This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

Alle in - vivo - Studien wurden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und verwendet weiblichen C57 / BL6J Mäuse zugelassen. 1. Murine Ovarian Cancer Cell Culture <ol><li> Machen das ID8 murine Eierstockkrebszellkulturmedium wie folgt: 1 L von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 4% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin und 5 ng / ml Natriumselenit. </li><li> Unter Verwendung von kommerziell beschafft lentivirale Partikel exprimieren , RFP und einen Selektionsmarker (Blasticidin - Gen) transduzieren ID8 murine Ovarkrebszellen 13 bis rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Beachten Sie, dass grün fluoreszierendes Protein verwendet werden kann, bietet aber eine schwächere Fluoreszenzsignal. <ol><li> Unmittelbar vor der Transduktion, Kulturzellen zu 50-70% Konfluenz und fügen Sie frisches Medium (ohne Penicillin / Streptomycin), die 1 ml Polybren enthält (5 ug / ml finalKonzentration). </li><li> Gently Pipette RFP-Lentivirus (20 ul) tropfenweise in die Schale und für 72 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Entfernen Sie Medium und Inkubation mit frischem Medium für 24 Stunden. Beginnen Selektion von transduzierten Zellen durch Blasticidin zum Kulturmedium Zugabe von (5 &amp; mgr; g / ml) und Monitor für rote Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1 ). </li></ol></li><li> Kultur die RFP-markierten Zellen in ID8 Medium um etwa 10 6 Zellen in eine Gewebekulturschale Säen und Visualisierung täglich mit einem Lichtmikroskop , bis die Zellschicht konfluent ist. </li><li> Wenn konfluent, ernten die Zellen unter Verwendung von Trypsin (0,25%, 3 min) und zurück den Kolben an die C - Inkubator 37 o , bis die Zellen abgelöst werden. </li><li> Neutralisieren des Trypsins mit 6 ml ID8 Kulturmedium, das Serum. Pipette nach oben und unten gegen den Boden der Schale, dann Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 1200 UpM für 2 Minuten absaugen dann das Medium mit einem glass Pipette. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Saline (PBS), indem Sie vorsichtig in 6 ml warmem PBS Resuspendieren und Zentrifugieren wie in 1.5 oben. In PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren. Halten Zellen warm (37 ° C) bis zur Injektion. </li></ol> 2. intraperitoneale Injektion von ID8 Zellen und in - vivo - Bildgebung <ol><li> Injizieren jeder Maus mit 2 ml des warmen ID8-PBS-Lösung für insgesamt 10 Millionen Zellen durch intraperitoneale (ip) Injektion. Lassen Tumorzellen für ca. 10 Wochen mit wöchentlichen Live - Bildgebung in vivo zu wachsen. </li><li> Unmittelbar nach der Injektion und jede Woche danach die Mäuse wiegen und dann betäuben jede Maus Isofluran (2,5% Durchfluss in 0,5 l / min O 2 Flow) verwendet wird . Anmerkung: Die Mäuse wurden gewogen, nicht als ein quantitatives Maß der Tumorlast, sondern eine allgemeinere Maß der einzelnen Maus physikalischen Progression während der Studie. Mäuse wiegents wurden mit ihrem eigenen früheren Gewichtswerten verglichen. <ol><li> Anesthetize Mäuse durch in einer Isofluran Kammer platzieren. Pflegen konstante Anästhesie während des Scannens durch die Positionierung der Maus den Kopf in den Nasenkegel für die Belichtung mit 2,5% Flussrate Isofluran während des gesamten Verfahrens. </li></ol></li><li> Verwenden Sie Enthaarungscreme die Haare auf dem Oberkörper und Bauch jeder Maus zu entfernen, da das schwarze Haar Abschwächung des Fluoreszenzsignals verursacht. Mäuse werden mit warmem Wasser nach dem Aufbringen der Enthaarungscreme