This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

כל המחקרים vivo ב אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים נוטרדאם ועדת שימוש והשתמשו עכברות C57 / BL6J. 1. תרבית תאים Murine סרטן השחלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מדיום תרבית תאי סרטן שחלות murine ID8 כדלקמן: 1 ליטר של בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) השלים עם 4% עובריים שור סרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / אינסולין מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin ו 5 ng / ml נתרן סלניט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאים סרטניים בשחלות murine ID8 13 לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) באמצעות חלקיקי lentiviral רכש מסחרי מבטאי RFP ועם סמן בחירה (blasticidin גן). שים לב חלבון פלואורסצנטי ירוק ניתן להשתמש, אבל מספק אותות הקרינה חלשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמוך לפני התמרה, תרבות תאים 50 - 70% מפגש ולהוסיף בינוני טרי (ללא פניצילין / סטרפטומיצין) הכולל 1 מיליליטר polybrene (5 מיקרוגרם / מיליליטר סופיריכוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה RFP-lentivirus (20 μl) dropwise לתוך צלחת לדגור על 37 מעלות צלסיוס למשך 72 שעות. הסר בינוני דגירה עם מדיום חדש למשך 24 שעות. להתחיל לבחור תאים transduced ידי הוספת blasticidin עד בינוני התרבות (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ויעקוב אחרי התאים האדומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (figure1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים מתויג RFP במדיום ID8 ידי זריעה כ 10 6 תאים לתוך צלחת בתרבית רקמה באופן חזותי באמצעות ימי מיקרוסקופ אור עד monolayer התא הוא ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות, למסוק את התאים באמצעות טריפסין (0.25%, 3 דקות) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור 37 מעלות צלסיוס עד שהתאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין עם 6 מ&quot;ל של מדיום תרבות ID8 המכילה סרום. פיפטה מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת, ולאחר מכן להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 1200 סל&quot;ד במשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את המדיום באמצעות GLפיפטה תחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם בופר פוספט (PBS) על ידי resuspending בעדינות 6 מ&quot;ל PBS חם צנטריפוגה כמו 1.5 לעיל. Re- להשעות ב PBS לריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. שמור את התאים חמים (37 מעלות צלסיוס) עד הזרקה. </li></ol> 2. תוך הצפק הזרקה של תאים ID8 בתחום ההדמיה vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק כל עכבר עם 2 מ&quot;ל של הפתרון ID8-PBS חם עבור סכום כולל של 10 מיליון תאים באמצעות הזרקה תוך הצפק (IP). אפשר תאים סרטניים לגדול in vivo במשך כ -10 שבועות עם הדמיה חייה מדי שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההזרקה ובכל שבוע לאחר מכן, לשקול את העכברים ואז להרדים כל העכבר באמצעות isofluorane (קצב הזרימה של 2.5% ב 0.5 L / min O 2 זרימה). הערה: עכברים נשקלו, ולא כמדד כמותי של נטל הגידול, אלא מדד כללי יותר של התקדמות פיזית עכבר הפרט לאורך כל תקופת המחקר. עכברים לשקולts הושוו עם ערכים למשקל הקודם שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הנחת בתא isofluorane. לשמור על הרדמה קבועה בזמן סריקה על ידי מיצוב ראש העכבר בחרוט האף לחשיפה isofluorane קצב זרימה 2.5% לאורך כל ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קרם מקריח כדי להסיר את השיער על הגוף והבטן של כל עכבר, כמו השיער השחור יגרום הנחתה של אות הקרינה. עכברים שטופים במים חמים לאחר היישום של קרם המקריח מיובש עם מגבות נייר RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מורדם, לסרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת דימות אופטי חיה קטנה. סרוק את כל העכברים במדגם בכל נקודת זמן. השתמש בפרוטוקול השני בשלב הבא (איור 2 א): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 1, להתבונן שכותרתו fluorescently (RFP) תאים סרטניים, לבצע רכישה multispectral לגבות סך של 5 תמונות באמצעות מסננים עירור של 440 ננומטר, 460 ננומטר, 480 ננומטר, 520 ננומטר ו -540 ננומטר, ואת מסנן פליטה של ​​600 ננומטר. השתמש פרמטרי רכישת הבאים: חשיפה רמה 15 שניות, 2 x 2 binning, FOV של 160 מ&quot;מ, f stop של 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 2, להתבונן על חית כולה, לרכוש