Queremos reconhecer Tyson Foods Inc. para fornecer generosamente os ovos fertilizados. Shanna Arnold foi fundamental durante as filmagens deste protocolo. Trenis Palmer foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde sob a Kirschstein Ruth L. Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (F31 Instituto Nacional do Câncer). Este trabalho foi parcialmente suportado pelo CCSRI Grant # 700537 para JDL e NIH / NCI conceder # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 a AZ.

1. Preparar os ovos para xeno (metástase espontânea) <ol><li> Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 10 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora. </li><li> No dia 10 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado. </li><li> A veia corioalantóicas está localizado e marcado. Esta veia é localizada na parte superior da casca do ovo onde é a junção de vários grandes vasos sanguíneos. Neste ponto de ramificação do vaso sanguíneo cai, longe do CAM e atribui ao embrião. A caixa quadrada um centímetro é desenhado com lápis na casca de ovo de aproximadamente um centímetro de distância do ponto de ramificação na veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo. </li><li> Usando uma ferramenta de corte rotativa (Dremel) equipado com uma pedra de carboneto de silicone de moagem (Dremel parte # 84922) de um buraco é perfurado através da extremidade sem corte do ovo para dentro do saco de ar. Usando esta ferramenta mesmo um buraco é perfurado dentro do quadrado previamente desenhado na parte superior do ovo, parando curto da membrana da casca. A agulha da seringa de calibre 25 com uma broca fina na ponta é usada para fazer um pequeno furo na membrana da casca com cuidado para não rasgar o CAM subjacente. O CAM é posteriormente separada da membrana da casca na região da praça usando sucção gentil criado com uma ajuda pipeta automática equipada com um pedaço de tubo de tygon ¼ &quot;colocado contra o buraco na airsac. Após a aplicação de sucção, um bolsão de ar deve debaixo do buraco na praça significando que o CAM foi removida com sucesso longe da casca de ovo. Depois que o CAM é descartado, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60%, em antecipação de enxertia das células tumorais. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial. </li></ol> 2. Preparar os ovos para injecção intravenosa (metástase experimental) <ol><li> Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 12 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora. </li><li> No dia 12 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado. </li><li> A veia corioalantóicas está localizado e marcado. A um centímetro por 0,5 centímetro retângulo é desenhado com lápis na casca de ovo diretamente acima da veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo. </li><li> Uma pequena janela é criada na casca de ovo no local desenhado usando a broca dremmel (# 118). A janela é removida para expor a membrana de casca de ovo subjacente que é posteriormente prestados transparente com gota de óleo mineral. Ver figura 5A para uma representação gráfica. </li><li> Neste ponto, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60% na expectativa de injetar as células do tumor. </li></ol> 3. Preparar as células tumorais para enxertia ou injeção. <ol><li> Para xeno, as células do tumor são separadas de seus pratos de cultura usando Tripsina / EDTA e lavada com 10 volumes de tampão fosfato (PBS), a fim de remover qualquer mídia residual, Tripsina, ou EDTA. </li><li> Por via intravenosa, as células cultivadas são destacadas usando uma solução de células-dissociação não enzimática, e lavados com soro livre de DMEM. e) </li><li> As células são contadas com um hemocitômetro e ressuspendidas em PBS a 1-40 células / ml para enxertia, ou, alternativamente, ressuspenso em DMEM sem soro, 1 milhão de células / ml solução injectável IV. </li></ol> 4. Enxerto as células do tumor para o CAM recém-expostas (Metástase espontânea) <ol><li> Os ovos são retirados da incubadora e uma pequena janela é cortado no local da praça previamente elaborado, onde a bolsa de ar novo formou. Isso é mais facilmente feito com uma ferramenta rotativa equipada com uma roda de corte (ferramenta Dremel com a roda de corte # 409 circular). Um par de agulha nariz fórceps é usado para remover a seção pequena de casca de ovo e expor o CAM subjacente. </li><li> Usando um aplicador de algodão (Fisher Marca # 23-400-001) a CAM é abrasiva 5 vezes. Um pouco de sangue deve ser evidente no algodão. Imediatamente após o dano ao CAM, 25μl da suspensão de células é colocado sobre a área danificada. O número ideal de células e é determinadampirically mas pode variar de 5 a 0.5X10 1X10 6. A janela em que o ovo é hermeticamente fechadas com fita adesiva e os filhotes ficam em pé por 10-15 minutos, a fim de permitir que as células de resolver. Após 15 minutos os ovos são devolvidos à incubadora estacionário. </li><li> Os tumores são permitidos a crescer por 5-8 dias, dependendo da aplicação específica ea natureza da linha de células tumorais utilizados. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial. </li></ol> 5. Injeção intravenosa de células tumorais (metástases Experimental) <ol><li> Usando um calibre 30 100μl seringa de insulina de suspensão de células é injetado na veia alantóide de cada embrião, os ovos foram devolvidos para uma incubadora e lá permaneceu estacionária por mais 1-7 dias. </li><li> Em momentos distintos, o pulmão ou menor CAM são colhidas de cada embrião e processados ​​para a detecção de células tumorais, como descrito abaixo. </li></ol> 6. Tumores colheita e tecidos pinto <ol><li> A área de dissecção é preparado. O ensaio detecta células metastáticas através da quantificação de DNA humano através de um método altamente sensível PCR. Por isso é muito importante para evitar a contaminação com DNA exógeno. Dissecção é realizada em uma área dedicada e em todo o dissecções as ferramentas são limpos entre cada animal. , A fim de evitar a contaminação cruzada de suas amostras durante todo o processo de dissecação 3 conjuntos separados de ferramentas são utilizadas: um conjunto para cortar o ovo, um conjunto para remover o tumor primário e um conjunto para remover os órgãos internos. Além disso, quatro recipientes de lavagem são usados ​​para lavagem de ferramentas seqüenciais entre cada animal. Na seqüência estas lavagens são: 1) de água bidestilada, 2) de água bidestilada, 3) cloro, e 4) de etanol 70%. </li><li> Os ovos são retirados da incubadora estacionária e colocado em gelo por 15 minutos para anestesiar e sacrificar os animais. As janelas são abertas de tal forma que os tumores se tornam visíveis. Abrir as janelas maiores, removendo algumas das casca de ovo pode ser necessária. Os tumores primários são ressecadas do CAM, pesados ​​e processados ​​para histologia. </li><li> O filhote é removido da casca de ovo, cortando a casca radialmente em metades iguais. O embrião é decantada a partir do shell de corte e transferido para um lado limpo da mama pesar barco para cima. O animal é dissecado com o uso de um conjunto fresco e limpo de ferramentas. O animal é aberta cortando o esterno. Uma vez que o embrião é aberta, um pedaço do fígado de qualquer lobo direita ou esquerda é coletado. Os órgãos internos são subseqüentemente removidos puxando suavemente sobre o esôfago ligado à moela e corte a visera que ligam os órgãos. A fim de recolher os pulmões cortar a caixa torácica é aberta a placa de mama é separado eo coração é removido. Neste ponto, é possível cortar em torno dos quatro lados do pulmão (parte superior mais próximo à cabeça do lado esquerdo ao longo da caixa torácica, a parte inferior perto do diafragma eo lado direito ao longo da traquéia). Por uma questão de coerência, mesmo pulmão são coletadas em cada animal. Colhidas amostras de tecido são armazenadas a -20 ° C para uso posterior, ou pode ser processado imediatamente para o isolamento de DNA. </li></ol> 7. Isolamento do DNA genômico e Análise de PCR quantitativo <ol><li> DNA genômico é extraído de tecidos utilizando o SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). O DNA extraído pode ser transferido para um tubo eppendorf limpo e armazenado a -20 ° C ou usado imediatamente. É importante para diluir o DNA 1:50 em água livre de nuclease antes de o utilizar na reação de PCR subseqüente. Alternativamente, o DNA pode ser extraído usando qualquer número de protocolos padrão de extração de DNA (Zijlstra et al., 2002). </li><li> DNA humano é detectada nos tecidos específicos pinto usando PCR quantitativo para seqüências Alu humana. PCR quantitativo utilizando Alu-primers específicos é realizada utilizando a amplificação SYBR verde do kit Exract-N-Amp. O kit PCR vem com um mix de reação contendo SYBR 2x verde, tampão, dNTPs sais, polimerase Taq Antibody eo Jumpstart Taq. A mistura de reação é feita em um volume final de 15μl, com 0.4μM de cada primer. Para a maioria dos casos, usando o DNA extraído diluído 1:50 irá fornecer dados quantitativos, no entanto, a quantidade ideal de DNA modelo pode precisar de ser otimizado empiricamente. Primers GAPDH de frango são usados ​​como um controle interno da PCR é executado sob as seguintes condições para seqüências Alu: ativação da polimerase a 95 ° C por 2 min, seguido por 30 ciclos de 95 ° C por 30 s., 63 ° C por 30 s. , 72 ° C por 30 s. As condições de reação para a galinha GAPDH são idênticos aos descritos para Alu no entanto pode ser necessário estender o PCR para 40 ciclos. </li><li> Análise quantitativa de metástase é realizada usando o método ΔΔCt comparando grupos experimentais com um grupo controle (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativamente, uma curva padrão pode ser gerada através de uma série de diluição de células tumorais humanas extraídas usando o kit Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). Significância estatística é avaliada utilizando teste t de Student ou Anova análise dos grupos controle e experimental. </li></ol> 8. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. A galinha modelo de metástase embrião. A) Um diagrama de painel de quatro ilustrando a aparência do modelo em corte transversal em etapas fundamentais: 1. Após 10 dias de incubação. O CAM chegou próxima do máximo tamanho. As artérias e veias são claramente visíveis com a veia alantóide posicionado contra a parte superior do ovo. 2. O ovo imediatamente após a perfuração de dois furos na casca de ovo: uma para o airsac e um ao lado do ponto de fixação para a veia alantóide. 3. A aparência depois de um leve vácuo tem sido usada para evacuar o airsac e solte o CAM. Células tumorais (azul) são aplicadas ao CAM caiu. 4. Após permitir que a célula tumoral enxertados a crescer, o tumor, juntamente com os tecidos do embrião da galinha são colhidas para análise B) A representação de série do modelo: 1.. Incubar os ovos., 2. Marcando a localização da veia alantóide., 3. Furos na casca de ovo., 4. Deixar cair o CAM., 5. Cortar uma abertura para células tumorais enxertia., 6. Aplicar as células do tumor., 7. Refrigeração dos ovos em gelo antes da coleta de tecido., 8. Colhendo o tumor após 7 dias de crescimento. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Histologia dos tumores CAM. Tecidos retirados de membrana tendo tumor corioalantóicas foi fixada em formalina, seccionados e processados ​​com uma mancha tricrômico. A) tumor HEp3 após sete dias de crescimento sobre a CAM. B e C mostram regiões ampliada de A mostra estroma e neoplásico. D) normals CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Análise longitudinal quantitativa de metástase. Variantes para a cabeça e pescoço com carcinoma HEp3 alta ou baixa capacidade metastática (HEp3 M (High) e HEp3 M (Baixo), respectivamente) foram analisados ​​por sua capacidade de disseminar o uso Alu PCR. Dez animais foram analisados ​​em cada momento para a duração de 7 dias. Estas amostras foram quantificadas contra uma curva padrão e, posteriormente, expressa como # cells/50mg tecido. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A inibição de células metástase espontânea nos animais tratados com a metástase 1A5 anticorpos inibidores. Tumores foram formados com 5x10 5 células HEp3 aplicada ao CAM do dia 10 embriões. Três dias após a aplicação das células do tumor de metade dos animais foram tratados com o anticorpo anti-CD151 1A5. Os pulmões dos animais portadores de tumor foram colhidos dois dias depois e submetida a quantitativa em tempo real alu PCR. Por outro lado quantitativo PCR em tempo real de chGAPDH foi usado para confirmar a presença de quantidades equivalentes de DNA genômico host (O método ΔΔCt foi usado para comparar os dois grupos quantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Avaliar prisão, crescimento e intravasation na cascata metastática. Fundamentalmente, a metástase para um órgão secundário é definido pelas contribuições de três aspectos: taxa de detenção, de crescimento e taxa de intravasation. Estes podem ser quantificados utilizando uma combinação de metástase experimental (A) e metástase espontânea (B). Usando metástase experimental (A) prisão é definido como o número de células detectadas após a injeção 2hr. Sobrevivência e crescimento das células preso é determinada como a mudança na célula pós-injeção número 24h. Crescimento é definida como a taxa de proliferação durante os dias 3-7. Intravasation é determinada utilizando metástase espontânea (B), onde as células intravasated número é definido como o presente ônus metastático no dia 7 que exceda o valor previsto pelo crescimento da carga metastático presentes no dia 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Expansão visualização do metastática no CAM. HEp3 células expressando GFP foram injetados por via intravenosa em 12 dias de desenvolvimento. No dia 1, 3 e 5 um ovo foi sacrificado e uma seção de CAM foi fotografada com um microscópio estéreo fluorescente. O fundo verde escura é criado por casca do ovo, a vascularização é visível como linhas pretas, e as células do tumor são visíveis como pontos luminosos verdes.

