Este trabalho foi financiado pelo projeto cérebro Coreia 21 PLUS para ciências médicas, Universidade de Yonsei. Além disso, este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa apropriada na faculdade de medicina da Universidade de Yonsei. Todos os animais são sacrificados em conformidade com as diretrizes do Comitê de cuidados com animais de laboratório na faculdade de medicina da Universidade de Yonsei.
1. preparação dos reagentes
Cuidado: Paraformaldehyde (PFA), acrilamida e sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) são irritantes tóxicos e, portanto, deve ser manipulado em uma coifa com equipamento de protecção adequado (EPI; jaleco, luvas, óculos de proteção).
<ol><li>solução de acrilamida (A.A) de 4% (A4P0): Adicionar 20 mL de solução de acrilamida 40% a 180 mL de 0.1 M tampão fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Solução de 0,25% VA-044: Adicionar 0,5 g de 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dicloridrato (VA-044) em pó para 200 mL de 0.1 M tampão fosfato salino (PBS). Enquanto o pó de VA-044 pode ser armazenado à temperatura ambiente, devem ser armazenado a 4 ° C, após solubilização em PBS. Para melhores resultados, prepare somente a quantidade de solução necessária para o experimento.</li>
	<li>Solução de cocktail Pacto: Adicione 10 g de acrilamida a 225 mL de solução a 4% paraformaldeído (PFA) e ajustar o volume de 200 mL com 4% PFA. Antes da utilização, adicione 100 mg de pó de VA-044 a 40 mL de mistura em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Pacto de limpar o buffer de solução: Adicione 40 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) a 350 mL de PBS 0,1 M e ajustar o volume para 500 mL com PBS 0,1 M. Para mPACT limpar solução, adicione 0,5% α-thioglycerol ao Pacto de limpar o buffer de solução.</li>
	<li>Os ratos utilizados neste estudo foram ratos masculinos da BALB 2 semanas de idade; os ratos utilizados neste estudo foram 2 semanas de idade SD-ratos machos.</li>
</ol>2. anestesia e cirurgia de perfusão
Cuidado: PFA e acrilamida são irritantes tóxicos e, portanto, devem ser manipulados em uma coifa com EPI adequado.
<ol><li>Anestesia o animal em um quarto livre de patógeno com 30 mg/kg de zoletil utilizando uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 26. Monitorar o animal por 5-10 min.</li>
	<li>Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico da anestesia, use o método do dedo do pé-pitada de resposta para determinar a profundidade da anestesia. Confirme a apatia. Nota: As seguintes etapas envolvendo cirurgia de rato e rato sigam um protocolo similar usado em um anterior de estudo11.</li>
	<li>Faça uma incisão de 5-6 cm abaixo da caixa torácica, através do tegumento e a parede abdominal.</li>
	<li>Use tesoura curva, contundente para fazer uma incisão no diafragma, palpar a área torácica para localizar o local da incisão de antemão.</li>
	<li>Estenda a incisão através de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural.</li>
	<li>Cuidadosamente, deslocar os pulmões. Fazer um corte através da caixa torácica até a clavícula. Usando uma tesoura de íris, faça uma pequena incisão à extremidade posterior do ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha de calibre 18 ou verde-oliva-ponta romba perfusão da aorta ascendente, passando por corte ventrículo.</li>
	<li>Segura a agulha e impedir o escapamento, fixando o coração com uma pinça hemostática. Como alternativa, use uma pinça hemostática modificada para fixar a aorta ao redor da ponta da agulha.</li>
	<li>Fazer uma grande incisão no átrio direito, tendo o cuidado de garantir o mínimo de danos para a aorta descendente. O rato está agora pronto para perfusão.</li>
</ol>3. toda perfusão e dissecção de rato
Cuidado: PFA e acrilamida são irritantes tóxicos e, portanto, devem ser manipulados em uma coifa com EPI adequado.
