This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

Todos os estudos in vivo foram aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e usado feminino camundongos C57 / BL6J. Cultura de Células 1. Murino cancro do ovário <ol><li> Adicione o meio de cultura ID8 murino ovário de células de cancro da seguinte forma: 1 L de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 4% de Soro Bovino Fetal (FBS), 1% de Penicilina / Estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina e 5 ng / ml de selenito de sódio. </li><li> Transdução ID8 células de câncer de ovário murino 13 para expressar Red Fluorescent Protein (RFP), utilizando partículas lentivirais comercialmente adquiridos expressam RFP e um marcador de selecção (blasticidina gene). Note-se que a proteína fluorescente verde pode ser usado, mas fornece um sinal de fluorescência mais fraca. <ol><li> Imediatamente antes da transdução, as células de cultura a 50 - 70% de confluência e adicionar meio fresco (sem penicilina / estreptomicina) que inclui 1 ml de polibreno (5 ug / ml final,concentração). </li><li> Suavemente pipeta RFP-lentivírus (20 mL) gota a gota para o prato e incubar a 37 ° C durante 72 horas. Remova o meio e incubar com meio fresco durante 24 h. Comece a selecção de células transduzidas por adição de blasticidina para o meio de cultura (5 ug / ml) e monitor para células vermelhas através de microscopia de fluorescência (Figura 1). </li></ol></li><li> Cultura das células marcadas com RFP em forma ID8 por sementeira de aproximadamente 10 6 células num prato de cultura de tecidos e visualizando diariamente utilizando um microscópio de luz, até que a monocamada de células é confluente. </li><li> Quando confluentes, colher as células utilizando tripsina (0,25%, 3 min) e devolver o balão para a incubadora a 37 C até que o as células são separadas. </li><li> Neutraliza-se a tripsina com 6 mL de meio de cultura contendo soro de ID8. Pipeta cima e para baixo contra o fundo do prato, em seguida, transferir para um tubo de 15 ml. Centrifugar a 1200 rpm durante 2 min, em seguida, aspirar o meio utilizando uma glpipeta ass. </li><li> Lavam-se as células com tampão fosfato salino (PBS) por ressuspensão suave em 6 ml de PBS morno e centrifugação como em 1.5 acima. Re-suspender em PBS para uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml. Manter as células quentes (37 ° C) até injeção. </li></ol> 2. intra-peritoneal injecção de células ID8 e in vivo de imagens <ol><li> Injectar cada ratinho, com 2 ml de solução de ID8-PBS quente para um total de 10 milhões de células por via intra-peritoneal (ip). Permitir que as células tumorais a crescer in vivo, durante cerca de 10 semanas, com imagens ao vivo semanal. </li><li> Imediatamente após a injecção e cada semana depois disso, pesar os ratos e depois anestesiar cada rato usando isofluorano (taxa de fluxo de 2,5% em 0,5 L / min O 2 de fluxo). Nota: Os ratinhos foram pesados, e não como uma medida quantitativa da carga tumoral, mas sim uma medida mais geral de ratinho individual progressão física ao longo do estudo. camundongos pesamts foram comparados com os seus próprios valores de peso anteriores. <ol><li> Anestesiar ratos, colocando em uma câmara de isoflurano. Manter a anestesia constantes durante a digitalização posicionando a cabeça de rato no nariz-cone para a exposição ao isoflurano caudal de 2,5% durante todo o procedimento. </li></ol></li><li> Use creme depilatório para remover os pêlos do torso e do abdome de cada rato, como o cabelo preto fará com que a atenuação do sinal de fluorescência. Os ratinhos são banhadas com água morna, após a aplicação do creme depilatório e secou-se com toalhas de papel RT. </li><li> Enquanto anestesiados, digitalizar todo o corpo de cada rato usando um sistema de imagem óptico de pequenos animais. Verificar todos os ratos em uma coorte em cada ponto de tempo. Use o seguinte dois protocolo passo (Figura 2A): <ol><li> No Passo 1, para observar as células tumorais marcadas por fluorescência (RFP), executar aquisição multi-espectral para recolher