תמונת החזרה באמצעות מסנן עירור פתוח (אור לבן), מסנן פליטה פתוח, חשיפה סטנדרטית של 0.2 שניות עם binning 2 x 2 ו FOV של 16 סנטימטר. שים לב: בפעם הדמיה בפועל הוא ~ 1 דק &#39;. </li></ol></li></ol> 3. עכבר Dissection ו Image Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדמיה לחיות מראת הנוכחות של הצטברות תערוכה תוך הצפק מחלה או חיות נרחבות של מיימת (כפי שמעידים נפיחות בטנית), פסד או רווח של משקל גוף יותר מ -20%, עייפות או סימנים אחרים של מצוקה, להרדים כל עכבר באמצעות CO 2 הרדמה ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור anteriorly לאורך קו האמצע הגחון של העכבר, באמצעות dissectio מחודדn מספרי, מהחלק העליון של הירכיים לתחתיות כלוב הצלעות. קח בזהירות רבה כדי לחתוך רק את שכבת העור (איור 2Bi). בעדינות להפריד את העור מרקמת הצפק, להיות בטוח שלא לנקב את קיר הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה מחודדים, לחתוך רוחבי הוא בחלק התחתון של כלוב הצלעות והחלק העליון של הירכיים ליצור שני קפלי העור (איור 2 ב II, III). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל עכבר בצד הגחון שלו (חלל הצפק פונה כלפי מטה) עם שולי העור ופתח ולסרוק כל עכבר עם מוסדותיה באתרו באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 א &#39;, ב&#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר-2.4.2 2.4.1.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ביתור את העכבר על ידי לחילוץ איברים הצפק בודדים כולל כבד, omentum / לבלב, קיבה, סרעפת, מעי דק, מעי גס, שמאלה הצפק תקינים, שחלות, kidneys, לפדר ואת כרית השומן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב, למנות, ולהקליט גידולים גלויים על כל איבר. השתמש קליפר למדוד את הקוטר של כל גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעד גידולים פחות מ -2 מ&quot;מ קוטר קטנים, בין 2 ו -5 מ&quot;מ כבינוני ו יותר מ -5 מ&quot;מימ כמו גדולים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את האיברים על תבנית סריקת איבר (איור 4) שמזהה במיקום קבוע מראש עבור כל איבר. השתמש PBS לשמור על האיברים לחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק כל גיליון של איברים באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 ג, ד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר בשלב 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סריקה, איברי המקום בפורמלין 10% כדי לאפשר עיבוד עוקב עבור היסטולוגיה. </li></ol> כימות 4. נטל הגידול ב התמונות דואר קרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפחית את כמות קרינה אוטומטית בכל סריקת multispectral, ראשון unmix את הקבצים באמצעות תוכנה זמינה עם מערכת הדמית חיה הקטנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תחילה RFP: בקובץ ספקטרלי Vivo, ואחריו Autofluor: בתיק האדום Vivo בחלון תמונות צרוף ובחר Unmix. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הקבצים .bip כמו 16 ביט .tiff (ללא שינוי) הפורמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ImageJ (לשעבר vivo איברים ואז גוף העכבר המלא עם איברים באתרו). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את קבצי .tiff 16 ביט של קבצי תבנית סריקת איבר ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך 35,353 ולאחר מכן, תחתשולחנות תמונה&gt; בדיקה, בחרו רד הוט. הערה: מודלים של בעלי חיים שונים ידרשו רמות בהירות שונות, אך חשוב לשמור על הבהירות העקבית לאורך מחקר נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כלי הבחירה Freehand, לצייר באזור צורה חופשית של מבחר עניין (ROI) סביב כל איבר ולהשתמש בכלי מדידה (CTRL + M) כדי לחשב את שטח הפנים של כל איבר; להקליט את שטח הפנים של כל איבר בגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ROI נמשך סביב כל איבר, קליק ימני בתוך ROI ובחר שכפלו לכלול רק האיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד אני מסתכל על האיבר היחיד, תחת תמונה&gt; התאם&gt; סף, לבחור כדי לקבוע את הסף של התמונה לרמת סף תחתונה של + 1200 רמת סף עליונה של + 1700 בחר only האזורים הכי בהיר קורנים ולבדוק כדי לבחור רקע כהה; ובחר אישור. הערה: התמונות עשויות לדרוש מניפולציה ידנית של מחווני סף ImageJ כך שהאזורים הבהירים בעבר נבחרו לשלב ניתוח, כפי שפורטה לעיל. מודלי מחלה שונים ידרשו מגבלות סף שונות, אך חשוב לשמור על רמות הסף אחידות בכל מחקר נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לנתח&gt; לנתח חלקיקים, לשנות את גודל (פיקסלים ^ 2) עד 10-אינפיניטי, לבחור התכנית: מתאר, לבדוק כדי