German Legal Casualty Insurance (DGUV), Research Commission of the Medical Faculty of the Heinrich-Heine-University

diretrizes institucionais para a segurança do animal e conforto foram cumpridas, e todas as intervenções cirúrgicas e cuidados pré e pós-cirúrgico animais foram fornecido em conformidade com a lei de Proteção Animal Alemão (Secretaria de Estado, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor da Renânia do Norte- Vestefália, LANUV NRW ). 1. transecção completa da medula espinhal torácica de ratas Wistar (220-250 g) <ol><li> Preparação da Medula Espinhal <ol><li> Utilizar anestesia por inalação de isoflurano (2-3% de isoflurano em O2 / NO 2 numa proporção de 1: 2) e injecção de bolus de carprofeno (por via subcutânea [SC] 5 mg / kg). A combinação de buprenorfina e carprofeno opióide (0,02 mg / kg sc) é recomendado. Comece a cirurgia, quando pálpebra reflexo ao toque leve com um cotonete e da pata reflexo de retirada para beliscar estímulo com uma pinça não são mais observadas. </li><li> Colocar o animal sobre uma manta de aquecimento a 37 ° C para manter a temperatu do corpore durante a cirurgia e colocar pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Raspar as costas do animal e de preparar a pele com um desinfectante da pele. </li><li> Cortar a pele na linha média ao longo das vértebras torácica para 4 cm, com uma lâmina cirúrgica e abri-lo. A partir desta etapa, use esterilizado instrumentos cirúrgicos para todos os procedimentos (autoclavado ou imersão-esterilizado). </li><li> Retrair os músculos acima da vértebra torácica, usando uma pequena músculos braçadeira. </li><li> Remover os processos espinhosos no nível torácico 8 (TH8) e Th9 com um rongeur óssea por cautela recorte pequenos pedaços de osso até que os ossos vertebrais são planas. </li><li> Use uma pinça anatômicas para levantar a coluna vertebral no processo espinhoso Th7 e usar um rongeur para cortar pequenos pedaços de osso vertebral de caudal a rostral até uma laminectomia é realizada a TH8 e Th9. Expor a dura-máter sem o danificar, removendo cuidadosamente poucos e muito pequenos pedaços de osso vertebral de cada vez.</li><li> Prender o esqueleto por 2 grampos de estabilização de processos espinhosos Th7 e Th10, levante o animal para desacoplar os movimentos respiratórios do vértebras. </li></ol></li><li> Conclua transecção medular em Thoracic Nível 8/9 <ol><li> Levante a dura-máter com uma pinça fina, corte a dura-máter com uma tesoura olho finos no sentido transversal. </li><li> Segurar a extremidade do corte lateral da dura-máter com uma pinça fina e inserir um gancho da coluna vertebral para dentro do espaço entre a dura-máter subarachnoidic e Arachnoidea. Evitar danos das meninges, não picar na pia ou dura-máter, quer com fórceps ou gancho medula espinhal. </li><li> Lentamente gire o gancho para colocá-lo ao longo de todo o tecido da medula espinhal, tomando cuidado para não picar na dura-máter (pia ainda está intacto). </li><li> Levantar a medula espinhal durante cerca de 1 - 2 mm para cima, até que uma abertura é visto no lado ventral da medula espinal entre o tecido e a dura. </li><li> Insira tesoura olho finos no espaço betweeN dura-máter e Pia e corte da espinal medula enquanto o gancho da coluna vertebral é deixado no lugar. </li><li> Levante os dois tocos da medula espinhal com duas pinças e visualmente garantir transecção completa. </li><li> Para os animais lesionados de controlo e animais com uma lesão crônica, feche a dura por suturas interrompidas com monofilamento não-absorvíveis 9,0 threads. </li><li> Para lesões crônicas siga parte 1.6. </li></ol></li><li> MMS Implantação <ol><li> Coloque MMS acima do local da lesão, com os dois tubos encontram-se em cada face lateral da vértebra e baixá-la para dentro