Nota: As seguintes etapas de perfusão inteiro são uma similar a um protocolo usado em estudo anterior por Woo et al. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Anexe o átrio direito do coração para uma agulha de calibre 18, tendo o cuidado de não introduzir quaisquer bolhas de ar.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 50 mL, rapidamente e uniformemente bomba 50 mL de solução de PBS 0,1 M fria contendo heparina (10 unidades/mL).</li>
	<li>Conecte a agulha de calibre 18 ao tubo da bomba peristáltica.</li>
	<li>Lavar com 200 mL de solução de PBS 0,1 M fria contendo heparina (10 unidades/mL) a uma velocidade de circulação de 10 mL/min.</li>
	<li>Fixe com 250 mL de solução fria de PFA 4% a uma velocidade de circulação de 10 mL/min. O rato deve ser duro nesta fase.</li>
	<li>Coletar e armazenar a solução restante da PFA para a eliminação.</li>
	<li>Pacto, para perfundir os tecidos com uma solução de pacto refrigerado cocktail de 4% PFA do acrilamido 4% e 0,25% VA-044 pó com uma agulha de calibre 18 e em seguida, retire a cabeça e a coluna vertebral. Expor o crânio, fazendo uma incisão na linha média do pescoço ao nariz. Esta etapa de perfusão adicional é desnecessária para os métodos psPACT e mPACT; após a fixação, imediatamente isolar a cabeça e a coluna vertebral e expor o crânio.</li>
	<li>Expor a base do crânio, removendo qualquer residual pescoço e músculos da coluna vertebral.</li>
	<li>Use ruginas e tesoura para descascar o crânio. Remova o cérebro ea medula espinhal.</li>
	<li>Armazenar o tecido em 4% PFA a 4 ° C; os tecidos podem ser armazenados por até 1 semana.</li>
</ol>4. hidrogel monômero infusão e polimerização do rato e do rato SNC
Cuidado: Acrilamida, SDS, α-thioglycerol e PFA são irritantes e, portanto, devem ser manipulado em uma coifa e com xixi apropriado.
<ol><li>
Pacto (técnica de compensação de passivo)
	<ol>
<li>Isolar e cultura todo SNC (cérebro e medula espinhal) do fixo e ratos para um tubo de 50 mL contendo uma solução de pacto refrigerada cocktail de 4% PFA, acrilamida de 4% e 0,25% VA-044 pó e loja a 4 ° C por 24 h. Certifique-se de que o tecido é completamente imerso no s olution.</li>
		<li>Incorporar a amostra de gás nitrogênio para 10 min, usando um tecido do gel sistema de hibridização, conectado a um tanque de nitrogênio: Configure o sistema para 37 ° C. Transferência de tecidos para um tubo de 50 mL contendo fresco frio (4 ° C) pacto solução cocktail e conectar-se com a tampa do tubo e, em seguida, ligue o aspirador.</li>
		<li>Para polimerizar o hidrogel, coloque o tubo contendo a amostra em uma incubadora de agitação (150 rpm, 37 ° C) por 3 h, ou até polimerização é completa.</li>
		<li>Usando papel mata-borrão (ver Tabela de materiais), remover o restante hidrogel polimerizado, os tecidos circundantes.</li>
		<li>Transferi o tecido para um tubo de 50 mL contendo solução de limpeza (8% SDS em PBS 0,1 M, pH 8.0).</li>
		<li>Coloca a amostra numa incubadora tremendo conjunto para 37 ° C e 150 rpm, até que o tecido tenha sido apagado. Em média, demora cerca de 20 dias para o mouse CNS para alcançar a total clareza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (processo separado técnica de compensação passiva)
	<ol>
<li>Isole o CNS inteiro (cérebro e medula espinhal) com osso cortador e tesoura de PFA-fixo e ratos sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Tecidos de transferir para um tubo de 50 mL contendo 4% PFA e loja a 4 ° C por 24 h. para garantir que o tecido é completamente imerso no fixador.</li>
		<li>Lave o tecido fixo por 1h em PBS 0,1 M e depois transferir a solução de A4P0 (4% do acrilamido em PBS 0,1 M). Loja a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Lave o tecido por 5 min em PBS 0,1 M.</li>
		<li>Mergulhe o tecido em 0,25% em PBS 0,1 M de VA-044. Armazenar a 37 ° C por 6-24 h e depois transferir a solução fresca de VA-044/PBS de 0,25%.</li>
		<li>Incorporar a amostra em gás nitrogênio por 10 min, usando um tecido do gel hibridização sistema (ver Tabela de materiais) conectado a um tanque de nitrogênio: transferência de tecidos para um tubo de 50 mL contendo fresco frio (4 ° C) solução de VA-044/PBS de 0,25% e se conectar com a tampa do tubo. Ligue o aspirador.</li>
		<li>Transferi o tecido para limpar a solução (8% SDS em PBS 0,1 M, pH 8.0).</li>
