German Legal Casualty Insurance (DGUV), Research Commission of the Medical Faculty of the Heinrich-Heine-University

הנחיות מוסדיים לבטיחות ונוחות חיה אנחנו דבקנו, וכל התערבות כירורגית טיפול בבעלי חיים לפני ואחרי כירורגית נמסרו ציות לחוק צער בעלי חיים הגרמני (לשכת המדינה, להגנת הסביבה לצרכן של צפון ריין וסטפליה, LANUV NRW ). 1. שלם חיתוך רוחב של כבל Thoracic השדרה של חולדות Wistar הנקבה (220 - 250 גרם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הרדמה משאיפת isoflurane (2 - 3% isoflurane ב O 2 / NO 2 ביחס של 1: 2) הזרקת בולוס של Carprofen (תת-עורית [SC] 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג). השילוב של carprofen ואת עצירות אופיואידים (0.02 מ&quot;ג / ק&quot;ג SC) מומלץ. התחל ניתוח כאשר רפלקס מכסה עין למגע קל עם מקלון צמר גפן רפלקס הנסיגה כפה צובט גירוי עם מלקחיים הם כבר לא נצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה על שמיכת חימום על 37 מעלות צלזיוס לשמור טמפרטורות גוףמחדש במהלך הניתוח משחת עיניים לשים על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הגב של החיה ולהכין את העור עם חומר חיטוי עור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור על קו האמצע לאורך חוליות החזה למשך 4 ס&quot;מ עם להב כירורגי ולפתוח אותו. משלב זה והלאה, השתמש מעוקר מכשירי ניתוח עבור כל ההליכים (autoclaved או טבילה מעוקרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו השרירים מעל חוליות בית החזה באמצעות שרירים קטנים מהדקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תהליכי spinous בבית החזה ברמה 8 (Th8) ו Th9 עם עצם rongeur ידי גזירת חתיכות קטנות בזהירות של העצם עד שהעצמות בחוליות הן שטוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים אנטומיים להרים את עמוד השדרה בבית TH7 תהליך spinous ולהשתמש rongeur קליפ חתיכות קטנות של העצם בחוליות מן הזנב מקורי עד laminectomy מתבצע Th8 ו Th9. לחשוף את דורה מאטר ללא פגיעה בו על ידי הסרת בזהירות רק מעטים מאוד חתיכות קטנות של העצם בחוליות בכל פעם.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את עמוד השדרה על ידי 2 מלחציים ייצוב על תהליכים spinous TH7 ו Th10, להרים את בעל החיים לִשְׁמוֹט תנועות נשימה מן החוליות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלם חיתוך רוחב חוט שדרה בבית חזה רמת 8/9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את דורה מאטר עם מלקחיים בסדר, לחתוך את דורה מאטר במספריים העין בסדר בכיוון רוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה, קיצוץ רוחבי של דורה מאטר עם מלקחיים בסדר להכניס וו השדרה לחלל subarachnoidic בין דורה מאטר ו arachnoidea. מנעו נזק של קרומי המוח על ידי לא דוקרים לתוך הקרום הרך או הדורה עם מלקחיים או או וו חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לסובב את הקרס למקם אותו לאורך כל רקמת חוט השדרה, נזהר שלא לדקור לתוך הדורה (פיא עדיין לא נפגע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את חוט השדרה של כ 1 - 2 מ&quot;מ כלפי מעלה, עד פער נתפס בצד הגחון בין רקמת חוט שדרה הדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מספרי עין בסדר לחלל between הדורה ופיאה לחתוך את חוט השדרה תוך קרס השדרה נשאר במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את שני גדמים של חוט השדרה עם שני מלקחיים חזותיים להבטיח חיתוך רוחב מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות-lesioned מלאות חיות עם פציעה כרונית, לסגור את הדורה על ידי תפרי קטע עם 9.0 אשכולות הלא adsorbable monofilament. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נגעים כרוניים לעקוב אחר חלק 1.