da cavidade lesão. </li><li> tubos de sutura para os músculos na parte lateral da vértebra com não-reabsorvível 4-0 para assegurar a estabilização do MMS. Certifique-se de uma fixação do MMS usando uma pinça durante esta etapa. </li><li> Remover o pino de ligação MMS por corte com um par de tesouras finas. </li><li> Feche a dura acima das MMS e sutura com 9,0 threads. </li><li> Anexar um tubo para a bomba de vácuo, e selara outra por aperto. </li><li> Aplicar pressão negativa suave para o MMS por uma bomba de vácuo através do tubo aberto, sugando os cotos da medula espinhal para a luz MMS. Aplicar a pressão negativa durante vários minutos (no máximo durante 10 minutos) e monitorizar, através de sensores (250-350 mbar). </li><li> Corte os tubos de perto o MMS e remover os tubos. Continue com a Etapa 1.6. </li></ol></li><li> Ressecção de tecido da medula espinhal Incluindo o Scar lesão crônica na Semana 5 após a lesão inicial <ol><li> Siga os passos 1.1.1 - 1.1.5. </li><li> Identificar tecido cicatricial pela aparência castanha-amarela e tecido rígido na parte superior da medula espinhal. Remova cuidadosamente camadas superficiais de tecido cicatricial, segurando com uma pinça fina e corte com tesoura fina. Com este método, reabrir o local da laminectomia para expor o tecido que contém a área de lesão da medula espinal. Pare de preparação, quando a sutura dura é visualmente identificado. </li><li> Prender o esqueleto por 2 a estabilização grampos no Spinprocessos ous TH7 e TH10, e, em seguida, elevar o animal para desacoplar os movimentos respiratórios do vértebras. </li><li> Com uma pequena régua cartão medir a área da espinal medula o que é para ser ressecado (comprimento: 4 mm) e marcar as bordas desta respectiva área do tecido com incisões transversais para permitir a remoção subsequente do tecido. </li><li> Remover o tecido cicatricial através de uma combinação de corte e aspiração. Retire o tecido que foi separado a partir da medula espinal com as incisões transversais. Use ligeira aspiração sempre que é suficiente para permitir a remoção do tecido. Além disso, sempre que a textura rígida do tecido da cicatriz faz a aspiração do tecido muito difícil, utilizar tesouras finas para cortar e remover este tecido. </li><li> Inserir uma peça (aproximadamente 5 mm x 5 x 5 mm cubo) da esponja de gelatina hemostática na abertura do tecido até subsídios sangramento. A esponja de gelatina irá diminuir de tamanho assim que é embebido com o líquido. </li></ol></li><li> Implantation de PEG 600 <ol><li> Prepare 1 ml de PEG 600 puro sem diluição para injecção por aquecimento a 37 ° C. </li><li> Remover esponja de gelatina. </li><li> Inserir quantidade suficiente (cerca de 5-7 ul) de PEG para o fosso utilizando uma seringa de 10 ul ou 10 ul de uma pipeta. </li><li> Cuidadosamente cobrir a área com uma parte (cerca de 5 mm x 4 mm) de substituição selante / dura-máter. </li><li> Corrigir o vedante circundante para o tecido muscular com algumas gotas de cola de tecidos. Colocar o vedante na parte superior do hiato ressecção PEG-cheia. Para evitar o deslizamento do selante, utilizar pequenas gotas de cola de tecido para fixar os cantos do selante para o tecido muscular circundante. Nota: o evitar a fuga de cola de tecidos para o tecido da medula espinhal! </li></ol></li><li> Encerramento do tecido e Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> músculos de sutura e camada de pele para camadas com suturas interrompidas com trançados absorvíveis 4-0 </li><li> Injectar 2 × 2,5 ml de cloreto de sódio (NaCl[0,9%]) a 36 ° C sc para reidratação após a cirurgia. Uma única injecção de 5 ml de NaCl que esticar a pele do animal e pode causar danos desnecessários ao animal. Não deixe sem vigilância animal até a plena consciência é