um total de 5 imagens usando filtros de excitação de 440 nm, 460 nm, 480 nm, 520 nm e 540 nm e um filtro de emissão de 600 nm. Utilize os seguintes parâmetros de aquisição: a exposição padrão de 15 segundos, 2 x 2 binning, FOV de 160 mm e f parada de 1,1. </li><li> No Passo 2, para observar o animal inteiro, adquirir uma imagem de reflectância usando um filtro aberto de excitação (luz branca), um filtro de emissão aberta, uma exposição padrão de 0,2 seg com 2 x 2 e arrumação de um FOV de 16 cm. Nota: O tempo de imagem efectivo é de ~ 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Rato Dissecção e Aquisição de Imagem <ol><li> Quando imagens ao vivo mostra a presença de doença intra-peritoneal ou animais acumulação extensiva exposição de ascite (como evidenciado pela distensão abdominal), perda ou ganho de peso corporal superior a 20%, letargia ou outros sinais de aflição, eutanásia cada rato usando CO 2 anestesia seguida de deslocação cervical. </li><li> Cortar a pele anteriormente ao longo da linha média ventral do rato, usando dissectio pontasn tesoura, a partir da parte superior das coxas para a parte inferior da caixa torácica. Tome muito cuidado para cortar apenas a camada da pele (Figura 2BI). Delicadamente separar a pele do tecido peritoneal, tendo a certeza de não perfurar a parede peritoneal. </li><li> Com uma tesoura de dissecação, cortados pontiagudas tanto lateralmente ao longo da parte inferior da caixa torácica e na parte superior das coxas para criar duas abas de pele (Figura 2B II, III). </li><li> Coloque cada rato em seu lado ventral (cavidade peritoneal voltada para baixo) com as abas de pele abriu e digitalizar cada rato com seus órgãos in situ usando o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3A, B). <ol><li> Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem, conforme descrito no 2.4.1.-2.4.2. </li></ol></li><li> Continuar dissecando o rato através da extracção de órgãos peritoneais individuais, incluindo fígado, omento / pâncreas, estômago, diafragma, intestino delgado, intestino grosso, à esquerda e à direita do peritoneu, ovários, kidneys, mesentério e almofada de gordura. <ol><li> Observe, enumerar e registrar tumores visíveis em cada órgão. Use uma pinça para medir o diâmetro de cada tumor. </li><li> Designar tumores inferior a 2 mm de diâmetro tão pequeno, de entre 2 e 5 mm como meio e superior a 5 mm, como grande. </li></ol></li><li> Colocar os órgãos sobre o modelo de varrimento do órgão (Figura 4) que identifica um local pré-determinado para cada órgão. Use PBS para manter os órgãos úmido. </li><li> Digitalizar cada folha de órgãos que utilizam o pequeno sistema de imagem óptico do animal (Figura 3C, D). <ol><li> Use os mesmos parâmetros de aquisição de imagem como descrito no passo 2.4. </li></ol></li><li> Após a digitalização, órgãos lugar em formol a 10% para permitir o processamento posterior para histologia. </li></ol> 4. Quantificação da carga tumoral em the fluorescência Imagens <ol><li> A fim de reduzir a quantidade de auto-fluorescência em cada varrimento multi-espectral, primeiro unmix os ficheiros utilizando software disponível com o sistema de imagiologia de pequenos animais. <ol><li> Carregar pela primeira vez a RFP: No arquivo espectral Vivo, seguido pelo Autofluor: No arquivo Vivo Vermelho na janela de Unmixed Imagens e selecione Unmix. </li></ol></li><li> Exportar os arquivos .bip como formato de 16 bit .tiff (sem escala). </li><li> Use software ImageJ (órgãos ex vivo e, em seguida, o corpo inteiro do rato com órgãos in situ). <ol><li> Use File&gt; Open para abrir os arquivos .tiff 16 bits dos arquivos de modelo de digitalização órgão em ImageJ. </li><li> Sob Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para 35.353 e depois sobImagem&gt; tabelas de pesquisa, selecione Red Hot. Nota: Vários modelos animais irá requerer diferentes níveis de brilho, mas é importante para manter o brilho consistente ao longo de um determinado estudo. </li><li> Usando a ferramenta Freehand Selection, desenhe uma região de forma livre da seleção