German Legal Casualty Insurance (DGUV), Research Commission of the Medical Faculty of the Heinrich-Heine-University

Institutionelle Richtlinien für die Tier Sicherheit und Komfort wurden eingehalten und alle chirurgischen Eingriffe und prä- und postoperative Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz (Landesamt, Umwelt- und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-Westfalen, LANUV NRW zur Verfügung gestellt ). 1. Vollständige Durchtrennung des thorakalen Rückenmarkes von weiblichen Wistar-Ratten (220-250 g) <ol><li> Vorbereitung des Rückenmarks <ol><li> Verwenden Isofluran Inhalationsanästhesie (2 - 3% Isofluran in O 2 / NO 2 in einem Verhältnis von 1: 2) und Bolusinjektion von Carprofen (subkutan [sc] 5 mg / kg). Die Kombination von Carprofen und dem Opioid Buprenorphin (0,02 mg / kg sc) empfohlen. Beginnen Chirurgie wenn Augenlid Reflex auf leichte Berührung mit einem Wattestäbchen und Pfotenrückzugsreflex mit einer Pinzette zu kneifen Reiz nicht mehr beobachtet. </li><li> Legen Sie das Tier auf einer Heizdecke bei 37 ° C bis Körper temperatu haltenre während der Operation und stellen Augensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Shave dem Rücken des Tieres und bereiten die Haut mit einem Hautdesinfektionsmittel. </li><li> Schneiden Sie die Haut an der Mittellinie entlang der Brustwirbel für 4 cm mit einem Skalpell und öffnen. Von diesem Schritt auf, verwenden Sie chirurgische Instrumente für alle Verfahren sterilisiert (autoklaviert oder Tauchsterilisiert). </li><li> Fahren Sie die Muskeln über der Brustwirbel mit einem kleinen Muskeln verspannen. </li><li> Entfernen Sie die Dornfortsätze bei thorakalen 8 (Th8) und Th9 mit einem Knochen Rongeur durch vorsichtige kleine Stücke von Knochen Clipping bis die Wirbelknochen flach sind. </li><li> Verwenden anatomischen Pinzette die Wirbelsäule bei Dornfortsatz Th7 zu heben und eine rongeur verwenden, um kleine Stücke von Wirbelknochen von kaudal rostral Clip, bis eine Laminektomie bei Th8 und Th9 durchgeführt wird. Belichten der Dura mater, ohne es zu beschädigen, indem sorgfältig zu einer Zeit nur wenige und sehr kleine Stücke von Wirbelknochen zu entfernen.</li><li> Spannen Sie das Rückgrat von zwei Stabilisierungsklammern an Dornfortsätze Th7 und Th10, heben Sie das Tier zu Atembewegungen aus den Wirbeln entkoppeln. </li></ol></li><li> Füllen Sie Spinal Cord Trennung bei thorakalen 8/9 <ol><li> Heben Sie die Dura mater mit einer feinen Pinzette, schneiden Sie die Dura mater mit feinen Auge Schere in Querrichtung. </li><li> Halten Sie die seitliche Schnittende der Dura mater mit einer feinen Pinzette und legen Sie eine Wirbelsäulenhaken in die subarachnoidic Raum zwischen Dura mater und Arachnoidea. Vermeiden Sie Beschädigungen der Meningen durch nicht Einstechen in die pia oder Dura mater entweder mit einer Pinzette oder Rückenmark Haken. </li><li> Langsam drehen Sie den Haken alles entlang des Rückenmarks Gewebe zu platzieren, dabei nicht in die Dura zu stechen (pia noch intakt ist). </li><li> Heben Sie das Rückenmark für etwa 1 bis 2 mm nach oben, bis eine Lücke an der Bauchseite zwischen Rückenmarksgewebe und Dura zu sehen ist. </li><li> Legen Sie feine Augen Schere in den Raum between dura und pia und schneiden Sie das Rückenmark, während die Rücken Haken an Ort und Stelle bleibt. </li><li> Heben Sie die beiden Stümpfe des Rückenmarks mit zwei Zangen und optisch komplett transection gewährleisten. </li><li> Zur Kontrolle-lädierten Tieren und Tieren, die mit einer chronischen Verletzung, schließen Sie die Dura durch unterbrochene Nähte mit Monofilament nicht adsorbierbaren 9,0 Gewinde. </li><li> Bei chronischen Läsionen folgen Teil 1.6. </li></ol></li><li> mMS Implantierung <ol><li> Platzieren mMS über der Verletzungsstelle mit den beiden Rohren an jeder lateralen Seite des Wirbels liegen und in Läsion Hohlraum