recuperada. </li><li> Injectar carprofeno diária (sc de 5 mg / kg) durante pelo menos 2 dias após a cirurgia. Casa animal em única gaiola durante os primeiros 2 dias, depois em grupos de 2-3. </li><li> Aplicar o tratamento com antibióticos (administração oral diária de enrofloxacina) para a primeira semana de pós-operatório. </li><li> Faça bexiga manual de miccional em duas a três vezes por dia até gentilmente acariciando a barriga do animal de rostral para caudal. Tenha cuidado para não mover a coluna vertebral do animal e não levante o animal na cauda. anular manualmente bexiga do animal completamente spinalized diariamente durante todo o tempo de sobrevivência. Cuidados devem ser tomados para colocar pelotas de comida e garrafas de água em uma altura que pode ser alcançado pelos animais semde pé sobre suas patas traseiras. Embora sendo prejudicada em função traseira trimestre, os animais se movem e explorar as gaiolas ativamente imediatamente após a cirurgia. Recomenda-se a manter os ratos em grupos sociáveis. </li><li> Para lesões crônicas deixar um tempo de sobrevivência dos animais de cinco semanas antes da ressecção da cicatriz. Siga os passos 1.4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramer, L. M., Ramer, M. S., Bradbury, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+after+spinal+cord+injury:+towards+clinical+translation+of+experimental+strategies.">Restoring function after spinal cord injury: towards clinical translation of experimental strategies.</a> The Lancet. Neurology. 13 (12), 1241-1256 (2014).</li><li>McDonald, J. W., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+the+damaged+spinal+cord:+a+summary+of+our+early+success+with+embryonic+stem+cell+transplantation+and+remyelination.">Repairing the damaged spinal cord: a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination.</a> Prog. Brain Res. 137, 299-309 (2002).</li><li>Yoon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+injury+treatment+using+autologous+bone+marrow+cell+transplantation+and+bone+marrow+stimulation+with+granulocyte+macrophage-colony+stimulating+factor:+Phase+I/II+clinical+trial.">Complete spinal cord injury treatment using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophage-colony stimulating factor: Phase I/II clinical trial.</a> Stem Cells. 25 (8), 2066-2073 (2007).</li><li>Brotchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spinal+cord+tumor+resection.">Intrinsic spinal cord tumor resection.</a> Neurosurgery. 50 (5), 1059-1063 (2002).</li><li>Estrada, V., Tekinay, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+ECM+mimetics.">Neural ECM mimetics.</a> Prog. Brain Res. 214, 391-413 (2014).</li><li>Tetzlaff, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Cellular+Transplantation+Therapies+for+Spinal+Cord+Injury.">A Systematic Review of Cellular Transplantation Therapies for Spinal Cord Injury.</a> J.Neurotrauma. 28 (8), 1611-1682 (2010).</li><li>Brazda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+microconnector+system+for+restoration+of+tissue+continuity+and+long-term+drug+application+into+the+injured+spinal+cord.">A mechanical microconnector system for restoration of tissue continuity and long-term drug application into the injured spinal cord.</a> Biomaterials. 34 (38), 10056-10064 (2013).</li><li>Estrada, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+significant+functional+improvement+in+chronic+severe+spinal+cord+injury+following+scar+resection+and+polyethylene+glycol+implantation.">Long-lasting significant functional improvement in chronic severe spinal cord injury following scar resection and polyethylene glycol implantation.</a> Neurobiol. Dis. 67, 165-179 (2014).</li><li>Rasouli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+glial+scar+following+spinal+cord+injury.">Resection of glial scar following spinal cord injury.