		<li>Incube a amostra numa incubadora tremendo conjunto para 37 ° C e 150 rpm, até que o tecido tenha sido apagado. Em média, demora cerca de 17 dias para mouse CNS para alcançar a total clareza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (técnica de compensação passiva modificada)
	<ol>
<li>Isole o CNS inteiro (cérebro e medula espinhal) com osso cortador e tesoura de PFA-fixo e ratos sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Siga os passos 4.2.2 - 4.2.8 do protocolo psPACT.</li>
		<li>Transferi o tecido para a solução de compensação. Observe que, ao contrário dos protocolos de pacto e psPACT, mPACT requer uma solução de limpeza consiste em 0,5% α-thioglycerol, além de 8% SDS em PBS 0,1 M, pH 8.0. Α-thioglycerol é um agente un-torra que ajuda a limpar o tecido mais rapidamente e eficazmente. Certifique-se de que o tecido está totalmente imerso na solução.</li>
		<li>Coloca a amostra numa incubadora tremendo conjunto para 37 ° C e 150 rpm, até que o tecido tenha sido apagado. Em média, demora cerca de 2 semanas para mouse CNS para alcançar a total clareza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. índice de refração de correspondência e imunocoloração de CNS apurada
Nota: jantes n(solução de correspondência do índice de refração baseada em Nycodenz) consiste em 0,8 g/mL Nycodenz pó dissolvido em 30 mL de tampão base (0,01% de azida sódica e Tween-20 em PBS 0,1 M, pH 8.0). É recomendável que a solução é colocada em um 37 ° C, agitando a incubadora para permitir a adequada solvatação do pó.
<ol><li>Incubar os tecidos em 0,1% Triton X-100 em PBS 0,1 M para 2 h, em seguida, bloquear com 2% albumina de soro bovino (BSA) em PBS 0,1 M para 6 h.</li>
	<li>Lave as seções três vezes em PBST (0.1% Tween-20 em PBS 0,1 M) para 2 h. mancha seções com anticorpos primários (no caso, um anticorpo de PECAM-CD31 anticoelho, que as manchas dos vasos sanguíneos) por 2 dias.</li>
	<li>Mancha de seções com anticorpos secundários (no caso, um cabra anti-coelho IgG Cy3 conjugado fluorescente) em BSA 2% por 2 dias.</li>
	<li>Lavagem rotulada tecidos três vezes em PBST por 2 h e a loja em 15 mL njantes para 2-10 dias.</li>
	<li>Antes de imagem, mova rotulado de tecidos para uma pequena quantidade de jantes nem pratos de cultura de tecido - ou 60-35mm. Fixe com silicone ao redor da borda inferior do prato.</li>
	<li>Adicione 1,5-2 mL de fresco njantes.</li>
</ol>6. processamento de imagem
<ol><li>Adquirir imagens de tecidos limpos com telha digitalização usando uma ampliação de 10x de microscopewith varredura a laser confocal (ver Tabela de materiais). Para de tecido Cy3-etiquetadas, usar comprimentos de onda de 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. 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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto os métodos de extração passiva, não-eletroforética empregado no Pacto melhorou significativamente a consistência alcançada com tecido anterior limpando métodos tais como clareza,2,3,4,7 , 8, a técnica ainda tem várias deficiências, o mais urgente do que é o período de tempo necessário para atingir o tecido máxima clareza12. No estudo atual, apresentamos protocolos modificados do pacto que reduzem significativamente o tempo necessário para o tecido, limpar, ainda preservando o tecido integridade e estrutura6,10. Além disso, pela primeira vez, podemos demonstrar a aplicação do tecido, limpando os protocolos em tecidos CNS e em um modelo de roedor de ordem superior, o rato10.
Especificamente, psPACT envolve o processamento de amostra em acrilamida 4% e 0,25% VA-044 em duas etapas distintas durante a formação de hidrogel, enquanto mPACT mais baseia-se psPACT e suplementos o SDS 8% solução com 0,5% de α-thioglycerol10de compensação. Separando a acrilamida e a etapa subsequente de VA-044 evita a necessidade de remover restante monômeros de hidrogel não polimerizadas que cercam o tecido, o que pode comprometer a integridade do tecido final depois de alcançar a transparência com o pacto; Além disso, isto reduz significativamente o tempo necessário para produzir o máximo afastamento óptico. A adição de α-thioglycerol no método mPACT mais acelera a clareira processar13, como α-thioglycerol é um agente un-torra que ajuda a limpar as regiões do tecido que são menos acessíveis usando apenas os reagentes no método pacto original 7 , 8 , 9.