לבחור רק &quot;הצג תוצאות&quot; ולחץ על אישור כדי למדוד גם את תחומי וצפיפות משולבת הגלם של אזורים בהירים אלה, גידולים ייחשבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הערכים של שטח פנים ואת הצפיפות המשולבת גלם של כל מבחר גידול המוצגים <sטרונג&gt; שולחן תוצאות באותו גיליון אלקטרוני המכיל את שטח פנים איברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לנתח&gt; כלים&gt; בר כיול, להוסיף סרגל מידת כיול לתמונות של האיברים. הערה: בדוגמה זו, זה נעשה על ידי שינוי מיקום עליון מימין, צבע המילוי השחור, צבע לייבל ווייט, מספר התוויות עד 5, עשרוני מקומות 0, גודל גופן 12 ואת זום פקטור ל -4.0 ולאפשר טקסט מודגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת קובץ&gt; שמירה בשם ..., שמור את מונטאז בתור .TIFF וכן JPEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את הקובץ בפורמט JPEG של האברים ולאחר מכן, תחת הוספה &lt;תיבת טקסט </strong&gt;, להוסיף תוויות איבר ידי יצירת תיבת טקסט מתחת לכל אחת משלוש שורות של איברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את כל 16 קבצי .tiff קצת סריקות הגוף המלאות ב ImageJ לפי סדר מספר עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך + 35,353 ולאחר מכן, תחת &#39;תמונה&#39;&gt; שולחנות בדיקה, בחרו רד הוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת קובץ&gt; שמירה בשם ..., שמור את מונטאז &#39;בתור. Tiff וכן JPEG. </li></ol></li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את אזורי בחירת גידול צפיפויות משולבות גלם, בהתאמה, עבור כל איבר של כל עכבר ולהקליט את אזור גידול איבר הכולל עבור כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל באזור הקליט integrat גלםערכי צפיפות ed עבור הגודל של כל איבר על ידי חלוקת שטח הגידול הכולל וערכי צפיפות משולבים הכוללים גלם על ידי שטח פן איבר המתאים (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את הממוצע של שני אזורי משטח גידול המנורמלים ואת ערכי צפיפות המנורמלים גלם המשולב (איור 5 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת ערכים ממוצעים אלה לאלה שהושגו על ידי חזותית לספור את הגידולים שהיו גלויים לעין בלתי מזוינת במהלך הבדיקה של כל איבר עבור גרורות. </li></ol>

<ol>
	<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+peritoneal+metastases+from+ovarian+cancer.">Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).</li><li>Barbolina, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis.</a> Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).</li><li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer+experimental+models.">Epithelial ovarian cancer experimental models.</a> Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).</li><li>Harter, P., duBois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surgery+in+ovarian+cancer+with+special+emphasis+on+cytoreductive+surgery+for+recurrence.">The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence.</a> Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).</li><li>Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoreductive+surgery+for+recurrent+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis.</a> Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+metastatic+cancer+with+fluorescent+proteins.">In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).</li><li>Sweeney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+kinetics+of+tumor-cell+clearance+in+living+animals.">Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).</li><li>Chishima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+micrometastasis+visualized+in+live+tissue+by+green+fluorescent+protein+expression.">Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression.</a> Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).</li><li>Bouvet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo.">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li><li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer.">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li><li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer.">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li><li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

מאמר זה הוא חלק של גיליון מיוחד בנושא מולטימודליות טרום קליני הדמיה, בחסות Bruker Biospin.