</a> J.Orthop.Res. 27 (7), 931-936 (2009).</li><li>Schira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+clinical,+neuropathological+and+behavioural+recovery+from+acute+spinal+cord+trauma+by+transplantation+of+a+well-defined+somatic+stem+cell+from+human+umbilical+cord+blood.">Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood.</a> Brain. 135, 431-446 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui duas abordagens cirúrgicas diferentes são apresentados para colmatar as lacunas de tecido da medula espinhal após o implante (1) aguda transecção completa e MMS e (2) lesão medular crônica e remoção da cicatriz fibrosa mais implantação de matriz PEG. Ambas as estratégias de levar a conservação de tecidos e de regeneração axonal, bem como a melhoria funcional significativa locomotora dos animais tratados. Para MMS implantação de uma fixação adequada do MMS dentro da medula espinhal pela sutura dura firme após a cirurgia é um passo técnico crítica. O MMS detém mais potencial terapêutico devido ao seu sistema de microcanais interno implementado que permite a infusão local de líquidos, terapeuticamente activas para o núcleo da lesão via, por exemplo., Uma mini-bomba osmótica anexo 7. Para o seu uso clínico futuro pretendido, o material MMS deve ser bioresorbable. Actualmente, a fabricação de sistemas de conexão composta de materiais à base de láctido ésendo testado. Além disso, o revestimento dos MMS com um material condutor electrónico será estabelecido a fim de aplicar campos elétricos terapêuticos para a medula espinhal lesionada. Quanto a lesões da medula espinhal crônica, outra estratégia foi seguida, uma vez que a tensão física dos cotos da medula espinhal separadas após a remoção cicatriz cirúrgica apareceu muito alto se um hiato de vários milímetros devem ser cruzados. Surpreendentemente, o baixo peso molecular de PEG de 600 provou ser um biopolímero altamente adequados para preencher a lacuna resultante. Ele permite a formação de uma ponte de tecido estável, que promove a angiogénese e invasão celular de tipos de células benéficos. Presume-se que as propriedades físicas de PEG600, como a sua viscosidade, desempenham um papel importante para a eficácia observada uma vez que outros tipos de PEG-com pesos e / ou viscosidades moleculares superiores ou inferiores não eram tão benéfico. Colmatando a lacuna menor após transecção aguda com o romance conectorsistema levar a uma melhoria funcional clara tão cedo quanto 4 semanas após a lesão. Os respectivos animais atingiram uma pontuação a certificação de aproximadamente 7 por esse tempo e claras diferenças entre MMS animais e ratos de controlo foi aparente. Cronicamente ferido animais que receberam uma ressecção da cicatriz e PEG-implantação também recuperou significativamente melhor do que os controles não tratados, mas as melhorias foram notáveis ​​na maior parte em posteriores momentos (depois de aproximadamente 16 semanas). Estas observações podem ser explicadas pela natureza da lesão (isto é., Aguda vs. crónica, e um milímetro vs 4 milímetros defeito do tecido). No caso de as lesões maiores, o crescimento regenerativo de axónios através do local da lesão requerem períodos de tempo mais longos. Além disso, é muito provável que os períodos de tempo mais longos sem utilização dos membros posteriores resultar em graus mais elevados de eventos degenerativas e, portanto, em melhorias funcionais menos proeminentes. otimização futuro do tratamento PEG após spi crônicalesão nal cabo, via abordagens combinatórias, por exemplo., a semeadura adicional do PEG com (STEM) células promotoras do crescimento, como as células do sangue do cordão umbilical 10 in vivo, estão actualmente a ser testados.