abzusenken. </li><li> Nahtrohre an die Muskeln an der Seite des Wirbels mit nicht resorbierbaren Faden 4-0 Stabilisierung der mMS sicherzustellen. Achten Sie auf eine Fixierung der mMS mit einer Pinzette in diesem Schritt. </li><li> Entfernen Sie den mMS Steckerstift, indem sie mit einem Paar von einer feinen Schere zu schneiden. </li><li> Schließen Sie die Dura über den MMS- und vernähen es mit 9,0 Gewinde. </li><li> Schließen Sie ein Rohr mit der Vakuumpumpe und Dichtungdie andere durch Klemmung. </li><li> Sie vorsichtig auf Unterdruck auf die mMS durch eine Vakuumpumpe über das offene Rohr, das Rückenmark Stümpfe in die mMS Lumen zu saugen. Übernehmen des Unterdrucks für mehrere Minuten (bei maximal 10 min) und Überwachung von Sensoren (250-350 mbar). </li><li> Schneiden Sie die Rohre nahe den MMS- und die Schläuche entfernen. Fahren Sie mit Schritt 1.6. </li></ol></li><li> Die Resektion von Rückenmarksgewebe einschließlich der chronischen Lesion Scar in Woche 5 nach Erstverletzung <ol><li> Führen Sie die Schritte 1.1.1 - 1.1.5. </li><li> Identifizieren von Narbengewebe durch braungelbes Aussehen und steife Gewebe auf der Oberseite des Rückenmarks. Entfernen Sie vorsichtig oberflächlichen Schichten von Narbengewebe, indem sie mit einer feinen Pinzette halten und Schneiden mit einer feinen Schere. Mit dieser Methode wieder zu öffnen, die Seite von Laminektomie um das Gewebe zu entlarven die Verletzung des Rückenmarks Bereich enthält. Stoppen Vorbereitung, wenn die Dura Naht visuell identifiziert wird. </li><li> Spannen Sie das Rückgrat von 2 Stabilisierung klemmt bei Spinous Prozesse Th7 und Th10, und dann das Tier erheben zu Atembewegungen aus den Wirbeln entkoppeln. </li><li> Mit einem kleinen Pappe Lineal messen den Bereich des Rückenmarks, die reseziert werden soll (Länge: 4 mm), und die Ränder dieser jeweiligen Gewebebereich markieren mit Quereinschnitte die anschließende Entfernung des Gewebes zu ermöglichen. </li><li> Entfernen von Narbengewebe durch eine Kombination von Schneiden und Aspiration. Nehmen Sie das Gewebe aus, die aus dem Rückenmark mit den Quer Einschnitte getrennt wurde. Schon Aspiration, wenn es ausreichend ist, um die Entfernung des Gewebes zu ermöglichen. Darüber hinaus macht, wenn die steife Textur des Narbengewebes Gewebe Aspiration zu schwierig, verwenden feinen Schere dieses Gewebe zu schneiden und zu entfernen. </li><li> Legen Sie ein Stück (ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm Würfel) hämostatischer Gelatine Schwamm in den Gewebespalt bis die Blutung nachlässt. Die Gelatineschwamm wird in der Größe schrumpfen, sobald er mit Flüssigkeit getränkt ist. </li></ol></li><li> Implantation von PEG 600 <ol><li> Vorbereitung 1 ml reinem unverdünntem PEG 600 zur Injektion durch Erhitzen auf 37 ° C. </li><li> Entfernen Gelatineschwamm. </li><li> Legen Sie eine ausreichende Menge (ca. 5 bis 7 &amp; mgr; l) von PEG in den Spalt eine 10 &amp; mgr; l-Spritze oder eine 10 ul-Pipette. </li><li> Sorgfältig decken den Bereich mit einem Stück (ca. 5 mm x 4 mm) von Dicht- / Dura-Ersatz. </li><li> Befestigen Sie das Dichtungsmittel Muskelgewebe mit einigen Tropfen Gewebekleber auf die Umgebung. Legen Sie das Dichtmittel auf der Oberseite des PEG-gefüllten Resektion Lücke. Um zu verhindern ein Verrutschen des Dichtmittels, verwenden kleine Tropfen Gewebekleber auf die Ecken des Dichtungsmittels auf das umgebende Muskelgewebe fixieren. Hinweis: Vermeiden Sie ein Auslaufen des Gewebekleber auf die Rückenmarksgewebe! </li></ol></li><li> Abschluss des Tissue und Nachsorge <ol><li> Suture Muskeln und Hautschicht für Schicht mit unterbrochenen Nähten mit geflochtenen adsorbierbare 4-0 Fäden </li><li> Injizieren 2 × 2,5 ml Natriumchlorid (NaCl[0,9%]) bei 36 ° C für sc Rehydratation nach der Operation. Eine einzige Injektion von 5 ml NaCl würde die Haut des Tieres dehnen und unnötigen Schaden für