בניגוד למחקרים באמצעות תאי סרטן שחלות אדם חייב להתנהל בעכברי immunocompromised, הפרוטוקול המתואר לעיל מנצל מערכת חיסון תקין עכברי C57 / BL6 ותאי סרטן שחלות murine syngeneic. אמנם זה מאפשר הערכה של פוטנציאל התפקיד של מחלחל חיסוני התקדמות גידול וגרור, הנוכחות של שיער כהה על פני שטח הבטן הופכת הדמיה פחות רגישה. שימוש מקריח להסיר שיער לפני ההדמיה משפרת רכישת תמונה, אבל היא גוזלת זמן, במיוחד עבור ניסויים הדורשים הדמיה אורכת. &#39;עירום&#39; עכברים חסרי שיער ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ואינו דורשים הסרת שיער מקריחה מבוסס. יתר על כן, עכברים בעירום אין מערכת חיסון מתפקדת, כך יכולים גם להיות מנוצל כדי להעריך את הצמיחה של תאים סרטניים אנושיים השחלות בניסויים שבה התרומה של המערכת החיסונית היא לא תחת ניתוח. ראוי גם לציין כי עומק intraperגידולי itoneal גם מציגים אתגרים טכניים, כמו דימות פלואורסצנטי אופטית לא בדרך כלל לגילוי גידולים בעומקים של יותר מ -5 מ&quot;מ. יתר על כן, השכיחות של נוזל מיימת ואת הנוכחות של תאים סרטניים ascitic ליצור סיבוכים נוספים. ראינו השתנות העכבר אל העכבר משמעותי להיווצרות של נוזל מיימת, אפילו כאשר הוא מוזרק עם הקו הסלולרי אותו. כך בנוכחות מיימת, שיטה זו עדיפה לניתוח נקודת סיום של ניטל גידול איבר ספציפי ולא הדמיה אורכת שיגרתית של התקדמות. במקרה הנוכחי, שינויים דרמטיים נטל הגידול צוינו בין עכברים למשל, כאלה שליגיונותיו של ארבעה עד חמישה עכברים בדרך כלל יהיה מספיק לניתוח סטטיסטי. במקרה של הבדלים דרמטיים פחות ניטל גידול, שנבדקים בניסוי נוספים יהיו צורך להגיע כוח סטטיסטי. בעוד הדוגמאות המוצגות במסמך זה שונה באופן משמעותי נפח הגידול, דימות פלואורסצנטי אופטי ניתן להשתמש כדילזהות הבדלים הרבה יותר קטנים נטל גידול איבר ספציפי, במיוחד כשמשווה משקולות או מדידות מבוססות קליפר על נגעים קטנים (לא מוצגות) .Resolution והרגישות תשתנה בהתאם לקו תא ומערכת הדמיה. במקרה הנוכחי, שתלים גרורתי קטנים כמו 400 מיקרומטר בקוטר ניתן לפתור לכמת. שיטות חלופיות כוללים טומוגרפיה ממוחשבת משופרת ניגודיות (CT), תהודה מגנטית (MR) הדמיה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) תוארו עבור הדמיה אורכת 14,15. Modalities כולל הדמיה אנטומית ופונקציונלית משולבת גם בפיתוח 16. בשנת לגבי השיטה המוצעת זה כימות של נטל הגידול, יש לציין כי קביעת ספי הקרינה [שלב 4.3.5.] מבוסס על עוצמת הקרינה לראות את התמונות איבר [שלב 4.3.2.] והוא נבחר על ידי המשתמש לכלול רק את האזורים פלורסנט ביותר relative לשאר האיבר. ערכי סף שונים שימשו בניתוח לפני קביעת ערכי סף הסופי נעשה שימוש במחקר זה. לאחר שנקבע, ספי אותם שימשו כל איבר נותחו על מנת להבטיח עקביות כימות של מה נחשב רקמת גרורתי ידי ניתוח ויזואלי הראשוני נעשה על ידי החוקר. קביעת ערכי סף אלו הוא שלב קריטי בהליך ועלול להשתנות מפרויקט אחד למשנהו כפי שנקבע על ידי החוקר הפרט. במקרה זה, רף נמוך יותר גדול שימש כדי ללכוד רק את אותות הקרינה בעוצמה הגבוהה ביותר. באמצעות סף אותו עבור כל איבר המנותח, ניתוח התוצאות להציע תוצאות כמותיות השוואתיות בהקשר של קבוצה זו של עכברים. למרות ששיטה זו היא מוגבלת כימות של הערכים המוחלטים של שטח הפנים הגידול, זה מאפשר לחוקרים את היכולת להשוות נטל הגידול מנורמל ביחס בין א אותוnd איברים שונים בתוך קבוצות של עכברים. יצוין כי גישה זו כוללת כימות של גידולים שאינם גלויים לעין בלתי מזוינת. המנגנון גרורתי הייחודי של תוצאות EOC ב carcinomatosis intraperitoneal לתפוצה רחבה המעורבות מספר רקמות ואיברים, טיוח ניתוח cytoreductive אופטימלי מאתגרת מבחינה טכנית. כפי cytoreduction המלא בקורלציה חיובית עם הישרדות כוללת, המסקנה היא כי פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להילחם גרורות תוך הצפק היא מוצדקת. הערכת היעילות הטיפולית, לעומת זאת, היא תלויה quantitation מדויק של נטל הגידול, כולל הערכה של גרורות איבר ספציפי. באמצעות דימות אופטי של תאים סרטניים מתויג RFP באתרו תיקן autofluorescence איבר, בשילוב עם הדמיה איבר vivo לשעבר זהיר, פיתחנו גישה לכמת נטל הגידול איבר ספציפי intraperitoneal. מעניין לציין, כי הניתוחים שלנו מראיםהאתרים המועדפים של גרורות במודל זה, כפי שהוגדר על ידי אזור נטל הגידול / משטח, הם דומים לאלה שנמצאו אצל נשים עם סרטן שחלות (omentum, השחלה, המעי, לפדר) 2,4,5. לכן גישה זו צריכה להיות כלי בעתיד בהערכה רפויה הניסיונות שנועד למקד מחלה גרורתית.