Uma lesão traumática da medula espinal, não só conduz à perda de axónios mas novos resultados em defeitos de tecidos que impedem qualquer resposta regenerativa (para revisão ver 1,2). tecido da medula espinhal muitas vezes é perdido através de degeneração secundária que conduz à formação de cistos ou furos em torno da área da lesão. A maioria das intervenções terapêuticas experimentais focar incompletos danos na medula espinhal como transecção, esmagamento ou contusão lesões parciais, com uma borda restante do tecido saudável. Para lesões completas como totais transecções resultantes de acidentes traumáticos ou intervenções cirúrgicas, tais como ressecções tumorais, apenas a opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis hoje 3,4. Após transsecção completa, a tensão mecânica dos resultados dos tecidos em retracção coto espinal, deixando uma pequena abertura na medula espinhal. A maioria das estratégias concentrar em preencher esta lacuna com tecidos, células ou matrizes 5,6. Aqui, uma estratégia diferenteé apresentada, ou seja, re-adaptação dos tocos separados usando um novo dispositivo microconnector 7. A fim de readaptar os dois cotos, força mecânica tem de ser aplicado como uma ligeira pressão negativa para alcançar este (Figura 1). O sistema microconnector mecânica (MMS) é um sistema multi-canal de polimetilmetacrilato (PMMA) com buracos em forma de favo de mel (Figura 1A), munido de um sistema de tubulação de saída. É implantado tecido na abertura resultante da transecção da medula espinal completa no rato (Figura 1C). Um tubo pode ser ligado a uma bomba de vácuo para aplicar pressão negativa para o MMS (Figura 1D). A pressão puxa os cotos medulares desconectados em os furos em forma de favo de abelha do MMS, que têm paredes microestruturadas para manter o tecido no lugar quando a pressão é libertada (Figura 1B). A tubagem pode ser deixada intacta após a cirurgia e ligado a uma mini-bomba osmótica, a fimsubstâncias para infundir para o núcleo da lesão (Figura 1E-F). Além de uma transecção aguda da medula espinhal outro tipo de resultados lesão completa da remoção cirúrgica de um tumor espinhal ou uma cicatriz lesão crônica sólida levando a grandes lacunas de tecido de vários milímetros, o que não pode ser superado pelo MMS até agora. A maioria dos pacientes com trauma da espinal medula sofre de lesões crónicas. Nesses pacientes, uma cicatriz totalmente desenvolvido ocupa o núcleo lesão. A remoção cirúrgica da lesão cicatriz é um conceito para o tratamento, que é actualmente investigada após SCI experimental 8,9. Enquanto o procedimento de ressecção em si pode ser realizada sem causar dano adicional considerável, o hiato de tecido resultante tem de ser ligados em ponte com uma matriz adequada que permite e promove a regeneração de tecido e, no caso específico de lesões da medula espinal, a regeneração das fibras nervosas para manter e promover funções locomotoras. isso foiverificaram que de baixo peso molecular, polietileno-glicol (PEG 600) é um material muito adequado para este fim. Sua falta de imunogenicidade e da viscosidade muito baixa permitem uma integração harmoniosa no tecido circundante. A inserção do biopolímero só promove a invasão de células benéficos, incluindo células endoteliais, células de Schwann, periféricos, e os astrócitos, e - muito importante - a regeneração e alongamento dos axónios de descendente e ascendente feixes de fibras, bem como a sua ensheathment por mielina compacta 8. Estas respostas regenerativas foram encontrados para ser acompanhada de longa duração melhorias funcionais. A combinação de ressecção do tecido cicatricial e subsequente implantação de PEG 600 apresenta um meio seguro e simples, mas muito eficaz para atenuar os defeitos de tecidos de medula espinal substanciais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG 600 Ph Eur&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck/VWR&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8,170,041,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelastypt gelatine sponge&#160;&#160;</td>
			<td>sanofi Aventis</td>
			<td>PZN-8789582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nescofilm Sealant&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2569.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rimadyl (Carpofen)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forene (Isoflurane)</td>