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השרשת MMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח MMS מעל אתר פציעה עם שני צינורות הממוקמים בכל צד לרוחב של גוף החוליה ולהוריד אותה אל חלל נגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות תפר לשרירים בצד של גוף החוליה עם זכויות שאינן מקנות resorbable 4-0 חוט כדי להבטיח התייצבות MMS. ודא קיבעון של MMS באמצעות מלקחיים במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיני MMS על ידי חיתוך עם זוג מספרי בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הדורה מעל MMS תפרת אותו עם 9.0 אשכולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור אחד אל משאבת ואקום, ואת החותםוהשני על ידי כיווץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ שלילי עדין על MMS ידי משאבת ואקום באמצעות הצינור הפתוח, מוצץ את גדמי חוט השדרה לתוך לומן MMS. החל הלחץ השלילי במשך כמה דקות (מקסימום 10 דקות) ולפקח על ידי חיישנים (250 - 350 mbar). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הצינורות קרובים MMS ולהסיר את הצינורות. המשך עם שלב 1.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריתה של רקמת חוט שדרה כוללות צלקת הנגע הכרונית בשבוע ה 5 לאחר פגיעה ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 1.1.1 - 1.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות רקמה צלקתית לפי המראה חום-צהוב רקמות נוקשות על גבי חוט השדרה. הוצא בעדינות בשכבות השטחיות של רקמה צלקתית על ידי החזקת עם מלקחיים בסדר גזירה במספריים בסדר. באמצעות שיטה זו, לפתוח מחדש את האתר של laminectomy לחשוף את הרקמה המכילה את האזור הפגיע בחוט השדרה. עצור הכנה כאשר תפר הדורה מזוהה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את עמוד השדרה על ידי 2 ייצוב מלחציים על ספיןתהליכים מפוקפקים TH7 ו Th10, ולאחר מכן להעלות את החיה לִשְׁמוֹט תנועות נשימה מן החוליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סרגל קרטון קטן למדוד את שטח חוט השדרה שבו הוא להיות כריתה (אורך: מ&quot;מ 4) ולסמן את הקצוות של אזור רקמות בהתאמה זה עם חתכים רוחביים כדי לאפשר הפינוי הבא של רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמה צלקתית באמצעות שילוב של חיתוך והשאיפה. קח את הרקמה שהופרדה מן חוט השדרה עם החתכים הרוחביים. השתמש שאיפה עדינה בכל פעם זה מספיק כדי לאפשר פינוי של הרקמה. בנוסף, כל אימת המרקם הנוקשה של רקמת צלקתית עושה שאיפת רקמה קשה מדי, להשתמש במספריים בסדר לחתוך ולהסיר רקמה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חתיכה (כ קוביית 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) של ספוג הג&#39;לטין עוצר דמום לתוך פער הרקמה עד שוך דימום. ספוג ג&#39;לטין יתכווץ בגודל ברגע שהיא ספוגה בנוזל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Implantation של PEG 600 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 מיליליטר של חי הטהור PEG 600 להזרקה על ידי חימום עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ספוג הג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס כמות מספקת (כ 5 - 7 μl) של PEG לתוך הפער באמצעות מזרק 10 μl או פיפטה 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את האזור עם חתיכה (כ 5 מ&quot;מ x 4 מ&quot;מ) של החלפת איטום / דורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את האיטום לרקמות שריר עם כמה טיפות של דבק רקמות. מניח את האיטום על גבי פער הכריתה המלא PEG. כדי למנוע זליגה של האיטום, השתמש טיפות קטנות של דבק רקמות כדי לתקן את הפינות של האיטום אל רקמת השריר שמסביב. הערה: למנוע דליפה של דבק רקמות על רקמת חוט השדרה! </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת רקמות וטיפול לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרירי תפר שכבת עור שכבה עם תפרים שהופסקו עם 4-0 אשכולות adsorbable קלועים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 × 2.5 מ&quot;ל של נתרן כלורי (NaCl[0.9%]) בשעה 36 ° C SC עבור להחזרת נוזלים לאחר הניתוח. זריקה אחת של NaCl 5 מיליליטר תשתרע העור של החיה ועלולה לגרום ניזק מיותר לבעל החיים. אין להשאיר ללא השגחת חיה עד להכרה מלאה הוא חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק carprofen יומי (SC 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) עבור 2 ימים לפחות לאחר הניתוח. בית חיות בכלוב אחד במהלך 2 הימים הראשונים, לאחר מכן בקבוצות של 2 - 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפול אנטיביוטי (אוראלי יומית של Enrofloxacin) בשבוע שלאחר הניתוח הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם שלפוחית ​​השתן ידנית הרקה בשתיים עד שלוש פעמים ביום על ידי מלטפת בעדינות על הבטן של החיה מ מקורי כדי הזנב. היזהר שלא להזיז את עמוד השדרה של החיה לא להרים את החיה על הזנב. באופן ידני לבטל את שלפוחית ​​השתן של בעל החיים לחלוטין spinalized יומי בזמן ההישרדות כולו. יש להקפיד למקם כדורי מזון ובקבוקי מים לגובה אליו ניתן להגיע על ידי בעלי החיים ללאעומד על hindpaws שלהם. למרות היותו לקוי בתפקוד ברבעון אחורי, החיות לנוע ולחקור את הכלובים פעילים מייד לאחר ניתוח. מומלץ לשמור על החולדות בקבוצות חברותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור נגעים כרוניים להשאיר זמן הישרדות של בעלי החיים של חמישה שבועות לפני כריתת צלקת. בצע את שלבי 1.4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramer, L. M., Ramer, M. S., Bradbury, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+after+spinal+cord+injury:+towards+clinical+translation+of+experimental+strategies.">Restoring function after spinal cord injury: towards clinical translation of experimental strategies.</a> The Lancet. Neurology. 13 (12), 1241-1256 (2014).</li><li>McDonald, J. W., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+the+damaged+spinal+cord:+a+summary+of+our+early+success+with+embryonic+stem+cell+transplantation+and+remyelination.">Repairing the damaged spinal cord: a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination.</a> Prog. Brain Res. 137, 299-309 (2002).</li><li>Yoon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+spinal+cord+injury+treatment+using+autologous+bone+marrow+cell+transplantation+and+bone+marrow+stimulation+with+granulocyte+macrophage-colony+stimulating+factor:+Phase+I/II+clinical+trial.">Complete spinal cord injury treatment using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophage-colony stimulating factor: Phase I/II clinical trial.</a> Stem Cells. 25 (8), 2066-2073 (2007).</li><li>Brotchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spinal+cord+tumor+resection.">Intrinsic spinal cord tumor resection.</a> Neurosurgery. 50 (5), 1059-1063 (2002).</li><li>Estrada, V., Tekinay, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+ECM+mimetics.">Neural ECM mimetics.</a> Prog. Brain Res. 214, 391-413 (2014).</li><li>Tetzlaff, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Cellular+Transplantation+Therapies+for+Spinal+Cord+Injury.">A Systematic Review of Cellular Transplantation Therapies for Spinal Cord Injury.</a> J.Neurotrauma. 28 (8), 1611-1682 (2010).</li><li>Brazda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanical+microconnector+system+for+restoration+of+tissue+continuity+and+long-term+drug+application+into+the+injured+spinal+cord.">A mechanical microconnector system for restoration of tissue continuity and long-term drug application into the injured spinal cord.</a> Biomaterials. 