סרטן שחלות אפיתל (EOC) הוא הגורם השכיח ביותר למוות ממאיר גינקולוגיות, עם אבחנות חדשות 21,290 המשוער בארה&quot;ב בשנת 2015 ו 1 14,180 מקרי מוות. הרוב המכריע (&gt; 75%) של נשים מאובחנים עם מחלה בשלב מאוחר (שלב III או IV) מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרות פרוגנוזה גרועה. ישנות מחל חלל הצפק בעקבות כימותרפיה כקו הראשון הן גם נפוצות ומייצג אחד גורמים עיקריים של 2,3 תמותה. EOC גרורה ידי מנגנון ייחודי המעורבים הוא המשך ישיר מן הגידול הראשוני לאיברים הצפק שכנות כמו גם על ידי ניתוק או שפיכת התאים מפני שטח גידול הראשוני כמו תאים בודדים או אגרגטים רבים תאיים. תאים הם לשפוך לתוך חלל הצפק, שבה הם להתנגד הנגרמת ניתוק אפופטוזיס 4. הצטברות של מיימת הצפק שכיחה, כפי תאים סרטניים לשפוך לחסום ניקוז לימפטי הצפק tumors לייצר גורמי גדילה אשר משנים חדירות כלי הדם. חלק של תאים סרטניים לשפוך לצרף אל פני השטח של איברים הצפק ומבנים כולל המעי, הכבד, omentum ו לפדר, ואז הם לעגן מתרבים כדי לייצר נגעים משניים מרובים לתפוצה רחבה 3,5. גרורות Hematogenous הן נדירות. לפיכך, ניהול קליני מורכב בדרך של ניתוח cytoreductive כולל &quot;debulking אופטימלי&quot;, המוגדר כריתה של כל הגידול גלוי (לא משנה כמה קטן). Cytoreduction השלם קשור לעלייה משמעותית בהישרדות הכוללת 6,7 והיא קשורה עם האתגר של זיהוי והסרה של נגעים &lt;0.5 סנטימטר. במודלים של בעלי חיים קטנים הוכיחו שירות במחקר סרטן השחלות בשיפור ההבנה שלנו של התקדמות מחלה וכן יש להציג תעודת מזהה של סמנים פרוגנוסטיים ובדיקה של תרופות רומן או גישות טיפול משולב. ככל העיקריהאתר של שכיחות סרטן השחלות גרורות הוא חלל הצפק, מודלים orthotopic של גרורות EOC כרוך בניתוח ואפיון של המחלה intraperitoneal. למרות חלו שיפורים אחרונים ביכולת תאים סרטני תמונה, אפילו ברמה של התא הבודד, עדיין קיימים קשיים משמעותיים בכימות ניטל גידול גרורתי של EOC. אתגרים אלה נובעים בשל מספר, גודל ומיקום אנטומי של גרורות. יתר על כן קיים צורך לתאי סרטן התווית כדי להבדילם תאי מארחים נורמלים. מחקרים קודמים מנוצלים פרוטוקולי תיוג מבוסס נוגדן או transfection של תאים סרטניים עם 8,9 בלוציפראז. תיוג פלורסנט ישיר של תאים סרטניים דווח לראשונה על ידי Chishima ועמיתים לעבודה בשנת 1997 10. תוויות פלורסנט אינן דורשות תוספת של מצע אקסוגניים ולספק סגולי תאים סרטניים מעודן, מתן אמצעים יעילים יותר כדי לעקוב אחר גרורות סרטן 11,12 </sup&gt;. בזאת אנו מתארים שיטת הדמיה אופטית ניתוח כמותי של מחלה גרורתית באמצעות מודל xenograft orthotopic syngeneic המורכב חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) -tagged בתאי סרטן שחלות murine ID8 13 ועכברים חיסוני המוסמכות C57 / BL6. אנו מדגימים שיטה חדשה של כימות נטל הגידול היחסי שילוב in vivo לשעבר vivo הדמיה עם הסרת פלואורסצנציה אוטומטי רקמות. לגישה הזאת יש פוטנציאל השירות במחקרים שנועדו להעריך את ההשפעה של שינויים ספציפיים גנטיים, אפיגנטיים או מיקרו-סביבתיים ו / או שיטות טיפול על גרורות איבר ספציפי של סרטן השחלות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:117px;">10-014-CM</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Xtreme small animal imaging system</td>
			<td>Bruker Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Multispectral software</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lentiviral particles with Red fluorescent protein</td>
			<td>GenTarget, Inc.</td>
			<td>LVP023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin for cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td>