			<td>Abbvie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodan (skin disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoacryl (tissue glue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16020-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-in-one Micro Spatula - 12 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #7 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spinal cord hook&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10162-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp&#160;</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>EA016R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon Vicryl 4-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-retaining retractor&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skin clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluspray&#160;</td>
			<td>Selectavet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental strategies to bridge large tissue gaps in the injured spinal cord after acute and chronic lesion

Depois de uma lesão da medula espinal (SCI) forma-se uma cicatriz no núcleo lesão axonal que dificulta a regeneração. Transpondo o local da lesão após um insulto para a medula espinhal, ressecções de tumor, ou defeitos do tecido resultantes de acidentes traumáticos pode ajuda e facilitar a reparação dos tecidos em geral, bem como o crescimento regenerativo de fibras nervosas para dentro e para além da área afectada. Duas estratégias de tratamento experimentais são apresentados: (1) a implantação de um novo dispositivo microconnector em uma medula espinhal de ratos torácica aguda e totalmente seccionado se readaptar cortado tocos tecido da medula espinhal, e (2) enchimento de polietilenoglicol do site da SCI em ratos cronicamente lesionados após ressecção da cicatriz. A lesão medular crônica neste modelo é uma transecção medular completa, que foi infligido 5 semanas antes do tratamento. Ambos os métodos têm recentemente alcançado resultados muito promissores e promovido rebrota axonal, invasão celular benéfica e melhorias funcionaisem modelos de roedores de ferimento da medula espinal. O sistema microconnector mecânica (MMS) é um sistema multi-canal composto de polimetilmetacrilato (PMMA) com um sistema de tubulação de saída para aplicar pressão negativa para o MMS lúmen puxando, assim, os cotos da medula espinhal nos orifícios estruturado em favo de mel. Após a sua implantação em tecido o fosso um milímetro o tecido é sugado para dentro do dispositivo. Além disso, as paredes interiores das MMS são microestruturada para uma melhor adesão do tecido. No caso da abordagem de ferimento da medula espinal crónicas, tecido da medula espinhal - incluindo a área da lesão a cheio de cicatriz - é ressecado por uma área de 4 mm de comprimento. Após a ressecção da cicatriz microcirúrgico da cavidade resultante é preenchido com polietileno glicol (PEG 600), que se verificou proporcionar um excelente substrato para a invasão celular, revascularização, a regeneração axonal e mesmo a remielinização in vivo compacto.

Tissue Preservation, axonal rebrota e benefício funcional de MMS Implantação após aguda transecção completa da medula espinhal Demonstrou-se que a implantação aguda dos MMS estabilizado os cotos medula espinal completamente seccionada e diminuição da contracção do tecido (Figura 2A contra B). Como visualizado por coloração com Tricromo em cortes sagitais, a coloração verde do tecido conjuntivo fibrótico da cicatriz no núcleo da lesão é muito mais denso e mais proeminente em animais lesionados de controlo (Figura 2d) do que em animais implantados MMS (Figura 2C). Curiosamente, não houve diferenças observadas no tempo de sobrevivência longas na acumulação de macrófagos no local da lesão como visualizadas por coloração imuno-histológica contra ED-1 em MMS implantados versus animais de controlo lesionados (não mostrado). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Imediatamente após a implantação, falta de tecido no lúmen MMS foi observado que foi posteriormente enchidos com células e tecido após vários dias. Ao fim de 5 semanas pós-cirurgia enorme crescimento interno axonal para o lúmen do MMS pode ser detectado (Figura 3A). Além disso, o MMS lúmen foi vascularizados (Figura 3B) e as estruturas axonais foram encontradas em estreita proximidade dos vasos sanguíneos (não mostrado). Avaliação do campo aberto Basso-Beattie-Bresnahan pontuação locomotora (BBB), revelou uma melhoria significativa funcional de animais MMS-implantados (linha preta na Figura 3C) versus animais lesionados de controlo (linha a cinzento na Figura 3C) às 2 e 4 semanas pós-cirurgia. Celular Invasion, revascularização, axonal Regeneração e melhoria funcional no Cabo Ferido Rats crônicas da coluna vertebral após Scar ressecção e PEG Implantação No modo de lesão crônicasl de transecção da medula espinhal torácica tanto parcial e completa a remoção cirúrgica da cicatriz da lesão na semana cinco após a lesão inicial não causa nenhum dano adicional detectável ou desconforto aos animais. Ressecção de cicatriz e subsequente inserção de PEG 600 conduziu à regeneração do tecido do qual foi detectável dentro da matriz (Figura 4). Além disso, a deposição de revestimentos de colagénio extracelular - o que é típico para a malha da membrana basal de tecidos cicatriciais - não era tão proeminente após PEG-tratamento (Figura 4C), em comparação com os controlos só de lesão (Figura 4B). Em contraste com a cicatriz crónica dos controles só de lesão (não mostrado), o local da ressecção de enchido-matriz foi invadido por células promotoras de crescimento de axónios após a ressecção. Já tão cedo quanto uma semana após a ressecção e tratamento de vários tipos de células benéficos na área da matriz pode ser identificada tal como as células endoteliais (que se verificou estar presente na regeneração de sangue vessels [Figura 4D]), astrócitos (Figura 4F) e células de Schwann periféricos (Figura 4G). Cinco semanas após a ressecção da zona tratada com PEG é preenchida com numerosos perfis axonais (Figura 4E). A matriz de PEG promoveu o crescimento regenerativo substancial de numerosos axónios (Figura 4D, E, G). Com o rastreamento estudos e coloração imuno-histoquímica, vários ascendentes e descendentes populações axonal poderiam ser identificados que regenerados não só para, mas também para além da área PEG-cheias 8. Transmissão EM análises da área tratada de animais com um período de sobrevivência a longo (8 meses), não só confirmaram a presença de células de Schwann, mas revelou mais compacto mielinização dos axónios regenerados no interior da matriz de PEG-8. perfis de axônios regenerados foram frequentemente associadas com áreas de angiogênese(Figura 4D). Colorações imuno-histoquímica demonstrou que os perfis dos axônios que foram encontrados na área ressecção tratados estavam intimamente associados com células de Schwann e parecia estar mielinizadas por já estas células em pontos de tempo iniciais após a ressecção e implantação 8. A longo prazo (oito meses) estudo comportamental revelou locomotores de longa duração melhorias substanciais funcionais após a ressecção da cicatriz crónica e PEG-tratamento (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig1.jpg" /> Figura 1. MMS desenho e princípio de funcionamento (A) imagem fotográfica das MMS, (B) microestruturas de superfície adesiva de MMS paredes laterais, barra de escala:. 50 mm, (CF) desenho esquemático: (C) implantation do MMS na lesão da medula espinhal, (D) aplicação de vácuo para sugar o tecido na estrutura de favo de mel (seta vermelha: pressão negativa), (E) força adesiva mantém os tocos na medula espinhal em estreita proximidade a uma distância de apenas vários micrômetros, (F) a distribuição de substâncias farmacológicas no lúmen através de 4 micro-canais internos (setas pretas apontar em micro-canais 1 - 4). A infusão é representado pela seta azul na abertura de entrada. Em D - E apenas uma metade da mensagem MMS é mostrado. Reproduzido de Brazda et al, 2013 7 com permissão de Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig2.jpg" /> Figura 2. Preservação de Tecido Spinal após MMS Implantation. tecido da medula espinhal em 6, resp. 7 meses após a transecção com total de (A) e sem implante MMS (B). A seta em (B) indica a região da espinal medula que corresponde ao sítio de implantação da mensagem MMS (seta) em (A). Note-se a contracção do tecido da medula espinal em que o animal não tratado (B), em contraste com a estrutura bem preservada em (A). Tricromo de secções da espinal medula sagital após o implante de MMS (C) em comparação com os animais de controlo sem implante (D). Verde: tecido conjuntivo, vermelho: cytoplasma, preto: nucleus.The centro lesão é preenchido com tecido cicatricial (verde) em animais lesionados de controle (D, seta preta retrata epicentro da lesão), enquanto que apenas cicatrizes marginal é evidente em torno das MMS no tratado animais após 14 dias (C). Note-se que a mensagem MMS é composta de estruturas em favoque são lavadas durante o processamento de tecidos se cortar em 20 mm fatias. A barra de escala para (A, B) em (A), por (C, D) em (D): de 1 mm. Modificado de Brazda et al, 2013 7 com permissão de Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig3.jpg" /> Figura 3. axonal Regeneração, revascularização e campo aberto Locomotor Score &#39;ao MMS Implantação. (A) coloração imuno de neurofilamento fosforilado com o marcador pan-axonal (PAM) em uma seção da medula espinhal sagital em 5 semanas após completa transecção da medula espinhal e implantação de MMS. O lúmen de MMS é indicado por um asterisco. As paredes (W) do MMS são marcados por tracejadaslinhas. Observe os inúmeros axônios manchado na MMS lúmen previamente tecido-desprovida. Barra de escala: 100? m. (B) coloração imuno dos vasos sanguíneos no lúmen MMS (identificado com o fator de von Willebrand [vWF] coloração, verde). (C) Avaliação da pontuação locomotor BBB para MMS implantadas (linha preta, N = 9) versus animais de controlo feridos (linha cinza, N = 6). O BBB média de membro posterior esquerdo e direito (média por grupo) é representado com desvio padrão. Diferenças estatisticamente significativas são marcados por asteriscos (Mann-Whitney Rank Sum teste, p &lt;0,05). Modificado de Brazda et al, 2013 7 com permissão de Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig4.jpg" /> Figura 4.PEG Matrix promove a regeneração de tecidos e Beneficial Cellular Invasion seguinte Scar ressecção e tratamento. (A) coloração negro de Sudão mostra que grande parte da diferença ressecado (desprovida de coloração negro de Sudão) são preenchidos com tecido em 1 semana após a ressecção. (B, C) ​​Coloração da cicatriz da lesão fibrosa com colágeno tipo IV em 1 semana após a ressecção. Uma cicatriz densa está presente em animais de controle enquanto os animais tratados com PEG revelar uma imunocoloração muito mais fraco e mais distinta. (D) Área da angiogênese (WWF) contém perfis de axônios regenerados (identificados com neurofilamento [NF]) em uma semana após a ressecção. (E) Numerosos axónios foram cultivadas na área tratada em 5 semanas após ressecção. (F, G) Tanto proteína glial fibrilar ácida positiva (GFAP +) astrócitos e S100 + Schwann células invadem a matriz PEG eo último são encontrados em estreita associação com a regeneraing axônios já depois de 1 semana de tratamento post. Barras de escala: (a) a 1mm; (CF) 100 uM, (G) de 50 | im. (BG):.. Adaptado de Estrada et al, 2014 8 com permissão de Elsevier <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig5.jpg" /> Figura 5. Melhoria da Locomotor Função após crônica Spinal Cord Injury, Scar ressecção e PEG-tratamento. Avaliação do BBB (mBBB) pontuação locomotor modificados para-tratados PEG (PEG, losangos pretos, N = 13-14 por ponto de tempo) versus controle animais, que receberam uma secção total da medula espinhal, sem ressecção da cicatriz (TX, triângulos brancos, N = 13-14 por ponto de tempo) após a lesão medular crônica. pontuações mBBB média+ Erro padrão da média unilateral Mann-Whitney U, * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001; Modificado de Estrada et al., 2014 8 com permissão de Elsevier, lesão inicial WPL = Semana post, wpr = semanas após a ressecção. Barra de erro = SEM (erro padrão da média). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Estratégias experimentais para Ponte grandes lacunas de tecido na medula espinhal ferido após aguda e lesão crônica

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

experimental-strategies-to-bridge-large-tissue-gaps-injured-spinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K visualizações.  Heinrich-Heine-University Medical Center. Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Vídeo: Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

A seqüência de difusão na Medula Espinhal Rat Cervical

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Treinamento baseado em atividade em uma esteira com medula espinhal ferido de ratos Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...