34 (38), 10056-10064 (2013).</li><li>Estrada, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+significant+functional+improvement+in+chronic+severe+spinal+cord+injury+following+scar+resection+and+polyethylene+glycol+implantation.">Long-lasting significant functional improvement in chronic severe spinal cord injury following scar resection and polyethylene glycol implantation.</a> Neurobiol. Dis. 67, 165-179 (2014).</li><li>Rasouli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+glial+scar+following+spinal+cord+injury.">Resection of glial scar following spinal cord injury.</a> J.Orthop.Res. 27 (7), 931-936 (2009).</li><li>Schira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+clinical,+neuropathological+and+behavioural+recovery+from+acute+spinal+cord+trauma+by+transplantation+of+a+well-defined+somatic+stem+cell+from+human+umbilical+cord+blood.">Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood.</a> Brain. 135, 431-446 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הנה שתי גישות כירורגיות שונות מוצגות לגשר על פערי רקמה בחוט השדרה לאחר (1) השתלת חיתוך רוחב ו- MMS מלאים אקוטיים (2) נגע חוט שדרה כרוני להסרת צלקת סיבית בתוספת השתלת מטריקס PEG. שני אסטרטגיות להוביל שימור רקמות התחדשות axonal וכן שיפור תפקודי תנועה משמעותית של בעלי חיים שטופלו. עבור MMS השרשת קיבעון נאות של MMS בתוך חוט השדרה על ידי תפר דורת המשרד לאחר הניתוח הוא צעד טכני קריטי. את MMS מחזיקה פוטנציאל טיפולי נוסף בשל מערכת microchannel הפנימית המיושם שלה המאפשר העירוי המקומי של נוזלים פעילים מבחינה הטיפולית לתוך ליבת הנגע באמצעות, למשל., גידול minipump האוסמוטי מצורף 7. לשימוש הקליני בעתיד המיועד, חומר MMS צריך להיות bioresorbable. נכון לעכשיו, הייצור של מערכות מחבר המורכב של חומרים מבוססים lactide הואנבדק. יתר על כן, ציפוי של MMS עם חומר מוליך אלקטרוניים יוקם כדי להחיל שדות חשמליים טיפוליים חוט שדרת lesioned. באשר נגעים בחוט השדרה כרוני, אסטרטגיה אחרת באה, מאז המתח הפיזי של גדמי חוט השדרה נפרדו לאחר הסרת צלקת מניתוח הופיע גבוה מדי אם פער של כמה מילימטרים לחצותו. באופן מפתיע, המשקל המולקולרי הנמוך PEG 600 התברר biopolymer מתאים מאוד כדי למלא את הפער שנוצר. זה מאפשר ההיווצרות של גשר רקמות יציב המקדמת אנגיוגנזה ופלישה הסלולר של סוגי תאים מועילים. ההנחה היא כי התכונות הפיסיקליות של PEG600, כמו הצמיגות שלה, ממלאי תפקידים חשובים על היעילות שנצפתה מאז PEG-סוגים אחרים עם משקל מולקולרי גבוה או נמוך ו / או צמיגות לא היו מועילים. גישור על הפער הקטן יותר לאחר חיתוך רוחב חריף עם מחבר הרומןמערכת להוביל לשיפור תפקודי ברור מוקדם ככל 4 שבועות לאחר הפציעה. החיות בהתאמה הגיעו ציון BBB של כ 7 על ידי כי זמן הבדלים ברורים בין MMS-חיות וחולדות מלאות ניכרו. כרוני נפצעי חיות אשר קבלו כריתת צלקת השתלת PEG גם התאוששו טובות יותר באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, אבל השיפורים בלטו בעיקר בנקודות מאוחר יותר זמן (לאחר כ -16 שבועות). תצפיות כאלה יכולים להיות מוסברים על ידי אופי הפגיעה (כלומר., חריפה לעומת כרונית, פגם 1 מ&quot;מ לעומת 4 מ&quot;מ רקמה). במקרה של הנגעים הגדולים צמיחת ההתחדשות של אקסונים ברחבי אתר הנגע דורשת פרקי זמן ארוכים יותר. כמו כן, סביר מאוד כי תקופות הזמן הארוכות יותר של אי-שימוש של הגפיים האחוריים לגרום לתארים גבוהים של אירועים ניווניות, ולכן ב שיפורים פונקציונליים פחות בולטים. אופטימיזציה העתיד של הטיפול PEG לאחר SPI כרוניתפגיעה בחוט סופית, דרך גישות קומבינטורית, למשל., זריעה נוספת של PEG עם קידום צמיחה (גזע) תאים כמו תאי דם חבל טבור 10 in vivo, נבדקים כיום.