interesse (ROI) em torno de cada órgão e usar a ferramenta Measure (CTRL + M) para calcular a área de superfície de cada órgão; gravar a área de superfície de cada órgão em uma planilha. </li><li> Com o ROI desenhada em torno de cada órgão, clique direito dentro do ROI e selecione Duplicar para incluir apenas o órgão. </li><li> Enquanto olha para o órgão indivíduo, sob Image&gt; Adjust&gt; Threshold, optar por definir o limiar da imagem para um limiar menor nível de + 1200 e um limite de Nível Superior de + 1,700 para selecionar only regiões mais brilhantemente fluorescentes e verificar para seleccionar fundo escuro; selecione OK. Nota: As imagens podem exigir manipulação manual dos controles deslizantes de limiar em ImageJ para que as áreas anteriormente brilhantes são selecionados para a etapa de análise, como mostrado acima. Diferentes modelos de doença irá requerer diferentes constrangimentos de limiar, mas é importante para manter os níveis de limiar consistentes ao longo de um determinado estudo. </li><li> Sob Analisar&gt; Analisar Partículas, altere o Tamanho (pixels ^ 2) a 10 Infinito, optar por mostrar: esboços, verificar para selecionar apenas &quot;Mostrar resultados&quot; e clique em OK para medir ambas as áreas e densidades integrados matérias destas regiões brilhantes, tumores considerados. </li><li> Grave os valores de área de superfície ea densidade Raw Integrado de cada seleção tumor exibido no <strong&gt; tabela de resultados na mesma planilha contendo as áreas de superfície de órgãos. </li><li> Sob Analisar&gt; Ferramentas&gt; Calibragem Bar, adicionar uma barra de escala de calibração para as imagens dos órgãos. Nota: Neste exemplo, isso foi feito mudando o local para superior direito, a cor de preenchimento de preto, a cor do rótulo de White, o número de etiquetas a 5, as casas decimais para 0, o tamanho da fonte para 12 e o Zoom fator para 4,0 e permitindo texto em negrito. </li><li> Em Arquivo&gt; Salvar como ..., salvar a montagem como um .tiff e .jpeg. </li><li> Use File&gt; Open para abrir o arquivo .jpeg dos órgãos e, em seguida, em Inserir&gt; Caixa de Texto </strong&gt;, adicionar rótulos de órgãos através da criação de uma caixa de texto abaixo de cada uma das três linhas de órgãos. </li><li> Use File&gt; Open para abrir cada uma das ficheiros.tiff 16 bits dos scans de corpo inteiro em ImageJ a ordem do número mouse. </li><li> Sob Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast, optar por definir o valor mínimo exibido para 0 e o valor máximo exibido para + 35353 e depois em Imagem&gt; tabelas de pesquisa, selecione Red Hot. </li><li> Em Arquivo&gt; Salvar como ..., salvar a montagem como um. Tiff e .jpeg. </li></ol></li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Adicionar as áreas de selecção de tumor e as densidades de matérias-integrados, respectivamente, para cada órgão de cada rato e registar a área total do tumor para cada ratinho de órgãos. </li><li> Normalizar a área gravada e integrat cruaOs valores de densidade ed para o tamanho de cada órgão pela divisão da área total da lesão e valores de densidade integrados matérias totais pela área de superfície do órgão correspondente (Tabela 1). </li><li> Calcular e representar graficamente a média de ambas as áreas de superfície do tumor normalizados e os valores de densidade em bruto integrados normalizadas (Figura 5A, B). </li><li> Comparar estes valores médios para as obtidas por contagem visual os tumores que eram visíveis a olho nu durante a inspecção de cada órgão de lesões metastáticas. </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo.">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li><li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer.">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li><li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer.">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li><li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

Este artigo é parte de uma edição especial on Imaging Multimodal pré-clínica, patrocinado pela Bruker Biospin.