das Tier verursachen könnten. Lassen Sie keine Tier unbeaufsichtigt bis zur vollständigen Bewusstsein wiedererlangt wird. </li><li> Injizieren täglich Carprofen (sc 5 mg / kg) für mindestens 2 Tage nach der Operation. Haustier in einzelnen Käfig während der ersten 2 Tage, danach in Gruppen von 2 - 3. </li><li> Bewerben Antibiotika-Behandlung (tägliche orale Verabreichung von Enrofloxacin) für den ersten postoperativen Woche. </li><li> Haben manuelle Blase bei zwei bis drei Mal pro Tag für ungültig erklären, indem Sie vorsichtig den Bauch des Tieres, von rostral streicht über nach kaudal. Achten Sie darauf, nicht die Wirbelsäule des Tieres zu bewegen und nicht heben das Tier am Schwanz. Manuelles Erlöschen der vollständig täglich während der gesamten Lebenszeit Blase Tieres spinalisierten. Es muss Futterpellets und Wasserflaschen in einer Höhe zu platzieren getroffen werden, die von den Tieren erreicht werden kann, ohnestehend auf ihren Hinterpfoten. Obwohl in Hinterviertel Funktion beeinträchtigt wird, die Tiere die Käfige aktiv unmittelbar nach der Operation zu bewegen und zu erkunden. Es wird empfohlen, die Ratten in geselligen Gruppen zu halten. </li><li> Bei chronischen Läsionen lassen eine Überlebenszeit der Tiere von fünf Wochen vor Narbe Resektion. Führen Sie die Schritte 1.4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramer, L. M., Ramer, M. S., Bradbury, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+after+spinal+cord+injury:+towards+clinical+translation+of+experimental+strategies.">Restoring function after spinal cord injury: towards clinical translation of experimental strategies.</a> The Lancet. Neurology. 13 (12), 1241-1256 (2014).</li><li>McDonald, J. W., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+the+damaged+spinal+cord:+a+summary+of+our+early+success+with+embryonic+stem+cell+transplantation+and+remyelination.">Repairing the damaged spinal cord: a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination.</a> Prog. Brain Res. 137, 299-309 (2002).</li><li>Yoon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+injury+treatment+using+autologous+bone+marrow+cell+transplantation+and+bone+marrow+stimulation+with+granulocyte+macrophage-colony+stimulating+factor:+Phase+I/II+clinical+trial.">Complete spinal cord injury treatment using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophage-colony stimulating factor: Phase I/II clinical trial.</a> Stem Cells. 25 (8), 2066-2073 (2007).</li><li>Brotchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spinal+cord+tumor+resection.">Intrinsic spinal cord tumor resection.</a> Neurosurgery. 50 (5), 1059-1063 (2002).</li><li>Estrada, V., Tekinay, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+ECM+mimetics.">Neural ECM mimetics.</a> Prog. Brain Res. 214, 391-413 (2014).</li><li>Tetzlaff, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Cellular+Transplantation+Therapies+for+Spinal+Cord+Injury.">A Systematic Review of Cellular Transplantation Therapies for Spinal Cord Injury.</a> J.Neurotrauma. 28 (8), 1611-1682 (2010).</li><li>Brazda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+microconnector+system+for+restoration+of+tissue+continuity+and+long-term+drug+application+into+the+injured+spinal+cord.">A mechanical microconnector system for restoration of tissue continuity and long-term drug application into the injured spinal cord.</a> Biomaterials. 34 (38), 10056-10064 (2013).</li><li>Estrada, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+significant+functional+improvement+in+chronic+severe+spinal+cord+injury+following+scar+resection+and+polyethylene+glycol+implantation.">Long-lasting significant functional improvement in chronic severe spinal cord injury following scar resection and polyethylene glycol implantation.</a> Neurobiol. Dis. 67, 165-179 (2014).