gewaschen und mit RT Papiertüchern getaucht. </li><li> Während anästhesiert, scannen Sie den gesamten Körper jeder Maus ein kleines Tier optische Abbildungssystem verwendet wird. Scannen Sie alle Mäuse in einer Kohorte zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgenden zwei Schritt - Protokoll (2A): <ol><li> fluoreszenzmarkierten (RFP) Tumorzellen in Schritt 1 zu beobachten, führen Multispektraldaten Erwerb insgesamt 5 Bilder Filter mit Anregung von 440 nm zu sammeln, 460 nm, 480 nm, 520 nm und 540 nm und einem Emissionsfilter von 600 nm. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Standardbelichtung von 15 Sekunden, 2 x 2 - Binning, FOV von 160 mm und f Stopp von 1,1. </li><li> In Schritt 2 das ganze Tier zu beobachten, ein Reflexionsbild unter Verwendung eines offenen Anregungsfilter (weißes Licht), ein offenes Emissionsfilter, eine Standardbelichtung von 0,2 sec mit 2 x 2-Binning und ein FOV von 16 cm erwerben. Hinweis: Die tatsächliche Aufnahmezeit ist ~ 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Maus Dissection und Image Acquisition <ol><li> Wenn die Live - Darstellung das Vorhandensein von umfangreichen Intraperitonealtest Krankheit oder Tiere zeigen Akkumulation von Aszites zeigt (wie von Blähungen belegt), Verlust oder Gewinn an Körpergewicht von mehr als 20%, Lethargie oder andere Anzeichen von Leiden, einschläfern jede Maus mit CO 2 Narkose durch zervikale Dislokation gefolgt. </li><li> Schneiden Sie die Haut nach vorne entlang der ventralen Mittellinie der Maus, mit einer Spitz DISSECTIOn Schere, von der Oberseite der Oberschenkel an der Unterseite des Brustkorbs. Größte Vorsicht walten lassen nur die Hautschicht zu durchschneiden (Abbildung 2Bi). Vorsichtig trennen die Haut von Peritonealgewebe, sicher die Bauchwand nicht durchstoßen zu sein. </li><li> Mit einer Spitz Dissektion Schere, geschnitten seitlich sowohl entlang der Unterseite des Brustkorbs und der Oberseite der Oberschenkel zu schaffen zwei Hautlappen (2B ii, iii). </li><li> Platzieren Sie jede Maus auf ihrer Bauchseite (Bauchhöhle nach unten gerichtet) mit den Hautlappen aufgerissen und scannen jede Maus mit ihren Organen in situ unter Verwendung des Kleintier optische Abbildungssystem (3A, B). <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in 2.4.1.-2.4.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Halten Sie die Maus Sezieren durch Extrahieren einzelner Peritonealdialyse Organe, einschließlich Leber, omentum / Bauchspeicheldrüse, Magen, Zwerchfell, Dünndarm, Dickdarm, links und rechts Peritoneum, Ovarien, kidneys, Gekröse und Fettpolster. <ol><li> Beachten Sie, aufzuzählen, und sichtbare Tumoren an jedem Organ aufzunehmen. Verwenden eine Dicke, den Durchmesser jedes Tumors zu messen. </li><li> Bezeichnen Tumoren weniger als 2 mm im Durchmesser so klein, zwischen 2 und 5 mm als Medium und größer als 5 mm so groß. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Organe auf der organ Scanvorlage (4) , die eine vorbestimmte Position für jedes Organ identifiziert. Verwenden Sie PBS die Organe feucht zu halten. </li><li> Scannen Sie jedes Blatt von Organen das kleine Tier optische Abbildungssystem (3C, D). <ol><li> Verwenden Sie die gleichen Bildaufnahmeparameter wie in Schritt 2.4 beschrieben. </li></ol></li><li> Nach dem Scannen Platz Organe in 10% Formaldehyd nachfolgende Verarbeitung für die Histologie zu ermöglichen. </li></ol> 4. Quantifizierung der Tumorlast in the Fluoreszenzbilder <ol><li> Um die Menge der Autofluoreszenz in jedem Multispektraldaten Scan zu reduzieren, entmischen zuerst