Em contraste com os estudos que utilizam células de cancro do ovário humano que devem ser realizados em ratinhos imunocomprometidos, o protocolo descrito acima utiliza imunocompetentes ratinhos C57 / Bl6 e células de cancro do ovário murino singeneicas. Enquanto isto permite avaliar o papel potencial de infiltrados imunes em progressão tumoral e metástases, a presença de cabelo escuro na superfície abdominal torna menos sensível imagiologia. Utilização de um depilatório para remover os pêlos antes da imagem aumenta de aquisição de imagem, mas é, em particular para experiências que requerem imagiologia longitudinal demorado. camundongos sem pêlo &#39;nus&#39; pode ser usado neste protocolo e não necessitam de remoção de pêlos depilatório-based. Além disso, ratinhos nus carecem de um sistema imune funcional, de modo que também pode ser utilizado para avaliar o crescimento das células cancerosas do ovário humano, em experiências em que a contribuição do sistema imunitário não está sob análise. Deve também ser notado que a profundidade de intrapertumores itoneal também apresenta desafios técnicos, como imagem de fluorescência óptica geralmente não vai detectar tumores em profundidades superiores a 5 mm. Além disso, a prevalência de fluido de ascites e a presença de células de tumor ascítico fornecer complicações adicionais. Temos observado variabilidade significativa rato-para-rato na formação de fluido de ascites, mesmo quando injectado com a mesma linha celular. Assim, na presença de ascite, este método é preferível para análise do ponto final da carga tumoral específico do órgão, em vez de imagiologia longitudinal rotina de progressão. No caso actual, alterações dramáticas na carga do tumor foi observada entre os ratinhos exemplo, de tal modo que grupos de quatro ou cinco ratos geralmente será suficiente para a análise estatística. No caso de diferenças menos dramáticos na carga tumoral, sujeitos experimentais adicionais que serão necessários para atingir o poder estatístico. Embora os exemplos aqui apresentados diferem significativamente no volume tumoral, imagiologia óptica de fluorescência pode ser utilizado paradetectar diferenças muito pequenas na carga tumoral específico do órgão, em particular quando comparado com peso ou à base de medições de calibrador em lesões pequenas (não mostrado) e sensibilidade .Resolution irá variar com a linha celular e sistema de imagem. No presente caso, os implantes metastáticos tão pequenas como 400 um de diâmetro podem ser resolvidos e quantificado. Métodos alternativos, incluindo tomografia com contraste computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e tomografia por emissão de positrões (PET) têm sido descritas para a imagem latente longitudinal 14,15. Modalidades, incluindo imagens anatômicas e funcionais combinado também estão em desenvolvimento 16. Em relação a este método proposto para a quantificação da carga tumoral, deve-se notar que a determinação dos limiares de fluorescência [Passo 4.3.5.] Baseia-se na intensidade da fluorescência visto nas imagens de órgãos [Passo 4.3.2.] e é escolhido pelo usuário para incluir apenas as regiões mais fluorescentes Relative para o resto do órgão. Variando os valores limiar foram usadas na análise antes de determinar os valores de limiar final utilizados neste estudo. Uma vez determinado, esses mesmos limites foram utilizados para todos os órgãos analisados, de forma a assegurar a consistência na quantificação do que é considerado o tecido metastático pela análise visual inicial feito pelo pesquisador. A determinação desses limites é um passo crítico no processo e potencialmente poderiam variar de um projeto para o outro, conforme determinado pelo investigador individual. Neste caso, um grande limite inferior foi utilizado de modo a capturar apenas os mais elevados sinais de intensidade de fluorescência. Ao utilizar este mesmo limiar para cada órgão analisado, a análise e os resultados oferecem resultados quantitativos comparativa no contexto desta coorte de ratinhos. Enquanto este método é limitado na quantificação de valores absolutos de área de superfície do tumor, que permite aos investigadores comparar a capacidade de carga de tumor normalizada em relação ao mesmo entre umnd diferentes órgãos dentro coortes de ratos. Deve notar-se que esta abordagem inclui quantificação de tumores que não são visíveis a olho nu. O mecanismo metastático única de EOC resultado em carcinomatose intraperitoneal amplamente disseminada envolvendo múltiplos tecidos e órgãos, tornando a cirurgia cytoreductive ideal tecnicamente desafiador. Como citorredução completa correlaciona-se positivamente com a sobrevivência global, conclui-se que o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater a metástase intra-peritoneal é justificada. Avaliação da eficácia terapêutica, no entanto, é dependente da quantificação precisa da carga tumoral, incluindo a avaliação de metástases específica de órgão. Utilizando imagiologia óptica de células tumorais marcadas com RFP in situ corrigido para autofluorescência órgão, combinadas com cuidado imagiologia ex vivo de órgãos, temos desenvolvido uma abordagem para quantificar a carga tumoral específico do órgão intraperitoneal. Curiosamente, nossas análises mostramque os locais preferidos de metástases neste modelo, como definido pela área de carga / de superfície do tumor, são similares aos encontrados em mulheres com cancro do ovário (omento, ovário, intestino, mesentério) 2,4,5. Por isso, esta abordagem deve ter utilidade futura na avaliação de terapias experimentais desenhadas para combater a doença metastática.

Câncer epitelial de ovário (EOC) é a causa mais comum de morte por neoplasia ginecológica, com uma estimativa de 21,290 novos diagnósticos em os EUA em 2015 e uma estimativa de 14,180 mortes 1. A grande maioria (&gt; 75%) das mulheres são diagnosticadas com a doença de fase final (fase III ou IV), caracterizado por difuso metástases intra-peritoneal e mau prognóstico. A recorrência da doença na cavidade peritoneal na sequência da primeira linha de quimioterapia também é comum e representa uma das principais causas de mortalidade 2,3. EOC metastasizes por um único mecanismo envolvendo tanto extensão directa do tumor primário para órgãos peritoneais vizinhas, assim como pela dissociação ou derramamento de células da superfície do tumor primário, como células individuais ou agregados multicelulares. As células são vertidos para dentro da cavidade peritoneal, em que eles resistir apoptose induzida por descolamento 4. Acúmulo de ascite peritoneal é comum, como as células tumorais derramam bloquear a drenagem linfática peritoneal e tumors produzem fatores de crescimento que alteram a permeabilidade vascular. Uma porção de células tumorais vertente anexar à superfície de órgãos e estruturas peritoneais incluindo intestino, fígado, mesentério e omento, após o que ancorar e proliferam para produzir múltiplas lesões secundárias amplamente disseminadas 3,5. metástase hematogênica é incomum. Assim, a gestão clínica comumente consiste em cirurgia cytoreductive incluindo &quot;debulking óptima&quot;, definida como a ressecção de todo o tumor visível (não importa quão pequena). Citorredução completa está associada a um aumento significativo na sobrevivência global 6,7 e está associada com o desafio da identificação e da remoção de lesões &lt;0,5 cm. modelos animais pequenos têm demonstrado utilidade na pesquisa do câncer de ovário em melhorar o nosso entendimento da progressão da doença, bem como em identificação de biomarcadores de prognóstico e ensaio de novas quimioterapias ou abordagens de terapia de combinação. À medida que o primáriolocal de incidência de câncer de ovário e metástase é a cavidade peritoneal, modelos ortotópicos de EOC metástase envolvem a análise e caracterização da doença intraperitoneal. Embora tenha havido recentes melhorias na capacidade de células tumorais imagem, mesmo ao nível de uma única célula, ainda existem dificuldades significativas na quantificação da carga de tumor metastático de EOC. Estes desafios surgem devido ao número, tamanho e localização anatômica das lesões metastáticas. Além disso, existe uma necessidade para células de cancro da etiqueta para distingui-las das células hospedeiras normais. Estudos anteriores utilizaram protocolos de rotulagem baseadas em anticorpos ou a transfecção de células de tumor com 8,9 luciferase. A marcação directa fluorescente de células cancerosas foi relatada pela primeira vez por Chishima e colaboradores em 1997 10. Os marcadores fluorescentes não necessitam de adição de substrato exógeno e proporcionar especificidade de células tumorais requintado, proporcionando um meio mais eficaz para controlar metástases de cancro 11,12 </sup&gt;. Aqui nós descrevemos um método de imagem óptico para análise quantitativa de doença metastática utilizando um modelo de xenoenxerto ortotópico singênico composta de proteína fluorescente vermelha (RFP) tagged ID8 células de câncer de ovário murino 13 e camundongos C57 / Bl6 imuno-competente. Nós demonstramos um método novo para a quantificação da carga tumoral em relação combinar imagens in vivo e ex vivo com a remoção de tecido auto-fluorescência. Esta abordagem tem uma utilidade potencial em estudos destinados a avaliar o efeito do específica genética, epigenética ou micro-ambientais modificações e / ou modalidades de tratamento específico nas metástases de órgãos de cancro do ovário.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:117px;">10-014-CM</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Xtreme small animal imaging system</td>