</li><li>Rasouli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+glial+scar+following+spinal+cord+injury.">Resection of glial scar following spinal cord injury.</a> J.Orthop.Res. 27 (7), 931-936 (2009).</li><li>Schira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+clinical,+neuropathological+and+behavioural+recovery+from+acute+spinal+cord+trauma+by+transplantation+of+a+well-defined+somatic+stem+cell+from+human+umbilical+cord+blood.">Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood.</a> Brain. 135, 431-446 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier werden zwei verschiedene chirurgische Ansätze werden vorgestellt, um Gewebe Lücken im Rückenmark nach (1) akute vollständige Durchtrennung und mMS Implantation und (2) chronischen Rückenmark Läsion und faserige Entfernung von Narben und PEG-Matrix Implantation überbrücken. Beide Strategien führen zu Gewebeerhaltung und axonalen Regeneration sowie zu erheblichen Bewegungs funktionelle Verbesserung der behandelten Tiere. Für mMS von der Firma dura Naht nach der Operation eine ausreichende Fixierung der mMS innerhalb des Rückenmarks Implantation ist ein kritischer Schritt technischen. Der MMS hält weitere therapeutisches Potential aufgrund seiner implementiert internen Mikrokanalsystem , welches über das lokale Infusion von therapeutisch aktiven Flüssigkeiten in die Läsion Kern ermöglicht, z. B. ein angeschlossenes osmotische Minipumpe 7. Für den vorgesehenen künftigen klinischen Gebrauch sollte die mMS Material bioresorbierbaren sein. Derzeit ist die Herstellung von Verbindungssysteme von Lactid basierenden Materialien zusammengesetztgetestet werden. Darüber hinaus Beschichtung der mMS mit einem elektronischen Leitermaterial wird festgelegt, um therapeutische elektrische Felder an den lädierten Rückenmark anzuwenden. Wie bei chronischen Rückenmarksverletzungen, wurde eine andere Strategie verfolgt, da körperliche Anspannung der nach der Entfernung Operationsnarbe Rückenmark Stümpfe getrennt erschien zu hoch, wenn ein Abstand von mehreren Millimetern überquert werden müssen. Überraschenderweise erwies sich das niedermolekulare PEG 600 ein sehr geeignetes Biopolymer sein, um die entstandene Lücke zu füllen. Es ermöglicht die Bildung einer stabilen Gewebebrücke, die die Angiogenese und Zellinvasion von nützlichen Zelltypen fördert. Es wird angenommen, dass die physikalischen Eigenschaften von PEG600, wie seine Viskosität, eine wichtige Rolle für die beobachtete Wirksamkeit spielen, da andere PEG-Typen mit höheren oder niedrigeren Molekulargewichten und / oder Viskositäten nicht so vorteilhaft waren. Überbrückung der kleineren Lücke nach akutem transection mit dem neuen SteckerSystem führen zu einer deutlichen Funktionsverbesserung bereits 4 Wochen nach der Verletzung. Die jeweiligen Tiere erreichten einen BBB-Score von etwa 7 bis zu diesem Zeitpunkt und deutliche Unterschiede zwischen mms-Tieren und Kontrollratten waren offensichtlich. Chronisch Tiere verletzt, die auch als die unbehandelten Kontrollen signifikant besser rückgewonnen eine Narbe Resektion und PEG-Implantation erhalten, aber die Verbesserungen meist zu späteren Zeitpunkten bemerkenswert waren (nach ca. 16 Wochen). Solche Beobachtungen von der Art der Verletzung erklären könnte (dh., Akute gegen chronische und 1 mm gegenüber 4 - mm - Gewebedefekt). Im Falle der größeren Läsionen erfordert die regenerative Wachstum von Axonen durch die Läsionsstelle längere Zeiträume. Auch ist es sehr wahrscheinlich, daß die längeren Zeiträumen der Nichtbenutzung der Hintergliedmaßen in höheren Graden der degenerative Ereignisse führen und daher in weniger prominent funktionellen Verbesserungen. Zukünftige Optimierung der PEG-Behandlung nach chronischer spinal Marksverletzung, über kombinatorische Ansätze, z. B. zusätzliche Aussaat des PEG mit Förderung des Wachstums (Stamm-) Zellen wie Nabelschnurblutzellen 10 in vivo, werden derzeit getestet.

