fatores que direcionam a organização espaço-temporal de evolução tecidos é uma das principais finalidades no estudo do desenvolvimento. Várias proposições afirmam ter sido importantes contribuições para o entendimento das propriedades mecânicas de células e tecidos em sua organização spatiotemporal em diferentes processos de desenvolvimento e morfogenéticas. No entanto, devido à falta de ferramentas confiáveis e acessíveis para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo, validar estas hipóteses tem sido difícil. Aqui nós apresentamos métodos empregando microscopia de força atômica (AFM) e partículas de rastreamento com o objectivo de quantificar as propriedades mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Epiboly é um processo de desenvolvimento precoce conservado cujo estudo é facilitado pela transparência do embrião. Esses métodos são simples de implementar, confiáveis e amplamente aplicável, desde que eles superam intrusivas intervenções que poderiam afetar a mecânica do tecido. Uma estratégia simples foi aplicada para a montagem de amostras, gravação de AFM e injeções de nanopartículas e rastreamento. Esta abordagem faz com que esses métodos facilmente adaptável para outros tempos do desenvolvimento ou organismos.

Medições de tensão cortical Para cada ponto de medição, cinco curvas força-deslocamento (F-z) foram adquiridas pela AFM pela rampa cantilever com uma amplitude de pico-a-pico de 5 µm a 1 Hz (velocidade = 10 µm/s) até um recuo máximo de ~ 2 µm. Este procedimento estava a menos de 20 min e não foi afectado pela progressão epiboly. Cada condição experimental foi testada pelo menos 5 embriões.
As curvas de força-deslocamento gravadas no celular de gema embrião, ao contrário para os correspondentes para o macio agarose circundante, apresentam uma relação linear proporcional (R2 > 0.999) (Figura 2A). Realizamos conjuntos adicionais de controle F-z curvas em 3 µm/s e 30 µm/s e Descartado uma potencial dependência de tensão cortical Tc a velocidade do cantilever. Tc aumentou apenas 13% (p < 0,01, teste-t) quando a velocidade foi reduzida de 10 para 3 µm/s e não mostrou qualquer alteração significativa, quando aumentou de 10 a 30 µm/s.
Curvas de força-recuo (F-h) gravadas a uma velocidade de cantilever de 10 µm/s na célula gema foram quase linear e estão equipados com um modelo de líquido-balão (Figura 2B)1. Este encaixe permitiu o cálculo dos valores absolutos de tensão de superfície média (pN/µm) em epiboly diferentes fases e em diferentes posições em relação à borda do líder EVL (identificados sob luz transmitida) (tabela 1).
Reologia do córtex As diferenças entre o recuo e a retração das curvas força-deslocamento (F-z) (Figura 2) indicam um comportamento viscoelástico do córtex de célula de embrião gema. Baixa amplitude (100 nm) medições de oscilação de multifrequência fornecem a informação para calcular o módulo complexo eficaz g*(ƒ) da superfície da pilha de gema e seus componentes elásticos e viscosos (Veja o protocolo acima).
A reologia do córtex na célula de gema zebrafish embrião é dominada por um comportamento de sólido com o módulo viscoso 5 vezes menores que o módulo elástico1. Esse comportamento não é frequência dependente, seja para o elástico (ANOVA, p = 0.123), ou para o módulo viscoso (ANOVA, p = 0.719) (Figura 2D).
Reologia da gema A viscosidade da gema foi computadorizada por encaixe a equação (5) os dados MSD obtidos a partir de nanopartículas de rastreamento (ver Figura 4A-B). A MSD de flutuações térmicas de nanopartículas fluorescentes incorporadas a gema apresenta uma dependência proporcional no intervalo de tempo τ, consistente com o comportamento de um líquido Newtoniano. A viscosidade de cisalhamento eficaz da gema, que está inversamente relacionada com os coeficientes de difusão em massa das nanopartículas, foi 129 mPa · s.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56224/56224fig1.jpg"> Figura 1: AFM de células de gema zebrafish in vivo. (A) diagrama descreve o conjunto acima empregou para sondar o córtex de célula de gema zebrafish por AFM. Dechorionated embriões de diferentes idades foram meio inserido nos orifícios criados em blocos de agarose personalizado, girado em uma determinada orientação e selado nas bordas com agarose de baixo ponto de fusão. As células de gema foram analisadas com esferas de poliestireno esféricas anexadas a um cantilever (vermelho). (B) embrião em epiboly de 50%, que metade incorporado em agarose sondado com um cantilever (falso colorido em vermelho) no polo vegetal. (C) um embrião equivalente àquele em B, sondou a cela de gema em uma região perto da margem de células EVL. Barras de escala = 100 µm (B e C). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56224/56224fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56224/56224fig2.jpg"> Figura 2. Zebrafish embrião gema célula cortical tensão e reologia. (A) força [deflexão (d)]-curvas de deslocamento (z) obtidos por um embrião representativo como a ponta do cantilever se aproxima e entra em contato com a amostra [a superfície de agarose (controle) em azul] e superfície celular de gema em vermelho. (B) força curvas de recuo (F-h) (n = 3 embriões, 3 medições por embrião a uma distância de 10 µm do outro. Cada medida representa a média de 5 curvas) se encaixam com um modelo da líquido-balão (de referência1). Observe o aumento linear da deflexão em contacto com a superfície da célula de embrião gema. A linha preta pontilhada mostra o encaixe para o modelo (do qual a tensão cortical é inferida). (C) aproximação (vermelho) e as curvas de força-deslocamento de retração (roxo) para um embrião representativa. Setas vermelhas e roxas curvas apontam para o regime temporal da recolha de dados. A seta de duas pontas, destaca a diferença entre a aproximar-se e retraindo valores de deflexão, apontando para o caráter de viscoelástico do córtex. (D) viscoelasticidade do córtex celular gema (n = 5 embriões). Módulo complexo eficaz (g *) extraído de oscilações de multifrequência medições AFM (de 1). Símbolos vermelhos representam o módulo de elasticidade (g'), e azuis símbolos definem o módulo viscoso (g″), respectivamente. Quer dizer e erro padrão (SE) são exibidos. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56224/56224fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56224/56224fig3.jpg"> Figura 3. Microrheology de rastreamento de partículas. (A) de nanopartículas fluorescentes são injetadas na célula gema de zebrafish embriões em epiboly de 50%. (B) deslocamentos foram seguidos por nanopartículas individuais distribuídas aleatoriamente dentro da gema (à esquerda). Curso de tempo das trajectórias típico de nanopartículas (centroides) incorporado dentro a gema (2 exemplos) passeios aleatórios de exposição que são característicos de difusão viscosa. Barra de escala = 100 µm (A); 1 µm (B, esquerda); 200 nm (B, direita). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56224/56224fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56224/56224fig4.jpg"> Figura 4. Microrheology da gema embrião zebrafish. (A) MSDs de nanopartículas individuais (n = 99) apresentam uma dependência aproximadamente linear com intervalo de tempo. (B) média ± erro padrão MSDs de nanopartículas e viscosidade da gema. Ensemble em média MSDs (média - linha vermelha ± SE) do personagem de nanopartículas população exposições predominantemente viscoso. A inclinação linear da relação reflete as propriedades difusiva das nanopartículas. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56224/56224fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2" rowspan="2">Tensão (pN/mm) média ± SE</td>
			<td colspan="3">% de Epiboly</td>
		</tr>
<tr>
<td>40-50</td>
			<td>60-70</td>
			<td>80-90</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Distância até a margem do EVL</td>
			<td>20 μm (E-YSL)</td>
			<td>-</td>
			<td>60 ± 7</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>40 μm (YCL)</td>
			<td>67 ± 11</td>
			<td>72 ± 5</td>
			<td>110 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polo vegetal</td>
			<td>-</td>
			<td>75 ± 3</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">n = 3 embriões (5 indentações em cada um) para cada condição</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Distribuição de tensão espácio-temporais na superfície da célula de gema durante Epiboly.

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K visualizações.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.

Vídeo: AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient utilization by avian embryos during development. Fertilized Japanese quail eggs were incubated at 37 &#176;C for 5 days and then yolk sac membranes (YSM) were collected to establish the EEC culture system. We isolated the embryonic endoderm layer from YSM, and sliced the membrane into 2 - 3 mm pieces and partially digested with collagenase before seeding in 24-well culture plates. The EECs proliferate out of the tissue and are ready for cell culture studies. We found that the EECs had typical characteristics of YSM in vivo, for example, accumulation of lipid droplets, expression of sterol O-acyltransferase and lipoprotein lipase. The partial digestion treatment significantly increased the successful rate of EEC culture. Utilizing the EECs, we demonstrated that the expression of SOAT1 was regulated by the cAMP dependent protein kinase A related pathway. This primary Japanese quail EEC culture system is a useful tool to study embryonic lipid transportation and to clarify the role of genes involved in mediating nutrient utilization in YSM during avian embryonic development.

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Primária endodérmico epitelial Cultura de Células da gema Sac Membrana de japoneses codorniz Embriões

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Eficácia do ar despojamento em dois peixes salmonídeos, truta arco-íris (Oncorhynchus Mykiss) e truta (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...