			<td>Bruker Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Multispectral software</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lentiviral particles with Red fluorescent protein</td>
			<td>GenTarget, Inc.</td>
			<td>LVP023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin for cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td>
			<td>purchases from drugstore&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
			<td></td>
			<td>free download</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>&#160;RS 5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (Scissors)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS 5910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

O mecanismo metastático do câncer de ovário é caracterizada por metástase intra-peritoneal altamente difuso composto por numerosas lesões de tamanhos variados, incluindo múltiplas (&lt;2mm) pequenas lesões. Assim, a utilização de células tumorais marcadas com RFP (Figura 1) e imagiologia óptica fornece um método alternativo para a contagem manual e medição do tamanho da lesão. O desenvolvimento do peso do tumor ao longo do tempo pode ser determinada por pesagem semanal de ratos e medição da circunferência abdominal para medir potencial presença de ascite. In vivo imagiologia óptica proporciona uma abordagem complementar para avaliar a carga tumoral (Figura 2). O câncer de ovário metastasizes para vários sites na cavidade peritoneal e condutores moleculares de metástases site-specific são presentemente desconhecidos. Além disso a determinação da carga total de tumor, após o sacrifício cuidadosa dissecação pode ser realizado para avaliar e quantificar PA site-specifictterns de metástases. Assim, imageamento óptico de órgãos peritoneais in situ (Figura 3A, B), combinada com a avaliação ex vivo de órgãos individuais (Figura 3C, D) pode fornecer dados úteis sobre geral vs carga tumoral específico do órgão. Os exames apresentados na Figura 3 representam os resultados de digitalização das cavidades abdominal e órgãos individuais de ratos com vários graus de carga tumoral. Por exemplo, a Figura 3C mostra a carga de tumor mais no omento / pâncreas, ovários e mesentério de rato A. Quando comparado com os mesmos órgãos em B de ratinho, uma diferença significativa no sinal é visto (Figura 3D). A utilização do modelo de varrimento de órgãos (Figura 4) auxilia na identificação de carga tumoral específico do órgão. A observação da carga tumoral diferencial é confirmada quantitativamente tanto em termos de área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor (Tabela 1, Figura 5). <p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Os resultados mostrados nestas figuras e tabelas foram analisados ​​usando um intervalo de visualização mínimo e máximo de 0 a + 35353, de modo a evitar quaisquer sinais de falso-positivos e auto fluorescência emitida pelos tecidos. Os diferentes graus de sinal observado na Figura 2 e 3 ilustram a vasta gama de carga de tumor que podem ser visualizados e quantificados utilizando este método. Os dados da Tabela 1 ilustra este grande gama de aplicabilidade na quantificação tanto a área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor. Por exemplo, quando se olha para o omento / pâncreas de rato A comparada à de B de ratinho, a área de superfície do tumor normalizada é 26 vezes maior do que no rato Um rato B. Além disso, a grande gama de intensidade de sinal é também exemplificado no omento / pâncreas de ratos A e B; a densidade em bruto normalizada integrada de Rato A é 56 vezes maior do que a do rato de B. Estes resultados demonstram a eficácia dos Comparing a carga tumoral de vários indivíduos de teste, em relação à outra, em termos de área de superfície do tumor e a intensidade de sinal do tumor, utilizando-se este método rápido, que não requer mais análise histológica. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig1.jpg" /> Figura RFP expresso. (A) imagem 1. Células ID8 Murino do cancro do ovário Fase de células ID8. (B) imagem de fluorescência de células ID8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem Óptico ao vivo de C56 / BL6 rato com a carga tumoral intra-peritoneal. (A) creme depilatório foi usado para remover hai<html> r a partir da superfície ventral do rato antes da digitalização. (B) Diagrama mostrando linha média ventral inicial e incisões laterais. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3AC" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3AC.jpg" /> <img alt="Figura 3BD" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3BD.jpg" /> Figura 3. Endpoint Digitalização de Intra-peritoneal carga tumoral. (A, B) Os ratos são primeiro fotografada com os órgãos in situ (lado ventral para baixo) após a abertura da superfície ventral do mouse. (C, D) de imagens de órgãos individuais. Cada órgão é dissecado, carga tumoral Visual gravada, e colocado no molde de varrimento para a análise de órgãos.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig4.jpg" /> Figura 4. Modelo de Digitalização Organ. órgãos dissecados são colocados sobre o modelo de varrimento órgão manter a identificação posicionai dos órgãos individuais durante a digitalização. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig5.jpg" /> .. Foram analisados ​​Figura 5. Normalizada Dados Quantitativos para o Omento / Pâncreas, ovários e Mesentery dados, como descrito no protocolo e como mostra a Tabela 1 Rato Um refere-se ao rato digitalizada em 3A painel; rato B refere-se ao rato digitalizada no 3B do painel. (A) área de tumor normalizada. A análise da fluorescência do sinal quantificação destes três órgãos foi realizada e quantificada em termos de um ráciode área de superfície do tumor para a área de superfície do órgão inteiro para ambos os ratos. (B) Normalizado densidade integrada cru. Fluorescência análise quantificação do sinal destes três órgãos foi realizada e quantificada em termos de um rácio de densidade integrada em bruto para a área de superfície do órgão inteiro para ambos os ratinhos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="513"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Omento / Pâncreas </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Área Tumor normalizada </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalizada Densidade Raw Integrado </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> rato A </td><td style="width:129px;"> 0,5346 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 5.11E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> B de ratinho </td><td style="width:129px;"> 0,0203 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 8.97E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> ovários </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Área Tumor normalizada </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalizada Densidade Raw Integrado </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> rato A </td><td style="width:129px;"></td><td colspan="2" style="width:320px;"> 4.79E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> B de ratinho </td><td style="width:129px;"> 0,0123 </td><td colpalmo = &quot;2&quot; style = &quot;width: 320px;&quot;&gt; 5.62E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Mesentério </td></tr><tr height="101"><td height="101" style="height:101px;width:64px;"></td><td colspan="2" style="width:193px;"> Área Tumor normalizada </td><td style="width:256px;"> Normalizada Densidade Raw Integrado </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> rato A </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,2951 </td><td style="width:256px;"> 2.22E + 07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> B de ratinho </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,0098 </td><td style="width:256px;"> 4.15E + 05 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tumor Normalizada Area e normalizada RawValores de densidade integradas no omento / Pâncreas, ovários e Mesentery de ambos Rato A e B. mouse Pós dissecção e digitalização, cada órgão foi segmentada e sua fluorescência quantificada para determinar a proporção da área do tumor para a área de superfície total do órgão e as intensidades da fluorescência para essas áreas tumorais. Omento / pâncreas, ovários e mesentério foram selecionados como eles tinham os sinais de fluorescência mais fortes dentro de ambos os grupos de controlo positivos e negativos.

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Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K visualizações.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Ensaio Metástase Experimental

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medicina

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de Embrião aviária

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modelos de metástase óssea

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Modelo murino de imagem não invasivo para detectar e monitorar o cancro do ovário Recorrência

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...