Eine traumatische Verletzung des Rückenmarks nicht nur führt zum Verlust von Axonen , aber es weitere Ergebnisse bei Gewebedefekten , die keine regenerative Reaktionen behindern (zur Übersicht siehe 1,2). Rückenmarksgewebe wird häufig durch sekundäre Degeneration verloren Zystenbildung oder Löchern in und um den Schädigungsbereich führt. Die meisten experimentellen therapeutischen Interventionen konzentrieren sich auf unvollständige Rückenmarksschäden wie teilweise Durchtrennung, zerdrücken oder Prellung Verletzungen mit einer Rest Rand von gesundem Gewebe. Für eine vollständige Verletzungen wie Gesamtquerschnitten erhalten von traumatischen Unfällen oder chirurgischen Eingriffen führt, wie Tumorresektionen, nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen heute 3,4. Nach der vollständigen Durchtrennung, so dass Mechaniker Spannung der Gewebe führt Wirbelsäulenstumpf Retraktion, einen kleinen Spalt im Rückenmark. Die meisten Strategien konzentrieren , diese Lücke mit Gewebe, Zellen oder Matrizen auf Füllung 5,6. Hier wird eine andere Strategieist, und zwar erneut Anpassung der getrennten Stümpfe präsentiert 7 ein neuartiges microconnector Gerät. Hat , um die beiden Stümpfe, mechanische Kraft auf neu anpassen als leichter Unterdruck angelegt werden , um diese (Figur 1) zu erreichen. Die mechanische microconnector System (MMS) ist ein Mehrkanalsystem aus Polymethylmethacrylat (PMMA) mit wabenförmigen Löchern (1A) und mit einem Auslass Rohrsystem vorgesehen. Es wird in den Gewebespalt von kompletten Rückenmarksdurchtrennung in der Ratte (Figur 1C) resultierenden implantiert. Ein Rohr mit einer Vakuumpumpe verbunden sein , um Unterdruck an den MMS (1D) anzuwenden. Der Druck zieht abgeklemmten Rückenmark Stümpfe in die wabenförmigen Löcher der mMS, die mikrostrukturierten Wände haben , das Gewebe in Position zu halten , wenn der Druck freigegeben wird (1B). Der Schlauch kann nach der Operation und an eine osmotische Minipumpe intakt gelassen werden, umSubstanzen in die Läsion Kern (1E-F) zu infundieren. Neben einer akuten Durchtrennung des Rückenmarks eine andere Art von vollständigen Läsion ergibt sich aus der chirurgischen Entfernung eines Tumors oder spinal einer festen chronische Läsion Narbe zu große Gewebelücken von mehreren Millimetern führen, die nicht durch den MMS so weit überwunden werden. Die Mehrzahl der Patienten mit Rückenmarkstrauma leiden an chronischen Verletzungen. Bei diesen Patienten nimmt eine voll entwickelte Narbe der Läsion Kern. Die chirurgische Entfernung der Läsion Narbe ist ein Konzept für eine Behandlung , die gegenwärtig nach experimenteller SCI 8,9 untersucht. Während die Resektion Verfahren selbst, ohne daß erhebliche zusätzliche Beschädigung durchgeführt werden kann, muss der sich ergebende Gewebespalt mit einer geeigneten Matrix überbrückt werden, die die Regeneration der Gewebe ermöglicht und fördert, und im speziellen Fall von Verletzungen des Rückenmarks, die Regeneration von Nervenfasern zu halten und Bewegungsfunktionen fördern. es wargefunden, daß niedermolekulares Polyethylenglykol (PEG 600) ein sehr geeignetes Material für diesen Zweck ist. Sein Mangel an Immunogenität und der sehr niedrige Viskosität ermöglicht eine reibungslose Integration in das umliegende Gewebe. Insertion des Biopolymers alleine fördert die Invasion von nützlichen Zellen, einschließlich Endothelzellen, peripherer Schwann - Zellen und Astrocyten, und - was sehr wichtig ist - die Regeneration und Dehnung von Axonen der absteigenden und Faserbahnen aufsteigend sowie deren ensheathment von kompakten Myelin 8. Diese regenerative Antworten gefunden wurden durch langfristige Funktionsverbesserungen begleitet werden. Die Kombination der Resektion von Narbengewebe und anschließender Implantation von PEG 600 stellt eine sichere und einfache, aber sehr effizientes Mittel zur Überbrückung erhebliche Gewebedefekten Rückenmark.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG 600 Ph Eur&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck/VWR&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8,170,041,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelastypt gelatine sponge&#160;&#160;</td>
			<td>sanofi Aventis</td>
			<td>PZN-8789582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nescofilm Sealant&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2569.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rimadyl (Carpofen)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forene (Isoflurane)</td>