פציעה טראומטית בחוט השדרה לא רק מובילה לאובדן של אקסונים אבל זה תוצאות נוספות פגמי רקמות אשר לעכב כל תגובות רגנרטיבית (לסקירה ראה 1,2). רקמת חוט שדרה הוא אבד לעתים קרובות דרך ניוון משני מוביל ציסטה היווצרות או חורים בתוך ומסביב באזור הנגע. רוב ניסיונות טיפול להתמקד ניזקי חוט שדרה שלמים כמו חיתוך רוחב חלקי, פציעות למעוך או חבלה עם שפה נותרת של רקמה בריאה. עבור פציעות מלאות כמו transections חזויה כתוצאה מתאונות טראומטיות או התערבות כירורגית, כמו כריתות גידולים, רק מאוד אפשרויות טיפול מוגבלות זמינות היום 3,4. לאחר חיתוך רוחב מלא, מתח מכונאי של תוצאות רקמות הכחשת גדם שדרה, השארת רווח קטן בחוט השדרה. רוב האסטרטגיות להתמקד מילוי הפער הזה עם רקמות, תאים או מטריצות 5,6. הנה, אסטרטגיה שונהמוצג, כלומר מחדש והתאמה של הגדמים מופרד באמצעות מכשיר microconnector רומן 7. כדי readapt שני גדמים, כוח מכני צריך להיות מיושם כלחץ שלילי קל לעשות זאת (איור 1). מערכת microconnector המכאנית (MMS) היא מערכת מרובה ערוצים של polymethylmethacrylate (PMMA) עם חורים בצורת חלת דבש (איור 1 א) ובתנאי עם מערכת צינורות מוצאים. הוא מושתל לתוך פער הרקמות הנובעים חיתוך רוחב חוט שדרה מלא בחולדה (התרשים 1C). צינור אחד יכול להיות מחובר משאבת ואקום כדי להפעיל לחץ שלילי על MMS (1D איור). הלחץ מושך את גדמי חוט השדרה מנותקים לתוך החורים בצורת חלת דבש של MMS, אשר יש קירות microstructured להחזיק את רקמת במקום כשהיא משוחררת מלחצים (1B איור). הצינורות יכולים להיות שלמים שמאל לאחר ניתוח מצורף minipump האוסמוטי כדילהחדיר חומרים לתוך ליבת הנגע (איור 1E-F). מלבד חיתוך רוחב חריף של חוט שדרת סוג אחר של תוצאות נגע מלאות מפני הסרה כירורגית של גידול בעמוד שדרה או צלקת נגע כרונית מוצקה עובדת יוצרת הפערים גדולות של רקמה של כמה מילימטרים, אשר לא ניתן להתגבר על ידי MMS עד כה. רוב החולים עם טראומה בחוט השדרה סובלים מפציעות כרוניות. בחולים אלה, צלקת מפותחת תופסת את ליבת הנגע. הסרה כירורגית של צלקת הנגע היא מושג לטיפול אשר נחקר באופן שוטף אחרי ניסיוני SCI 8,9. בעוד הליך כריתה עצמו יכול להתבצע ללא גרימת נזק נוסף ניכר, הפער רקמות וכתוצאה מכך צריך להיות לגישור עם מטריצה ​​מתאימה המאפשרת ומקדמת את התחדשות של רקמות, במקרה הספציפי של פגיעות בחוט השדרה, התחדשות של סיבי עצב לשמור ולקדם פונקציות של תנועה. זה היהנמצא כי פוליאתילן גליקול משקל מולקולרי נמוך (PEG 600) הוא חומר מאוד מתאים למטרה זו. החוסר החיסוני שלה ואת הצמיגות נמוכה מאוד לאפשר אינטגרציה חלקה לתוך הרקמה שמסביב. החדרת biopolymer לבד מקדמת את הפלישה של תאים מועילים, כוללים תאי אנדותל, תאי שוואן פריפריה, האסטרוציטים, ו - מאוד חשוב - את ההתחדשות ואת ההתארכות של אקסונים של ירידה ועליית קטעי סיבים וכן ensheathment שלהם על ידי המיאלין קומפקטי 8. תגובות התחדשות אלו נמצאו להיות מלווה שיפורים פונקציונליים לטווח ארוך. השילוב של כריתה של רקמת צלקתית וההשתלה הבאה של PEG 600 הציג אמצעי בטוח ופשוט, אך יעיל מאוד של גישור פגמי רקמת חוט שדרה משמעותי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG 600 Ph Eur&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Merck/VWR&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8,170,041,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelastypt gelatine sponge&#160;&#160;</td>
			<td>sanofi Aventis</td>
			<td>PZN-8789582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nescofilm Sealant&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2569.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rimadyl (Carpofen)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forene (Isoflurane)</td>