die Dateien Software zur Verfügung, mit dem Kleintierbildgebung System. <ol><li> Laden Sie zuerst das RFP: In - vivo - Spektral-Datei, gefolgt von der Autofluor: In Vivo Red - Datei im Unmixed Images Fenster und wählen Sie entmischen. </li></ol></li><li> Exportieren Sie die .bip-Dateien als 16-Bit-Tiff (unskaliert) Format. </li><li> Verwenden Sie ImageJ Software (ex vivo Organe und dann die volle Maus Körper mit Organen in situ). <ol><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen Sie die 16 - Bit - TIFF - Dateien der Organscanvorlagendateien in ImageJ zu öffnen. </li><li> Unter Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast, wählen Sie den Minimalwert angezeigt auf 0 zu setzen und die maximal angezeigte Wert auf 35.353 und dann unterBild&gt; Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. Hinweis: Verschiedene Tiermodelle werden verschiedene Helligkeitsstufen erfordern, aber es ist wichtig, um die Helligkeit übereinstimmend.Alle einer gegebenen Studie zu halten. </li><li> Mit dem Freihand - Auswahl - Werkzeug zeichnen Sie eine Region Freiform von Interesse Auswahl (ROI) um jedes Organ und verwenden Sie das Messwerkzeug (STRG + M) , um die Oberfläche des jeweiligen Organs zu berechnen; notieren Sie die Oberfläche jedes Organ in einer Tabelle. </li><li> Mit der ROI um jedes Organ gezeichnet, klicken Sie rechts in der ROI Duplikate und wählen Sie nur die Orgel aufzunehmen. </li><li> Während bei den einzelnen Organ suchen, unter Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert, wählen Sie auf einen niedrigeren Schwellenwert von + 1200 und einem oberen Schwellenwert von + 1700 die Schwelle des Bildes zu setzen onl zu wähleny die meisten hell fluoreszieren Regionen und überprüfen dunklen Hintergrund zu wählen; wählen Sie OK. Hinweis: Die Bilder manuelle Manipulation der Schwellen Schiebern in ImageJ erfordern kann, so daß die zuvor hellsten Bereiche für den Analyseschritt ausgewählt sind, wie oben gezeigt. Verschiedene Krankheitsmodelle werden unterschiedliche Schwelleneinschränkungen erfordern, aber es ist wichtig, dass die Schwellenwerte im Einklang während einer bestimmten Studie zu halten. </li><li> Unter Analysieren&gt; Partikel analysieren, ändern Sie die Größe (Pixel ^ 2) bis 10-Unendlichkeit, wählen zu zeigen: Outlines, überprüfen nur &quot;Ergebnis anzeigen&quot; auszuwählen , und klicken Sie auf OK sowohl die Bereiche und rohen integrierten Dichten dieser hellen Bereichen zu messen, als Tumoren. </li><li> Notieren Sie sich die Werte der Oberfläche und die Raw Integrierte Dichte jeder Auswahl Tumor in der angezeigten <strong&gt; Ergebnisse Tabelle in derselben Kalkulationstabelle die Organoberfläche Bereiche enthält. </li><li> Unter Analysieren&gt; Tools&gt; Kalibrierung Bar, eine Kalibrierungsskala bar auf die Bilder der Organe hinzufügen. Hinweis: In diesem Beispiel wurde dies durch eine Änderung der Lage nach oben rechts, die Füllfarbe auf Schwarz, die Farbe des Labels auf Weiß, die Anzahl der Etiketten bis 5, die Dezimalstellen auf 0, um die Schriftgröße 12 und der Zoom gemacht Faktor 4,0 und ermöglicht Bold Text. </li><li> Unter Datei&gt; Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als Tiff und .Jpeg. </li><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen Sie die JPEG - Datei der Organe zu öffnen und dann unter Einfügen&gt; Textfeld </strong&gt;, Orgel Etiketten hinzufügen, indem Sie ein Textfeld unter jeder der drei Reihen von Organen zu schaffen. </li><li> Verwenden Sie Datei&gt; Öffnen jedes der 16 Bit zu öffnen TIFF - Dateien der Ganzkörper - Scans in ImageJ in der Reihenfolge der Maus Nummer. </li><li> Unter Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast, wählen Sie das Minimum, angezeigte Wert auf 0 und der maximale Anzeigewert + 35353 und dann unter Bild&gt; Lookup - Tabellen, wählen Sie Red Hot. </li><li> Unter Datei&gt; Speichern unter ..., speichern Sie die Montage als a. Tiff und .Jpeg. </li></ol></li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Fügen Sie die Tumorauswahlbereiche und rohen integrierten Dichten jeweils für jedes Organ jeder Maus und notieren Sie die Gesamtfläche Organtumor für jede Maus. </li><li> Normalisieren der aufgezeichneten Bereich und rohe integrated Dichtewerte für die Größe des jeweiligen Organs durch den gesamten Tumor und Gesamt roh integrierte Dichtewerte dividiert durch die entsprechende Organoberfläche (Tabelle 1). </li><li> Berechnen und zeichnen Sie den Mittelwert der beiden normalisierte Tumoroberflächenbereiche und die normalisierte Roh integrierte Dichtewerte (5A, B). </li><li> Vergleichen dieser Mittelwerte zu denjenigen erhalten durch visuelles Zählen der Tumoren, die während der Inspektion jedes Organ für metastatischen Läsionen mit dem bloßen Auge sichtbar waren. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe über Multimodal Pre-Clinical Imaging, gesponsert von Bruker Biospin.

Im Gegensatz zu Studien mit menschlichen Eierstockkrebszellen verwendet, die bei immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, beschrieben das Protokoll nutzt oben immunokompetente C57 / BL6-Mäusen und syngenen Maus Eierstockkrebszellen. Während diese Einschätzung der möglichen Rolle von Immun Infiltrate in der Tumorprogression und Metastasierung ermöglicht, macht das Vorhandensein von dunklen Haaren auf der Bauchoberfläche Bildgebung weniger empfindlich. Verwendung eines Haarentfernungs Haare vor der Bilderzeugung verbessert die Bildaufnahme zu entfernen, ist jedoch zeitaufwendig, insbesondere für Experimente erfordern Längs Bildgebung. Hairless &#39;nackten&#39; Mäuse können in diesem Protokoll verwendet werden und erfordern keine Enthaarungsmittel basierte Haarentfernung. Weiterhin Nacktmäusen fehlt ein funktionierendes Immunsystem, so kann auch das Wachstum von menschlichen Eierstockkrebszellen in Experimenten zur Beurteilung verwendet werden, wobei der Beitrag des Immunsystems nicht unter Analyse ist. Es sollte auch, dass die Tiefe der intraper bemerkt werden,itoneal Tumoren stellt auch technische Herausforderungen, als optische Fluoreszenzbildgebung in der Regel nicht Tumoren in einer Tiefe mm größer als 5 zu erkennen. Darüber hinaus bieten die Prävalenz von Ascitesflüssigkeit und das Vorhandensein von Aszites-Tumorzellen zusätzliche Komplikationen. Wir haben bei der Bildung von Ascitesflüssigkeit signifikante Maus zu Maus Variabilität beobachtet, selbst wenn sie mit der gleichen Zelllinie injiziert. Also in Gegenwart von Aszites, ist dieses Verfahren bevorzugt, Endpunktanalyse der organspezifischen Tumorlast anstatt Routine Längsabbildungsprogressions. Im aktuellen Fall, dramatische Veränderungen in Tumorbelastung wurden zwischen den beispielsweise Mäusen festgestellt, so dass Kohorten von vier bis fünf Mäuse wird in der Regel für die statistische Analyse ausreichen. Im Falle von weniger dramatische Unterschiede in der Tumorlast, werden zusätzliche Versuchspersonen benötigt werden statistische Aussagekraft zu erreichen. Während die hierin deutlich in Tumorvolumen, optische Fluoreszenzabbildung gezeigten Beispielen unterscheiden können verwendet werden,viel kleinere Unterschiede in organspezifischer Tumorlast