			<td>Abbvie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodan (skin disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoacryl (tissue glue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16020-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-in-one Micro Spatula - 12 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #7 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spinal cord hook&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10162-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp&#160;</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>EA016R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon Vicryl 4-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-retaining retractor&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skin clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluspray&#160;</td>
			<td>Selectavet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental strategies to bridge large tissue gaps in the injured spinal cord after acute and chronic lesion

Nach einer Verletzung des Rückenmarks (SCI) eine Narbe bildet sich in der Läsion Kern, der axonalen Regeneration behindert. Überbrückung der Stelle der Verletzung nach einer Beleidigung des Rückenmarks, Tumorresektionen oder von traumatischen Unfällen Gewebedefekte können bei der Erleichterung der allgemeinen Gewebereparatur sowie regenerative Wachstum von Nervenfasern in und über den betroffenen Bereich unterstützen. Zwei experimentelle Therapiestrategien werden vorgestellt: (1) Implantation eines neuartigen microconnector Gerät in einen akut und vollständig durchtrennt Brust-Ratte Rückenmark Rückenmarksgewebe Stümpfe trennt neu anpassen, und (2) Polyethylenglykol Füllung des SCI-Website in chronisch lädierten Ratten nach Narbe Resektion. Die chronische Rückenmark Läsion in diesem Modell ist eine komplette Rückenmark durchtrennt, die 5 Wochen vor der Behandlung zugefügt wurde. Beide Methoden haben in letzter Zeit sehr viel versprechende Ergebnisse und gefördert axonalen Nachwachsen, vorteilhaft Zellinvasion und funktionelle Verbesserungen erreichtin Nagetiermodellen von Rückenmarksverletzungen. Die mechanische microconnector System (MMS) ist ein Mehrkanalsystem aus Polymethylmethacrylat (PMMA) besteht mit einem Auslass Schlauchsystem Unterdruck auf die mMS anzuwenden Lumen somit das Rückenmark Stümpfe in die Wabenstrukturierten Löcher ziehen. Nach der Implantation in den 1 mm Gewebespalt wird das Gewebe in die Vorrichtung gesaugt. Weiterhin sind die Innenwände der mMS zur besseren Gewebeadhäsion mikrostrukturiert. Im Falle der chronischen Ansatz Rückenmarksverletzungen, Rückenmarksgewebe - Bereich einschließlich der Narbe gefüllte Läsion - ist auf einer Fläche von 4 mm in der Länge reseziert. Nach der mikrochirurgisches scar Resektion wird der resultierende Hohlraum mit Polyethylenglykol (PEG 600) gefüllt ist, das eine ausgezeichnete Substrat bereitzustellen , um Zellinvasion, Revaskularisation, die Regeneration von Axons und sogar kompakter Remyelinisierung in vivo gefunden wurde.

Gewebekonservierung, Axonal Nachwachsen und funktionellen Zugewinn von mMS Einpflanzung nach akutem vollständiger Durchtrennung des Rückenmarks Es wird gezeigt , dass die akute Implantation der mMS die vollständig durchtrennt Rückenmark Stümpfe stabilisiert und verringerte Schrumpfung des Gewebes (2A im Vergleich zu B). Wie in Sagittalschnitten durch Trichrom - Färbung sichtbar gemacht , ist die grüne Bindegewebe Anfärbung der fibrotische Narbe in der Läsion Kern viel dichter und prominent in steuerungs läsionierten Tieren (2D) als in mMS implantierten Tieren (2C). Interessanterweise gibt es bei langen Überlebenszeiten in Makrophagenakkumulation in der Läsionsstelle als visualisiert durch immunhistologische Färbung gegen ED-1 in mMS implantiert versus Kontrolle läsionierten Tieren (nicht gezeigt) keine beobachteten Unterschiede waren. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; unmittelbar nach der Implantation, Mangel an Gewebe in den mMS Lumens beobachtet, die anschließend mit Zellen und Gewebe nach mehreren Tagen gefüllt war. Bei 5 Wochen nach der Operation massiven axonalen Einwachsen in die mMS Lumen nachgewiesen werden konnte (3A). Darüber hinaus wurde die mMS Lumen vaskularisiert (3B) und axonalen Strukturen wurden in der Nähe von Blutgefäßen (nicht dargestellt) gefunden. Bewertung des offenen Feld Basso-Beattie-Bresnahan Bewegungs Score (BBB), zeigten eine signifikante funktionelle Verbesserung von mMS implantierten Tiere (schwarze Linie in 3C) im Vergleich zur Kontroll-lädierten Tiere (graue Linie in 3C) bei 2 und 4 Wochen Nach der Operation. Zellinvasion, Revaskularisation, die Regeneration von Axons und funktionelle Verbesserung bei chronischen Rückenmark - Verletzung Ratten nach Scar Resektion und PEG Implantierung Bei der chronischen Verletzung Modusls der beiden Teil- und Komplettthorax transection Rückenmark die chirurgische Entfernung der Narbe Läsion in Woche fünf nach der ersten Verletzungen der Tiere kein nachweisbares zusätzlichen Schaden oder Unannehmlichkeiten verursachen. Scar Resektion und anschließende Insertion von PEG 600 führte zur Regeneration von Gewebe , das innerhalb der Matrix (Figur 4) nachweisbar war. Zusätzlich Ablagerung von extrazellulären Kollagenhüllen - die für die Basalmembran meshwork von Narbengewebe typisch ist - wurde nicht als prominent nach PEG-Behandlung (4C) im Vergleich zur Läsion-only Kontrollen (4B). Im Gegensatz zu der chronischen Narbe der Läsion-only Kontrollen (nicht gezeigt), die Matrix gefüllten Resektion Stelle wurde durch axon wachstumsfördernden Zellen nach der Resektion eindrangen. Schon so früh wie eine Woche nach Resektion und Behandlung mehrere positive Zelltypen in der Matrix Bereich wie Endothelzellen identifiziert werden konnten (die bei der Regeneration von Blut v anwesend sein gefundenessels [4D]), Astrozyten (4F) und periphere Schwann - Zellen (4G). Fünf Wochen nach der Resektion der PEG-behandelten Bereich ist mit zahlreichen axonalen Profilen (4E) gefüllt ist . Die PEG - Matrix förderte die wesentliche regenerative Wachstum zahlreicher Axone (4D, E, G). Mit Tracing Studien und immunhistochemischen Färbung, verschiedene auf- und absteigenden axonalen Populationen konnten identifiziert werden , die 8 nicht nur in , sondern auch über den PEG-gefüllten Bereich regeneriert. Übertragungs EM - Analysen der behandelten Fläche von Tieren mit einer langen Überlebenszeit (8 Monate) bestätigt nicht nur die Anwesenheit von Schwann - Zellen , aber weiter offenbart kompakte Myelinisierung der regenerierten Axonen innerhalb der PEG-Matrix 8. Regenerierte axon Profile wurden häufig mit Bereichen der Angiogenese(4D). Immunhistochemie gezeigt , dass die Axon - Profile , die in der behandelten Resektionsfläche gefunden wurden eng mit Schwann - Zellen verbunden waren und schien bereits nach der Resektion und Implantation 8 zu frühen Zeitpunkten durch diese Zellen myelinisierte werden. Eine langfristige (8 Monate) Verhaltensstudie geht hervor , dass lang anhaltende Bewegungs funktionelle Verbesserungen nach chronischer Narbe Resektion und PEG-Behandlung (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig1.jpg" /> Abbildung 1. mMS Aufbau und Funktionsprinzip (A) photographisches Bild der mMS, (B) Klebefläche Mikrostrukturen von mMS Seitenwände, Maßstab:. 50 &amp; mgr; m (CF) Schemazeichnung: (C) implantation der mMS in das Rückenmark Läsion, (D) Anwendung von Vakuum , um das Gewebe in die Wabenstruktur (roter Pfeil: Unterdruck) zu saugen, (E) Haftkraft hält das Rückenmark Stümpfe in der Nähe in einer Entfernung von nur mehrere Mikrometer, (F) Verteilung von pharmakologischen Substanzen in das Lumen über 4 interne Mikrokanäle (schwarze Pfeile zeigen auf Mikrokanäle 1 - 4). Die Infusion wird durch blaue Pfeil an der Einlassöffnung dargestellt. In D - E nur eine Hälfte der mMS gezeigt. Abgedruckt von Brazda et al, 2013 7 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig2.jpg" /> Abbildung 2. Spinal Gewebeerhaltung nach mMS Implantation. Rückenmarksgewebe bei 6, resp. 7 Monate nach Gesamtdurchtrennung mit (A) und ohne mMS Implantat (B). Der Pfeil in (B) zeigt das Rückenmark Region zu der Implantationsstelle der mMS (Pfeil) in (A) entspricht. Beachten Sie die Schrumpfung des Rückenmarksgewebe in dem unbehandelten Tier (B) im Gegensatz zu dem gut erhaltene Struktur in (A). Trichromfärbung von sagittalen Rückenmarkschnitte nach mMS Implantation (C) im Vergleich zu Kontrolltieren ohne Implantat (D). Grün: Bindegewebe, rot: Zytoplasma, schwarz: nucleus.The Läsionszentrum mit Narbengewebe (grün) in Steuer lädierten Tiere (D, schwarzer Pfeil zeigt Läsion