			<td>Abbvie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodan (skin disinfectant)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histoacryl (tissue glue)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, straight&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16020-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-in-one Micro Spatula - 12 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #7 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11273-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spinal cord hook&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10162-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clamp&#160;</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>EA016R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon Vicryl 4-0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-retaining retractor&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17008-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skin clamp&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluspray&#160;</td>
			<td>Selectavet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental strategies to bridge large tissue gaps in the injured spinal cord after acute and chronic lesion

לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI) צורות צלקתית הליבה הנגע אשר מעכבת התחדשות axonal. גישור האתר של פציעה לאחר עלבון חוט השדרה, כריתות גידולים או פגמי רקמות כתוצאה מתאונות טראומטיות יכול לסייע בקידום תיקון רקמות כללי וכן צמיחת התחדשות של סיבי עצב לתוך ומעבר האזור הפגוע. שתי אסטרטגיות טיפול ניסיוני מוצגות: (1) השתלה של מכשיר החדש microconnector לתוך בחריפות ובאופן מוחלט transected כבל חזה עכברוש שדרת readapt ניתקה גדמי רקמת חוט שדרה, ו (2) מילוי פוליאתילן גליקול של אתר SCI בחולדות lesioned כרוני לאחר כריתת צלקת. נגע חוט השדרה הכרוני במודל זה הוא חיתוך רוחב חוט שדרה שלם שבו נגרם 5 שבועות לפני הטיפול. שני השיטות השיגו לאחרונה מאוד תוצאות מבטיחות וחזרת אקסונלית קדמה, פלישה הסלולר מועילה ושיפורים תפקודייםבמודלים של מכרסמים של פגיעה בחוט השדרה. המערכת microconnector מכני (MMS) היא מערכת רב ערוצית מורכב polymethylmethacrylate (PMMA) עם מערכת צינורות מוצא להפעיל לחץ שלילי על MMS לומן ובכך מושך את גדמי חוט השדרה לתוך החורים מובנה חלת דבש. לאחר ההשתלה שלו לתוך פער רקמות 1 מ&quot;מ הרקמה נשאבה לתוך המכשיר. יתר על כן, על הקירות הפנימיים של MMS הם microstructured הידבקות רקמות טובה יותר. במקרה של הגישה הפגיעה בחוט השדרה הכרונית, רקמת חוט שדרה - כוללים באזור הנגע מלא צלקת - היא כריתה על פני שטח של 4 מ&quot;מ האורך. לאחר כריתת צלקת מייקרו החלל שנוצר מתמלא פוליאתילן גליקול (PEG 600) אשר נמצאה לספק תשתית מצוינת עבור פלישה הסלולר, רה-וסקולריזציה, התחדשות axonal ויצירת מיאלין קומפקטית אפילו in vivo.

<html> שימור רקמות, אקסונלית לצמיחה מחודשת ותגמולים פונקציונליים של השרשת MMS לאחר חיתוך רוחב החריפה שלם של חוט השדרה זה הוכח כי ההשתלה החריפה של MMS התייצבה גדמי חוט שדרת transected לחלוטין וירידת הצטמקות של הרקמה (איור 2 א לעומת B). דמיינו כפי מכתים Trichrome בסעיפי sagittal, המכתים הירוק רקמת החיבור של צלקת פיברוטית ליבת הנגע הוא הרבה יותר צפוף ויותר בולט חיות בקרה-lesioned (איור 2) מאשר אצל בעלי חי MMS מושתל (איור 2 ג). מעניין, לא נמצאו הבדלים שנצפו פעמי הישרדות ארוכות הצטברות מקרופאג באתר הנגע דמיינו כפי מכתים immunohistological נגד ED-1 ב MMS מושתל לעומת חיות lesioned מלאות (לא מוצג). ithin-page = &quot;1&quot;&gt; מייד לאחר השתלה, חוסר רקמת לומן MMS נצפה שהיה מלא לאחר מכן עם תאים ורקמות לאחר מספר ימים. בשעה 5 שבועות לאחר הניתוח ingrowth אקסונלית מסיבית לתוך לומן MMS ניתן היה לזהות (איור 3 א). יתר על כן, MMS לומן היה vascularized (איור 3B) ומבנים אקסונלית נמצאו בסמיכות של כלי הדם (לא