			<td>purchases from drugstore&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
			<td></td>
			<td>free download</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>&#160;RS 5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (Scissors)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS 5910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

המנגנון גרורתי של סרטן השחלות מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרים מאוד מורכבות נגעים רבים בגדלים שונים, כולל מספר קטן (&lt;2 מ&quot;מ) נגעים. לפיכך, השימוש של תאים סרטניים שכותרתו RFP (איור 1) ו דימות אופטי מספק שיטה חלופית כדי ספירה ידנית ומדידה של גודל הנגע. התפתחות נטל הגידול לאורך זמן ניתן לקבוע על ידי שקילה שבועית של עכברים ומדידה של ההקף הבטן כדי לאמוד הימצאות אפשרית של מיימת. דימות אופטי בשנת vivo מספק גישה משלימה להעריך נטל הגידול (איור 2). סרטן השחלות גרור לאתרים מרובים החלל הצפק ונהגים מולקולריים של גרורות באתר ספציפי כרגע לא ידועים. בנוסף קביעת ניטל גידול כולל, דיסקציה הזהירה הקרב הבא ניתן לבצע כדי להעריך ולכמת pa אתר ספציפי<html> tterns של גרורות. לפיכך, דימות אופטי של איברים הצפק באתרם (איור 3 א &#39;, ב&#39;) בשילוב עם הערכה vivo לשעבר של איברים בודדים (איור 3 ג, ד) יכול לספק מידע שימושי על הכולל לעומת נטל הגידול איבר ספציפי. הסריקות מוצגות באיור 3 מייצגות את תוצאות סריקת חללי הבטן ואיברי פרט של עכברים עם בדרגות שונות של ניטל גידול. לדוגמה, איור 3 ג מציג את נטל הגידול ביותר omentum / הלבלב, השחלות לפדר של א מאוס כשמשווים לאיברים אותם עכבר B, הבדל משמעותי האות נתפסת (איור 3D). השימוש בתבנית סריקת איבר (איור 4) מסייע זיהוי של ניטל גידול איבר ספציפי. תצפית של נטל הגידול ההפרש הוא אישר הן כמותית מבחינת שטח הפנים הגידול ואת עוצמת האות הגידול (טבלה 1, איור 5). ss = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; התוצאות מוצגות דמויים אלה והשולחן נותחו באמצעות תצוגת מינימום ומקסימום בטווח שבין 0 ל + 35,353 כדי למנוע כל אותות חיוביים שגויים הקרינה אוטומטית ניתנה הנחה על ידי הרקמות. התארים המשתנים של אות שניתן לראות באיור 2 ו -3 להמחיש את המגוון הגדול של ניטל גידול כי ניתן הדמיה לכמת באמצעות שיטה זו. הנתונים בטבלה 1 מדגימים מגוון רחב זה של תחולה בכימות היא מבחינת שטח ואת עוצמת אות משטח גידול של הגידול. לדוגמא, כאשר מסתכלים על omentum / לבלב של עכבר בהשוואה לזו של העכבר B, שטח פן גידול המנורמל הוא 26 פעמים יותר מאשר עכבר העכבר ב יתר על כן, המגוון הרחב של עוצמת אות גם מודגם ב omentum / בלבלב של עכברים ו- B; הצפיפות המשולבת הגלם המנורמלת של עכבר גדולה 56 פעמים מזה של העכבר B. תוצאות אלו מראות את תוקפו של comparing בנטל גידול של בדיקה כמה נושאים ביחס אחד לשני, הן מבחינת שטח הפנים הגידול ואת עוצמת האות גידול, באמצעות שיטה מהירה זו שאינה דורשת ניתוח היסטולוגית נוספת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig1.jpg" /> איור 1. ID8 Murine השחלות תאים סרטניים אקספרס RFP. (א) תמונת שלב של תאי ID8. (ב) תמונה פלואורסצנטי של תאי ID8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig2.jpg" /> איור 2. דימות אופטי חיה של C56 / BL6 עכבר עם נטל הגידול תוך הצפק. (א) קרם מקריח שימש להסיר hai<html> r מפני שטח הגחון של העכבר לפני הסריקה. (ב) תרשים המציג קו אמצע גחון ראשוני חתכים לרוחב. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3AC" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3AC.jpg" /> <img alt="3BD איור" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3BD.jpg" /> איור 3. Endpoint סריקה של תוך הצפק גידול ברדן. (A, B) עכברים הם צילמו הראשון עם איברים באתרו (בצד הגחון למטה) לאחר פתיחת משטח הגחון של העכבר. (C, D) הדמיה של איברים בודדים. כל איבר הוא גזור, ניטל גידול חזותי מוקלט, והניח על תבנית סריקת איבר לניתוח.Target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig4.jpg" /> איור 4. תבנית סריקת איברים. איברים גזורים מונחים על תבנית סריקת האיבר לשמור זיהוי מיקומית של איברים בודדים במהלך סריקה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig5.jpg" /> .. איור 5. מידע כמותי מנורמל עבור omentum / לבלב, שחלות לפדר הנתונים נותחו כמתואר בפרוטוקול וכפי שניתן לראות בטבלה 1 עכבר מתייחס העכבר שנסרק 3A לוח; עכבר B מתייחס העכבר שנסרק 3B לוח. (א) אזור הגידול מנורמל. ניתוח וכימות אותות הקרינה של שלושה גופים אלה נערך לכמת במונחים של יחסשל שטח פן גידול שטח פן איבר שלמים עבור שני העכברים. (ב) משולבת בצפיפות גלם מנורמלת. ניתוח וכימות אותות הקרינה של שלושה גופים אלה נערך לכמת במונחים של היחס בין צפיפות משולב גלם לאזור איבר משטח שלם עבור שני עכברים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="513" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Omentum / לבלב </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> אזור גידול מנורמל </td><td colspan="2" style="width:320px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td style="width:129px;"> .5346 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 5.11E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> עכבר B </td><td style="width:129px;"> .0203 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 8.97E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> שחלות </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> אזור גידול מנורמל </td><td colspan="2" style="width:320px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td style="width:129px;"></td><td colspan="2" style="width:320px;"> 4.79E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> עכבר B </td><td style="width:129px;"> .0123 </td><td colתוחלת = &quot;2&quot; style = &quot;width: 320px;&quot;&gt; 5.62E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> לפדר </td></tr><tr height="101"><td height="101" style="height:101px;width:64px;"></td><td colspan="2" style="width:193px;"> אזור גידול מנורמל </td><td style="width:256px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td colspan="2" style="width:193px;"> .2951 </td><td style="width:256px;"> 2.22E + 07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר B </td><td colspan="2" style="width:193px;"> .0098 </td><td style="width:256px;"> 4.15E + 05 </td></tr></tbody></table> אזור גידול בטבלה 1. מנורמל מנורמל גלםערכי צפיפות משולבים ב- omentum / הלבלב, שחל לפדר של שניהם עכבר ועכבר ב הודעה לנתיחה וסריקה, כל איבר היה מפולחים הקרינה שלה לכמת כדי לקבוע את שיעור גידול באזור שטח פן איבר הכולל ואת העוצמות של קרינה באזורי גידול אלה. Omentum / הלבלב, השחלות לפדר נבחרו כפי שעשו אותות הקרינה החזקה בתוך שתי קבוצות הביקורת חיוביות ושליליות.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Video: Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

מודלים של גרורות עצם

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...