erkennen, insbesondere im Vergleich zu Gewicht- oder caliper basierten Messungen an kleinen Läsionen (nicht gezeigt) .Resolution und Empfindlichkeit mit Zelllinie und Abbildungssystem variieren. Im vorliegenden Fall kann metastatic Implantate so klein wie 400 &amp; mgr; m im Durchmesser aufgelöst und quantifiziert werden. Alternative Methoden , einschließlich kontrastverstärkten Computertomographie (CT), Magnetresonanz (MR) -Abbildung und Positronen - Emissions - Tomographie (PET) wurden zur Längsabbildungs ​​14,15 beschrieben. Modalities kombinierte anatomische und funktionelle Bildgebung einschließlich sind ebenfalls in der Entwicklung 16. In Bezug auf dieses vorgeschlagene Verfahren zur Quantifizierung der Tumorlast, ist zu beachten, dass die Bestimmung der Fluoreszenzschwellenwerte [Schritt 4.3.5.] Auf der Intensität der Fluoreszenz in den Bildern zu sehen organ basiert [Schritt 4.3.2.] und wird durch den Benutzer gewählt, um nur die meisten fluoreszierenden Bereiche relative auf den Rest des Organs. Variierende Schwellenwerte wurden in der Analyse verwendet, bevor die endgültigen Schwellenwerte in dieser Studie verwendet bestimmen. Sobald sie bestimmt wurden diese gleichen Schwellenwerte für jedes Organ verwendet analysiert, um Konsistenz bei der Quantifizierung von zu gewährleisten, was durch den Forscher getan metastatischen Gewebe durch die anfängliche visuelle Analyse erachtet wird. Die Bestimmung dieser Schwellenwerte ist ein kritischer Schritt in dem Verfahren und möglicherweise von einem Projekt zum anderen durch die einzelnen Forscher ermittelten variieren. In diesem Fall wurde eine große untere Schwelle verwendet, um nur die höchste Intensitätsfluoreszenzsignale zu erfassen. Durch die Verwendung dieser gleichen Schwellenwert für jedes Organ analysiert, bieten die Analyse und die Ergebnisse vergleichende quantitative Ergebnisse im Rahmen dieser Gruppe von Mäusen. Während dieses Verfahren bei der Quantifizierung der absoluten Werte der Tumorfläche begrenzt ist, ermöglicht es die Fähigkeit Forscher relativen normalisierten Tumorlast unter den gleichen a vergleichen,nd verschiedenen Organen innerhalb Kohorten von Mäusen. Es sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz die Quantifizierung von Tumoren enthält, die nicht mit bloßem Auge. Der einzigartige metastasierendem Mechanismus der EOC Ergebnisse in weit intraperitoneale Karzinomatose verbreitet mehreren Geweben und Organen beteiligt, wodurch eine optimale onkologischer Chirurgie technisch anspruchsvoll. Als komplette Zytoreduktion positiv mit Gesamtüberleben korreliert, so folgt, dass die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien intraperitonealen Metastasierung zu bekämpfen gerechtfertigt ist. Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit ist jedoch abhängig von der genauen Quantifizierung der Tumorlast, einschließlich der Bewertung der organspezifische Metastasierung. Mit Hilfe der optischen Bildgebung von RFP-markierten Tumorzellen in situ für Orgel Autofluoreszenz korrigiert, kombiniert mit einer sorgfältigen Ex - vivo - Organ - Bildgebung, haben wir einen Ansatz entwickelt , um intraperitoneale organspezifischen Tumorlast zu quantifizieren. Interessanterweise zeigen unsere Analysendass bevorzugte Stellen von Metastasen in diesem Modell, wie von Tumorlast / Fläche definiert, sind ähnlich denen bei Frauen mit Eierstockkrebs (Omentum, Eierstock-, Darm-, Mesenterium) 2,4,5 gefunden. Daher sollte dieser Ansatz bei der Bewertung der experimentellen Therapie Zukunft Nutzen haben entworfen metastasierten Erkrankung zum Ziel.

Epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist die häufigste Todesursache von gynäkologischen Krebserkrankung, mit einem geschätzten 21.290 Neuerkrankungen in den USA im Jahr 2015 und schätzungsweise 14.180 Todesfälle 1. Die überwiegende Mehrheit (&gt; 75%) der Frauen mit Spätstadium der Krankheit diagnostiziert (Stadium III oder IV) durch diffuse Intraperitonealtest Metastasierung und schlechter Prognose charakterisiert. Wiederauftreten der Krankheit in der Bauchhöhle folgenden First-Line - Chemotherapie ist auch üblich , und stellt eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit 2,3. EOC metastasiert durch einen einzigartigen Mechanismus sowohl direkte Verlängerung aus dem Primärtumor zu benachbarten Peritonealdialyse Organe sowie durch die Dissoziation oder vergießen von Zellen aus der primären Tumoroberfläche als einzelne Zellen oder mehrzelligen Aggregate beteiligt sind. Die Zellen werden in die Bauchhöhle Schuppen, wobei sie Ablösung induzierte Apoptose 4 widerstehen. Anhaftungen von Peritonealdialyse Aszites ist weit verbreitet, wie Schuppen Tumorzellen Peritonealdialyse Lymphdrainage und t blockierenumors produzieren Wachstumsfaktoren, die die vaskuläre Permeabilität zu verändern. Ein Teil der Schuppen Tumorzellen heften sich an die Oberfläche von Peritoneal Organe und Strukturen , einschließlich Darm, Leber, Omentum und Mesenterium, woraufhin sie mehrere weit verbreitet Sekundärläsionen 3,5 herzustellen verankern und sich vermehren. Hämatogener Metastasierung ist selten. So klinische Management besteht üblicherweise aus onkologischer Chirurgie einschließlich &quot;optimalen debulking&quot;, definiert als Resektion aller sichtbaren Tumors (egal wie klein). Komplette Zytoreduktion ist mit einem deutlichen Anstieg der Gesamtüberlebenszeit 6,7 zugeordnet und mit der Herausforderung der Identifizierung und Beseitigung von Läsionen &lt;0,5 cm verbunden. als auch bei der Identifizierung von prognostischer Biomarker und Erprobung neuer Chemotherapien oder Kombinationstherapie Ansätze Kleintiermodellen haben Nutzen bei Ovarialkarzinom Forschung bewiesen in unserem Verständnis der Krankheitsprogression zu verbessern. Als primäreWebsite von Eierstockkrebsinzidenz und Metastasierung ist die Bauchhöhle, orthotopen Modelle von EOC Metastasierung die Analyse und Charakterisierung von intraperitoneale Krankheit betreffen. Obwohl es in der Fähigkeit, Bildtumorzellen jüngsten Verbesserungen gewesen, auch auf Einzelzellebene, gibt es immer noch erhebliche Schwierigkeiten in der metastasierten Tumorbelastung von EOC zu quantifizieren. Diese Herausforderungen entstehen durch die Anzahl, Größe und anatomische Lage der Metastasen. Weiterhin besteht ein Bedarf nach Etikettenkrebszellen, um sie von normalen Wirtszellen zu unterscheiden. Frühere Studien haben Antikörper-basierten Markierungsprotokolle oder Transfektion von Tumorzellen mit Luciferase 8,9 verwendet. Direkte Fluoreszenzmarkierung von Krebszellen wurde erstmals 1997 von 10 Chishima und Mitarbeitern berichtet. Fluoreszierende Markierungen erfordern keine Zugabe von exogenem Substrat und liefern vorzügliches Tumorzellspezifität, bieten ein wirksameres Mittel Krebsmetastase 11,12 verfolgen </sup&gt;. Wir beschreiben hier eine optische Bildgebungsverfahren für die quantitative Analyse von Metastasen eine syngene orthotoper Xenograftmodell von rot fluoreszierendes Protein (RFP) umfasste mit -markierte murine ID8 Ovarkrebszellen 13 und immunkompetenten C57 / BL6 - Mäusen. Wir zeigen , ein neues Verfahren der relativen Quantifizierung der Tumorlast in vivo Vereinigen und ex vivo - Bildgebung mit Entfernung von Gewebe Autofluoreszenz. Dieser Ansatz hat einen potentiellen Nutzen in Studien entwickelt, um die Wirkung von spezifischen genetischen, epigenetischen oder Mikroumweltänderungen und / oder Behandlungsmethoden für organspezifische Metastasierung des Ovarialkarzinoms zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:117px;">10-014-CM</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:420px;">Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Xtreme small animal imaging system</td>
			<td>Bruker Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bruker Multispectral software</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lentiviral particles with Red fluorescent protein</td>