Uma comparação do Pacto, psPACT e mPACT em tecido de roedor demonstrou que enquanto psPACT melhora a transparência óptica em relação o protocolo original do Pacto, mPACT mais eficiente permite a compensação e a subsequente de imagem de alta resolução de ambos todo órgãos de mamíferos e fatias secionadas, como demonstrado na Figura 2, Figura 3, Figura 4. A dispensa de α-thioglycerol-base lipídica dos órgãos transformados na chave mPACT método provado para as diferenças na estabilidade do tecido, transparência e eficiência em comparação com outros métodos de limpeza de dois. Isto permitiu a rápida análise 3D de órgãos transformados, especificamente no que diz respeito a morfologia da vasculatura de sangue, através da imunofluorescência e microscopia confocal (Figura 5E).
Enquanto a adição de α-thioglycerol para a solução de compensação baseada em SDS é fundamental para acelerar a transparência óptica, também ligeiramente aumenta a fragilidade do tecido e torna mais suscetíveis a danos de pós-processamento. A clara superioridade do mPACT com relação à sua eficiência supera essa limitação; no entanto, atualmente trabalho para garantir que a compensação máxima pode ser alcançada com mínima para nenhuma despesa da integridade do tecido.
Assim, nossos resultados estabelecem mPACT como uma poderosa ferramenta de investigação para fornecer uma análise 3D das características funcionais e anatômicas dos órgãos de mamíferos, incluindo mas não limitado a redes neuronais, vasculatura de sangue e tecido arquitetura de matriz. Movendo-se para a frente, acreditamos que mPACT pode ser especialmente útil na investigação de ordem superior mecanismos biológicos que contribuem para a fisiopatologia da doença, tais como lesão tecidual, malformações do desenvolvimento, câncer e neurodegenerativas doença14,15,16,17. Combinado com um estudo dos mais fino mecanismos celulares envolvidos na doença, mPACT tem potencial para fornecer uma escala multi mais completa, compreensão da doença díspar como vários mecanismos interagem para originar o fenótipo observado.

Dos objectivos fundamentais do inquérito científico e clínico envolve alcançar uma compreensão completa da estrutura do órgão e função; no entanto, a natureza extremamente complexa de mamíferos órgãos muitas vezes serve como uma barreira para atingir plenamente este objectivo1. CLAREZA (lipídios clara-trocadas acrilamida-hibridizado rígida de imagem compatível com tecidos-hidrogel)2,3,4, que envolve a construção de um híbrido baseado em acrilamida hidrogel de tecidos intactos, alcança acesso óptico de uma variedade de órgãos, incluindo o cérebro, fígado e baço, preservando sua integridade estrutural5. CLAREZA, portanto, permitiu não só a visualização, mas também a oportunidade de dissecar finamente complexas redes celulares e morfologias de tecido sem a necessidade de seccionamento.
Para alcançar o apuramento de tecido, clareza emprega métodos eletroforético para remover o conteúdo lipídico da amostra à mão. Enquanto a clareza tem sido notada por produzir híbridos de tecido-hidrogel fisicamente estável, estudos têm demonstrado que seu uso de métodos de compensação (ETC) de tecido eletroforética produz resultados variáveis em termos de qualidade de tecido, incluindo alourar, epítopo danos, e proteína perda5,6. Para solucionar esses problemas, protocolos modificados como Pacto (passivo clareza técnica), que substitui o tratamento ETC com uma técnica passiva, detergente iônico-baseado delipidation, têm sido desenvolvidos7,8,9. Apesar de atingir uma maior consistência nos resultados, no entanto, o pacto exige mais tempo para obter máxima abertura. Além disso, nenhuma destas técnicas ainda foram aplicadas a todo o formulário do CNS, ou em modelos maiores de roedores como ratos e cobaias.