מוצג). הערכת התוצאה של התנועה באסתי-הביטים-ברסנהאן בשטח הפתוח (BBB), חשפה שיפור תפקודי משמעותי של חיות-מושתל MMS (קו שחור באיור 3C) לעומת בעלי חיים-lesioned מלא (קו אפור איור 3 ג) בשבועות 2 ו -4 שלאחר הניתוח. תא פלישה, רה-וסקולריזציה, התחדשות axonal ושיפור תפקודי חולדות שנפגעו בעמוד שדרה כרונית לאחר כריתת הצלקת ופג השרשה במצב פציעה כרוניתls של חיתוך רוחב חוט השדרה החזי חלקית ולהשלים הן את הסרה כירורגית של הצלקת הנגע בשבוע חמש לאחר הפגיעה הראשונית לא גרם כל נזק נוסף לזיהוי או אי נוחות לבעלי החיים. כריתת צלקת וההחדרה הבאה של PEG 600 הובילו התחדשות של רקמות אשר לא הורגש בתוך המטריצה ​​(איור 4). בנוסף, בתצהיר של נדני קולגן תאיים - אשר אופיינית עבור meshwork קרום במרתף של רקמות צלקת - לא היה בולט כמו לאחר טיפול PEG (איור 4C) בהשוואה לקבוצת הביקורת הנגע בלבד (איור 4). בניגוד הצלקת הכרונית של בקרות נגע בלבד (לא מוצג), באתר כריתה מלא מטריקס פלש תאים מקדם גדילת האקסון לאחר הכריתה. כבר מוקדם ככל כריתה אחד בשבוע שלאחר וטיפול כמה סוגי תאים מועילים באזור מטריקס ניתן היה לזהות כמו תאי האנדותל (אשר נמצאו להיות נוכח נ דם התחדשותessels [איור 4D]), האסטרוציטים (איור 4F) ותאי שוואן היקפי (איור 4G). חמישה שבועות לאחר הכריתה באזור שטופל PEG מתמלא פרופילי axonal רבים (4E איור). מטריצת PEG קדמה את צמיחת משובים המשמעותית של אקסונים רבים (האיור 4D, E, G). עם התחקות מחקרים והכתים immunohistochemical, עולה שונים ויורדים אוכלוסיות axonal ניתן היה לזהות בה מחדש לא רק לתוך אלא גם מעבר לשטח PEG מלא 8. הילוכים EM מנתח של האזור המטופל של חיות עם תקופת ההישרדות ארוך (8 חודשים) לא רק אישר את נוכחותו של תאי שוואן אך בהמשך גילה myelination הקומפקטי של אקסונים מחדש בתוך PEG-מטריקס 8. פרופילי האקסון מחדש היו קשורים לעתים קרובות עם תחומי אנגיוגנזה(איור 4D). Stainings immunohistochemical הוכיח כי הפרופילים האקסון אשר נמצאו באזור כריתת המטופלים היו קשורים באופן הדוק עם בתאי השווא ועשו כאילו שאני myelinated ידי תאים אלה כבר בנקודות זמן מוקדם לאחר הכריתה והשתלת 8. לטווח ארוך (שמונה חודשים) מחקר ההתנהגותי חשף שיפורים פונקציונליים של תנועה לאורך הזמן משמעותיים לאחר כריתת צלקת כרונית PEG-טיפול (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig1.jpg" /> איור 1. MMS תכנון עקרון הפעולה (א) תמונה מצולמת של MMS, (B) microstructures משטח דבק של הצדדיים MMS, סרגל קנה מידה:. 50 מיקרומטר, (CF) ציור סכמטי: (ג) implantation של MMS לתוך נגע חוט השדרה, (ד) יישום של ואקום למצוץ את הרקמה לתוך מבנה חלת הדבש (חץ אדום: לחץ שלילי), (ה) כוח דבק שומר על גדמי חוט שדרה בסמיכות במרחק של רק מיקרומטרים כמה, (F) הפצה של חומרים פרמקולוגיים לומן באמצעות 4 ערוצים מיקרו פנימי (להצביע חיצים שחורים על מיקרו-ערוצי 1 - 4). עירוי מתואר על ידי חץ כחול בנמל המפרצון. בשכונה ד - E רק חצי אחד של MMS מוצג. נדפס מן Brazda ואח 2013 7 באישור Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig2.jpg" /> איור 2. שימור רקמות שדרה לאחר MMS Implantation. רקמת חוט שדרה ב -6, שו&quot;ת. 7 חודשים לאחר חיתוך רוחב הכולל עם (א) ומבלי שתל MMS (B). החץ (ב &#39;) עולה באזור חוט השדרה המתאים באתר ההשתלה של MMS (החץ) ב (א). שים לב ההצטמקות של רקמת חוט השדרה של בעלי החיים שלא טופלו (B) בניגוד למבנה השתמר היטב (א). Trichrome מכתים סעיפי כבל sagittal שדרה לאחר השתלת MMS (C) לעומת בעלי חי שליטה ללא שתל (D). רקמת חיבור, אדום:: ירוק ציטופלזמה, שחור: nucleus.The מרכז נגע מתמלא רקמת צלקתית (ירוק) אצל בעלי חיים-lesioned מלא (D, חץ שחור מתאר מוקד נגע), ואילו צלקות שוליות בלבד ניכרו ברחבי MMS ב המטופלים חיות לאחר 14 ימים (C). ראוי לציין, כי MMS מורכב מבני חלת דבשאשר נשטפים החוצה במהלך עיבוד רקמות אם חתך 20 מיקרומטר פרוסות. סרגל קנה מידה עבור (A, B) (A), עבור (C, D) ב (ד): 1 מ&quot;מ. שונה מן Brazda ואח 2013 7 באישור Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig3.jpg" /> איור 3. אקסונלית התחדשות, רה-ווסקולריזציה ו- Open שדה של תנועה ציון לאחר MMS השרשה. (א) מכתים immunohistological של neurofilament פוספורילציה עם סמן הפאן אקסונלית (PAM) בקטע כבל sagittal השדרה בבית 5 שבועות לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה מלאה והשתלת MMS. לומן MMS מותווה על ידי כוכבי. הקירות (W) של MMS מסומנים על ידי מקווקוקווים. הערת אקסונים הרבים מוכתמים לומן MMS הרקמות נטולות בעבר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ב) מכתים immunohistological של כלי דם בתוך לומן MMS (המזוהה עם גורם פון Willebrand [vWF] מכתים, ירוק). (ג) הערכת התוצאה של תנועת BBB ל- MMS מושתל (הקו שחור, N = 9) לעומת חיות פצועות מלאות (קו אפור, N = 6). על BBB ממוצע של hindlimb שמאל וימין (ממוצע לכל קבוצה) מתואר עם סטיית תקן. הבדלים משמעותיים סטטיסטית מסומנים בכוכביות (Mann-Whitney דרג סכום מבחן, p &lt;0.05). שונה מן Brazda ואח 2013 7 באישור Elsevier. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig4.jpg" /> איור 4.PEG מטריקס מקדם התחדשות רקמות פלישה סלולרית המועילה הבאים צלקת כריתה וטיפול. (א) סודן שחור מכתים מראה כי חלקים גדול של פער הכריתה (נטול מכתים סודאן השחור) מלאים רקמה 1 שבוע כריתת פוסט. (B, C) ​​הכתמה של צלקת הנגע עם סיבי IV סוג קולגן על כריתת 1 בשבוע שלאחר. צלקת צפופה שוהה חי בקרה בעוד חיות שטופלו PEG לחשוף immunostaining חלש בהרבה ומובחן יותר. שטח (D) של אנגיוגנזה (WWF) מכיל פרופילים של אקסונים מחדש (המזוהה עם neurofilament [NF]) ב כריתה אחד בשבוע שלאחר. (E) אקסונים רבים גדלו לתוך באזור המטופל ב 5 שבועות לאחר כריתה. (F, G) שתי גליה fibrillary חלבון חומצי חיובי (GFAP +) האסטרוציטים ותאי S100 + שוואן לפלוש מטריצת PEG וזו נמצאת בשיתוף הדוק עם regenerating אקסונים כבר לאחר טיפול פוסט 1 בשבוע. ברי סולם: (א) 1 מ&quot;מ; (CF) 100 מיקרומטר, (G) 50 מיקרומטר. (BG):.. מותאם ואח אסטרדה 2014 8 באישור Elsevier <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53331/53331fig5.jpg" /> שיפור איור 5. של פונקציה של תנועה לאחר פגיעה בחוט שדרה כרוני, כריתת צלקת ו PEG-טיפול. הערכת התוצאה של תנועת BBB (mBBB) השונה עבור PEG שטופל (PEG, rhombs השחור, N = 13-14 לכל timepoint) לעומת שליטה בעלי חיים, אשר קבלו חיתוך רוחב חוט שדרה הכולל ללא כריתת צלקת (TX, משולשים לבנים, N = 13-14 לכל timepoint) לאחר פגיעה בחוט שדרה כרונית. דירוגים ממוצעים mBBB+ סטיית התקן של הממוצע חד צדדי מבחן Mann-Whitney U, * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001; שונה מן אסטרדה et al., 2014 8 באישור Elsevier, WPL = שבוע הנגע הראשוני פוסט, WPR = שבועות לפרסם כריתה. שגיאה בר = SEM (שגיאת תקן של הממוצע). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53331/53331fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion at JoVE.com

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

אסטרטגיות ניסיון לגשר על פערים גדולים של רקמה בחוט השדרה נפגע לאחר חריפת נגע כרוני

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

experimental-strategies-to-bridge-large-tissue-gaps-injured-spinal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Heinrich-Heine-University Medical Center. Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Video: Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

ההדמיה דיפוזיה בחוט השדרה עכברוש צוואר הרחם

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

ההדרכה מבוססי פעילות על הליכון עם חוט השדרה נפגע Wistar חולדות

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...