			<td>GenTarget, Inc.</td>
			<td>LVP023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin for cell culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td>
			<td>purchases from drugstore&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
			<td></td>
			<td>free download</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>&#160;RS 5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dissecting tools (Scissors)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS 5910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Der metastasierendem Mechanismus des Ovarialkarzinoms durch hochdiffusem Intraperitonealtest Metastasierung gekennzeichnet, bestehend aus zahlreichen Läsionen unterschiedlicher Größe, darunter mehrere kleine (&lt;2 mm) Läsionen. Somit ist die Verwendung von RFP-markierten Tumorzellen (Abbildung 1) und optische Bildgebung stellt eine alternative Methode zur manuellen Zählung und Messung der Größe der Läsion. Die Entwicklung von Tumorbelastung im Laufe der Zeit kann der Mäuse und die Messung der Bauchumfang von wöchentlich bestimmt werden , mit einem Gewicht von möglichen Vorhandensein von Aszites zu messen. In vivo optische Bildgebung liefert einen komplementären Ansatz der Tumorlast (Abbildung 2) zu beurteilen. Eierstockkrebs metastasiert auf mehrere Standorte in der Bauchhöhle und molekularen Treiber von ortsspezifischen Metastasierung sind derzeit nicht bekannt. Neben der Ermittlung des Gesamttumorlast, nach der Tötung sorgfältige Präparation durchgeführt werden ortsspezifische pa zu bewerten und zu quantifizierentterns der Metastasierung. Somit optische Abbildungs ​​peritonealer Organe in situ (3A, B) in Kombination mit ex vivo Beurteilung der einzelnen Organe (3C, D) können nützliche Daten über den Gesamt vs organspezifischen Tumorlast bereitzustellen. Die Scans dargestellt in Abbildung 3 stellen die Ergebnisse des Abtastens der Bauchhöhle und einzelne Organe von Mäusen mit variierenden Grad der Tumorlast. Beispielsweise zeigt 3C die meisten Tumorbelastung in Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenterium von Maus A. Im Vergleich zu den gleichen Organen in Maus - B, ein signifikanter Unterschied in Signal gesehen (Figur 3D). Die Verwendung der organ Scanvorlage (4) hilft bei der Identifizierung von organspezifischen Tumorlast. Die Beobachtung der Differentialtumorbelastung quantitativ sowohl hinsichtlich der Tumorfläche und Tumorsignalintensität (Tabelle 1, Abbildung 5) bestätigt. <p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Die Ergebnisse in diesen Figuren und Tabelle eine minimale und maximale Anzeigebereich von 0 bis + 35353 so gezeigt wurden analysiert wie keine falsch-positive Signale zu vermeiden, und Autofluoreszenz durch die Gewebe abgegeben wird. Die unterschiedlichen Grade der Signal in Figur 2 zu sehen und 3 veranschaulichen die Vielzahl von Tumorbelastung , die abgebildet werden kann und quantifiziert unter Verwendung dieses Verfahrens. Die Daten in Tabelle 1 veranschaulicht diesen großen Bereich der Anwendbarkeit sowohl in Tumorfläche und die Signalintensität des Tumors zu quantifizieren. Wenn beispielsweise im Omentum / Pankreas von Maus-A im Vergleich zu dem Maus-B, die normierte Tumor-Oberfläche beträgt 26 mal größer in Maus-A aus als Ferner Maus B., der große Bereich der Signalintensität auch im Omentum ist beispiels / Pankreas von Mäusen A und B; die normalisierte Roh integrierte Dichte von Maus-A ist 56-mal größer als die der Maus B. Diese Ergebnisse die Gültigkeit der Compari demonstrierendie Tumorlast mehrerer Test ng Themen relativ zueinander, sowohl in Bezug auf Tumor Oberfläche und Tumorsignalintensität, diese schnelle Methode, die nicht weiter histologische Analyse erfordert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig1.jpg" /> Abbildung 1. ID8 Murine Ovarkrebszellen Express RFP. (A) Phase Bild von ID8 - Zellen. (B) Fluoreszenzbild von ID8 Zellen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig2.jpg" /> Abbildung 2. Live - Optical Imaging von C56 / Bl6 Maus mit intraperitoneale Tumorlast. (A) Enthaarungscreme wurde verwendet , hai zu entfernen<html> r von der Bauchseite der Maus vor dem Scannen. (B) Diagramm anfängliche ventralen Mittellinie und seitliche Einschnitte zeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3AC" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3AC.jpg" /> <img alt="Abbildung 3BD" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3BD.jpg" /> Abbildung 3. Endpoint - Scanning von intraperitoneale Tumorlast. (A, B) Mäuse werden zunächst mit Organen in situ (Bauchseite nach unten) nach dem Öffnen der Bauchseite der Maus. (C, D) Imaging einzelner Organe abgebildet. Jedes Organ wird seziert, visual Tumorbelastung aufgezeichnet und auf dem Organ Scanvorlage zur Analyse gegeben.