O presente estudo pretende abordar estas limitações, propondo metodologias romance, psPACT (processo-separe pacto) e mPACT (Pacto modificado), para facilitar o rápido desembaraço do CNS inteiro e órgãos internos em tanto o rato e o rato modelos10. Especificamente, psPACT processos de tecidos em acrilamida 4% e 0,25% VA-044 em duas etapas distintas durante a formação de hidrogel; mPACT essencialmente envolve as mesmas etapas, mas complementa a solução baseada em SDS clareira com 0,5% de α-thioglycerol como um reagente chave. Ambas as técnicas aproveitar o endógeno sistêmico e uidos circulatório para reduzir significativamente o tempo necessário para produzir afastamento óptico. Como prova de princípio, vamos mostrar o uso da microscopia confocal para analisar padrões de vasos sanguíneos nos tecidos limpos10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

Desde o desenvolvimento de clareza, uma bioelectrochemical técnica de compensação que permite mapeamento tridimensional fenótipo dentro de tecidos transparentes, uma multiplicidade de metodologias de romance clareira incluindo cúbico (imagens do cérebro desobstruído, desobstruído cocktails e análise computacional), SWITCH (todo o sistema de controle de tempo de interação) e cinética de produtos químicos, mapa (análise ampliada da proteoma) e Pacto (técnica de clareza passiva), foram criadas para expandir ainda mais o conjunto de ferramentas existente para a análise microscópica de tecidos biológicos. O presente estudo tem por objetivo aperfeiçoar e otimizar o procedimento original do pacto para uma matriz de tecidos de roedores intactas, incluindo a todo sistema de nervoso central (SNC), rins, baço e embriões do rato inteiro. Denominado psPACT (processo-separe pacto) e mPACT (Pacto modificado), essas novas técnicas fornecem meios altamente eficazes de circuitos de célula de mapeamento e visualização de estruturas subcelulares em tecidos normais e patológicos intactas. No protocolo a seguir, apresentamos um esboço detalhado, passo a passo sobre como conseguir autorização de tecido máxima com o mínimo de violação de sua integridade estrutural através de psPACT e mPACT.

Geração de um modelo transparente do SNC inteiro usando técnicas de compensação passiva otimizado
Óptica autorização do camundongo e rato de tecidos CNS foi rapidamente alcançada utilizando várias técnicas de compensação passiva (Figura 1). Um esquema do tecido ao longo do tempo de compensação é mostrado na Figura 2A. Ao contrário do método original de pacto, psPACT (Pacto de processo-separe) envolve tratar amostras com solução de iniciador de VA-044 de 0,25% e 4% de acrilamida (A4P0) em duas etapas distintas, a fim de formar o híbrido de hidrogel. mPACT (Pacto modificado) melhora ainda mais psPACT, completando o SDS de 8%, limpando a solução com 0,5% de α-thioglycerol. Amostras processadas através do Pacto, psPACT e mPACT no dia 14 são comparadas e apresentadas na Figura 2B.
Em um estudo anterior, informamos que enquanto o protocolo original do Pacto alcançado óptico desembaraço em 23 dias, psPACT e mPACT limpou todo mouse CNS em apenas 20 e 14 dias, respectivamente,10. No presente estudo, quando tratamos de amostras de cérebro do rato através do protocolo mPACT, achamos que eles alcançaram a transparência óptica após 14 dias (Figura 2B). Rato toda CNS amostras processadas através de psPACT e mPACT também mostrou que mPACT conseguido autorização máxima com a maior eficiência, como tecidos foram apurados nos dias 20 e 30, respectivamente (Figura 3A, B). Cérebro de rato adulto sozinho, ao contrário do CNS inteiro, foram limpos com mPACT em um mero 5 dias (Figura 4A). Padrões de vaso sanguíneo do cérebro do rato apuradas foram analisados através de imunofluorescência após psPACT e processamento mPACT para demonstrar a utilidade destes procedimentos de compensação para a análise anatômica e funcional do cérebro (Figura 4B, dados mPACT mostrado em Woo et al. 2016)10.
Usando estes otimizado passivo tecido protocolos de compensação, fomos capazes de visualizar modelos intactos, transparentes do SNC todo, embora os tempos de compensação diferem entre os três protocolos. Passivo otimizado métodos de compensação alcançado clareza de órgão de um comprimento mais curto de tempo. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o método de compensação mPACT pode gerar claro CNS mais estável e rápido do que o anterior passiva métodos de compensação. Assim, mPACT possui grande potencial para uso análises no futuro estruturais e anatômicas dos órgãos de mamíferos e fornece uma vantagem significativa sobre os métodos existentes em termos de eficácia e segurança.