Epizentrum) gefüllt, während nur marginal Narben rund um die mMS evident ist in den behandelten Tiere nach 14 Tagen (C). Beachten Sie, dass die MMS besteht aus Wabenstrukturendie während der Gewebeverarbeitung ausgewaschen, wenn in 20 &amp; mgr; m Scheiben schneiden. Maßstabsbalken für (A, B) in (A), für (C, D) in (D): 1 mm. Geändert von Brazda et al, 2013 7 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig3.jpg" /> Abbildung 3. Axonregeneration, Revaskularisation und Open Field Locomotor Score nach mMS Implantierung. (A) Immunhistologische Färbung von phosphoryliert Neurofilament mit pan-axonalen Marker (PAM) in einer sagittalen Rückenmark Schnitt bei 5 Wochen nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung und mMS Implantation. Der MMS-Lumen ist mit einem Stern gekennzeichnet. Die Wände (W) der mMS sind durch gestrichelte gekennzeichnetLinien. Beachten Sie die zahlreichen gefärbten Axone in den zuvor gewebe ohne mMS Lumen. Maßstabsbalken: 100 &amp; mgr; m. (B) Immunhistologische Färbung von Blutgefäßen in den mMS Lumen (identifiziert mit von Willebrand - Faktor [vWF] Färbung, grün). (C) Bewertung der BBB Bewegungs Punktzahl mMS implantiert (schwarze Linie, N = 9) im Vergleich zur Kontroll verletzte Tiere (graue Linie, N = 6). Die mittlere BBB von linken und rechten hinteren Gliedmaßen (Durchschnitt pro Gruppe) mit Standardabweichung dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede durch Sternchen markiert (Mann-Whitney-Rangsummentest, p &lt;0,05). Geändert von Brazda et al, 2013 7 mit Genehmigung von Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig4.jpg" /> Figur 4.PEG - Matrix fördert die Geweberegeneration und nutzbringende Zellinvasion folgende Scar Resektion und Behandlung. (A) Sudan Schwarz - Färbung zeigt , dass große Teile des resezierten Lücke (ohne Sudan Schwarz - Färbung) mit dem Gewebe in 1 Woche nach der Resektion gefüllt sind. (B, C) ​​Färbung der faserigen Läsion Narbe mit Kollagen Typ IV in 1 Woche nach der Resektion. Eine dichte Narbe ist in den Kontrolltieren, während PEG-behandelten Tieren eine viel schwächere und deutlicher Immunfärbung zeigen. (D) Gebiet der Angiogenese (wwf) enthält Profile von regenerierten Axone (identifiziert mit Neurofilament [NF]) auf eine Woche nach Resektion. (E) Zahlreiche Axone haben bei 5 Wochen nach der Resektion in den behandelten Bereich gewachsen. (F, G) Sowohl positive sauren Gliafaserproteins (GFAP +) Astrozyten und S100 + Schwann - Zellen dringen in die PEG - Matrix und diese werden in enger Zusammenarbeit mit dem Regenerat gefundening Axone bereits nach 1 Woche nach der Behandlung. Maßstabsbalken: (A) 1 mm; (CF) 100 &amp; mgr; m, (G) 50 &amp; mgr; m. (BG):.. Angepasst von Estrada et al, 2014 8 mit Genehmigung von Elsevier <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig5.jpg" /> Abbildung 5. Verbesserung der Locomotor Funktion nach chronischer Rückenmarksverletzung, Narbe Resektion und PEG-Behandlung. Die Bewertung der modifizierten BBB (mBBB) Bewegungs - Score für PEG-behandelten (PEG, schwarze Rauten, N = 13-14 pro Zeitpunkt) im Vergleich zur Kontroll Tiere, die insgesamt Rückenmark durchtrennt, ohne Narbe Resektion (TX, weiße Dreiecke, N = 13-14 pro Zeitpunkt) nach chronischer Rückenmarksverletzungen erhalten. Gemittelt mBBB Partituren+ Standardfehler der mittleren einseitigen Mann-Whitney-U-Test, * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001; Geändert von Estrada et al., 2014 8 mit Genehmigung von Elsevier, wpl = Woche nach Initialläsion, WPR = Wochen nach der Resektion. Fehlerbalken = SEM (Standardfehler des Mittelwerts). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion at JoVE.com

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Experimentelle Strategien große Gewebelücken in das verletzte Rückenmark nach akutem zu überbrücken und chronische Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

experimental-strategies-to-bridge-large-tissue-gaps-injured-spinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Aufrufe.  Heinrich-Heine-University Medical Center. Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Serie: Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusionsbildgebung in der Ratte Halsmark

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Activity-based Training auf einem Laufband mit Rückenmark verletzt Wistar-Ratten

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...