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig4.jpg" /> 4. Organ Scanning - Vorlage Abbildung. Dissected Organe werden auf der Orgel Scanvorlage platziert Positions Identifizierung einzelner Organe während des Scannens aufrechtzuerhalten. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig5.jpg" /> .. Abbildung 5. Normalized Quantitative Daten für das Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery Daten analysiert wurden , wie in Protokoll beschrieben und wie in Tabelle 1 gezeigt Maus A bezieht sich auf die Maus in das Panel 3A abgetastet wird ; Maus - B bezieht sich auf die Maus in das Panel 3B gescannt. (A) Normalized Tumorbereich. Fluoreszenzsignal Quantifizierung Analyse dieser drei Organe wurde in Form eines Verhältnisses durchgeführt und quantifiziertder Tumoroberfläche auf ganze Organoberfläche für beide Mäuse. (B) normalisierten Roh integrierte Dichte. Fluoreszenzsignal Quantifizierungsanalyse dieser drei Organe wurde in Bezug auf ein Verhältnis von rohem integrierten Dichte ganze Organoberflächenbereich für beide Mäusen durchgeführt und quantifiziert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="513"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Omentum / Pancreas </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Normierte Tumorfläche </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td style="width:129px;"> 0,5346 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 5.11E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Maus - B </td><td style="width:129px;"> 0,0203 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 8.97E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Ovarien </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> Normierte Tumorfläche </td><td colspan="2" style="width:320px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td style="width:129px;"></td><td colspan="2" style="width:320px;"> 4.79E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Maus - B </td><td style="width:129px;"> 0,0123 </td><td colSpanne = &quot;2&quot; style = &quot;width: 320px;&quot;&gt; 5.62E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Gekröse </td></tr><tr height="101"><td height="101" style="height:101px;width:64px;"></td><td colspan="2" style="width:193px;"> Normierte Tumorfläche </td><td style="width:256px;"> Normalisierten Roh Integrierte Dichte </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus A </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,2951 </td><td style="width:256px;"> 2.22E + 07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> Maus - B </td><td colspan="2" style="width:193px;"> 0,0098 </td><td style="width:256px;"> 4.15E + 05 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Normalized Tumorfläche und normalisierten RohIntegrierte Dichtewerte im Omentum / Pancreas, Ovarien und Mesentery sowohl Maus A und Maus B. Pfosten Dissektion und Scannen wurde jedes Organ segmentiert und seine Fluoreszenz der Anteil der Tumorbereich zu Gesamtorganoberfläche und die Intensitäten der zur Bestimmung quantifiziert Fluoreszenz für diese Tumorarealen. Omentum / Pankreas, der Eierstöcke und Mesenteriums wurden ausgewählt, da sie die stärksten Fluoreszenzsignale in sowohl der positiven und negativen Kontrollgruppen hatten.

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Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Aufrufe.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Serie: Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

Mausmodell für nicht-invasive Bildgebungs zu erfassen und zu überwachen Eierstockkrebs Rezidiv

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...