Geração de órgãos internos opticamente apurados e embriões usando mPACT
Além de tecidos CNS, o rato adulto baço e rins foram limpos com mPACT nos dias 19 e 23, respectivamente (Figura 5AB). Embriões do rato em E10.5 e E13.5 também foram liberados após 3 dias de processamento via protocolo mPACT. Figura 5 -E mostra a visualização de padrões de vasos sanguíneos em todo embrião, bem como da microvasculatura da região da cauda do embrião do rato, rato cauda equina e o baço de rato. Estes resultados sugerem que mPACT pode ser usado para gerar modelos transparentes de uma grande variedade de tecidos e órgãos para a análise anatômica 3D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática das técnicas de compensação passiva otimizado (Pacto). Um resumo das etapas individuais envolvidas em cada um dos três protocolos pacto é fornecido juntamente com os reagentes necessários para cada etapa. O protocolo original do pacto é a polimerização de tecido da formação de hidrogel com uma mistura fria de 4% PFA, solução de acrilamida (A.A) de 4% e 0,25% solução de iniciador de VA-044. Depois o tecido é polimerizado usando gás nitrogênio, que é passivamente cancelou com SDS de 8%, solução de compensação. O psPACT (Pacto de processo-separe) usa processos de tratamento separado de solução A.A de 4% e solução de iniciador de VA-044 de 0,25% para a formação de hidrogel do tecido; Estas condições diferem do protocolo original do pacto. O mPACT (Pacto modificado) adicional adiciona 0,5% α-thioglycerol 8% SDS limpando a solução do protocolo psPACT. Para todos os três protocolos, os tecidos intactos são incubados a > = 37 ° C numa incubadora de agitação até iss afastamento máximo alcançada. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig2.jpg"> Figura 2: transparência óptica do rato todo sistema nervoso central (CNS) por compensação passiva de tecido. (A) esquematização de todo tecido de CNS, através de métodos baseados em pacto de compensação ao longo do tempo. (B) comparação entre os três protocolos de compensação passiva (pacto original, psPACT, mPACT) rato toda CNS em 14 dias após o processamento. (C) liberação de ótica do cérebro do rato submetido a mPACT processamento durante 14 dias. Esta figura foi modificada de Woo et al . 201610. As letras em C 2 são 3 milímetros de altura. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig3.jpg"> Figura 3: transparência óptica de rato toda CNS tecidos post-psPACT e mPACT. (A) todo tecido de CNS rato adulto alcançado apuramento óptico máximo com psPACT após 30 dias. (B) tecido de CNS todo rato adulto alcançado apuramento óptico máximo com mPACT após 20 dias. O antes e depois de diagramas indicam o tamanho do SNC todo antes e após o tratamento, medida pelo olho. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig4.jpg"> Figura 4: mPACT visualização processamento e microvasculatura do cérebro do rato adulto seccionado. (A) comparação de cérebro de rato adulto grosso de 4mm seções depois mPACT processamento em 3 e 5 dias. (B) projeção 3D de padrões dos vasos sanguíneos no cérebro de ratos adultos visualizado com anticorpo anti-CD31 após o processamento de psPACT. Barras de escala, 1.500 µm e 100 µm. Esta figura foi modificada de Woo et al . 201610. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig5.jpg"> Figura 5: mPACT processamento de órgãos de roedores e embriões do rato inteiro. mPACT alcançado transparência óptica no baço de rato adulto (A) e (B) rim nos dias 19 e 23, respectivamente. (C) mPACT produzido embriões do rato transparentes de E10.5 e E13.5 depois de 3 dias. (D) visualização da microvasculatura com anti-CD31 na região da cauda do embrião do rato após limpeza com mPACT. (E) projeção 3D da vasculatura no rato cauda equina e baço de rato (F) com anti-CD31, após o processamento via mPACT. Esta figura foi modificada de Woo et al . 201610. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Aqui, apresentamos duas novas metodologias, psPACT e mPACT, para alcançar a máxima transparência óptica e posterior análise microscópica da vascularização do tecido no roedor intacta toda CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K visualizações.  Yonsei University College of Medicine. Aqui, apresentamos duas novas metodologias, psPACT e mPACT, para alcançar a máxima transparência óptica e posterior análise microscópica da vascularização do tecido no roedor intacta toda CNS.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...