<ol>
	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li><li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment.">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+(PETA-3/CD151)+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis.">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O CAM pinto tem sido utilizada há décadas como um sistema modelo para estudar vários aspectos da biologia e progressão do câncer metastático. Avaliação princípio da capacidade metastática foram realizados neste modelo por uma variedade de grupos, incluindo a análise de dormência (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), remodelação do tecido (Deryugina et al, 2005;. Hahn-DANTONA . et al, 1999), e metástase (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Ele continua a ser um modelo muito atraente para a biologia do câncer por causa de sua facilidade de uso, sua capacidade de aceitar xenoenxertos, e seu baixo custo (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. Usando humano específico Alu-PCR quantitativo com base (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) que demonstram a capacidade de analisar disseminação metastática de linha celular humana HEp3 cpidermoid carcinoma (Figura 3). Além disso, nós demonstrar a utilidade desta técnica na avaliação da inibição da terapêutica utilizando a metástase 1A5 anticorpos inibitórios (figura 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).). Além de ser capaz de avaliar a capacidade metastática e resposta ao tratamento, este modelo também pode ser usado para estudar quantitativamente os componentes individuais da cascata metastática (Zijlstra et al., 2002). Usando metástase experimental pela injeção intravenosa de células do tumor, este modelo permite a análise de detenção de células cancerosas nos órgãos secundários e seu subseqüente crescimento (Figura 5A). Esta taxa de crescimento pode ser usado para prever a carga metastático em um ensaio de metástase longitudinal espontânea (Figura 5B). Intravasation é determinada utilizando metástase espontânea (B), onde as células intravasated número é definido como o presente ônus metastático no dia 7 menos o valor previsto pelo crescimento da carga metastático apresentam no dia 6. Como uma extensão das técnicas aqui relatadas, que recentemente desenvolveu novas estratégias para visualizar o comportamento de células tumorais in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Que utilizam nanopartículas fluorescentes marcados para atingir o microambiente do tumor (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). Através destes métodos avançando, a utilidade deste modelo pode ser explorada para visualizar as mudanças complexas e dinâmicas que suportam a sobrevivência, estabelecimento e crescimento das células tumorais. Essas tecnologias, juntamente com o custo relativamente baixo, a natureza imunodeficientes, facilidade de uso, ea adaptabilidade da CAM pinto tornar este modelo valioso para imagem e análise quantitativa de metástase de câncer.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Modificado 1X Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco tampão fosfato (D-PBS) (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman nascedouro </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Estas incubadoras são alguns dos mais prontamente disponíveis. No entanto, o vídeo vai mostrar diferentes equipamentos. </td></tr><tr><td> Sportsman incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Ferramenta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodas de corte Dremel não. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Ajuda Pipetar portáteis </td><td> Pescador </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Derrubado Aplicadores de algodão </td><td> Pescador </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Ovos fertilizados </td><td> Vários </td><td></td><td> Fornecedor diferente muitos podem ser usados. Os ovos devem ser de aproximadamente 35-55 gramas. As galinhas que estabelece-los deve ser entre 36 e 55 semanas de idade. </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Scientific, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Iluminador de fibra óptica de microscópio </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 25 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

Durante as células do câncer disseminar metástases do tumor primário, invade os tecidos em volta, e se espalhou para órgãos distantes. Metástase é um processo complexo que pode envolver muitos tipos de tecido, períodos de tempo variável extensão, e muitas vezes ocorrem profundamente dentro dos órgãos, o que torna difícil para investigar e quantificar. Além disso, a eficácia do processo metastático é influenciado por várias etapas da cascata metastática que torna difícil avaliar a contribuição de um único aspecto do comportamento de células tumorais. Como conseqüência, os ensaios metástases são freqüentemente realizados em animais experimentais para fornecer um contexto necessariamente realistas para estudar metástase. Infelizmente, estes modelos são ainda mais complicada pela sua complexa fisiologia. O embrião de galinha é um exclusivo modelo in vivo que supera muitas limitações para estudar metástase, devido à acessibilidade da membrana corioalantóide (CAM), um tecido bem vascularizado extra-embrionárias localizado por baixo da casca do ovo que está receptivo à xeno-enxerto de células tumorais (figura 1). Além disso, desde o embrião de galinha é, naturalmente, imunodeficientes, o CAM prontamente suporta o enxerto de tecidos normais e tumorais. Mais importante, a CAM aviária com sucesso suporta características celulares mais câncer incluindo o crescimento, invasão, angiogênese e remodelação do microambiente. Isso faz com que o modelo extremamente útil para a investigação das vias que levam à metástase do câncer e para prever a resposta do câncer metastático de novas terapêuticas potenciais. A detecção de células divulgada pela espécie-específicos Alu PCR torna possível avaliar quantitativamente a metástase em órgãos que são colonizados por apenas 25 células. Usando a linha de células carcinoma epidermóide Humanos (HEp3) usamos esse modelo para analisar a metástase espontânea de células cancerosas para órgãos distantes, incluindo o fígado e pulmão pinto. Além disso, usando o protocolo Alu-PCR que demonstram a sensibilidade ea reprodutibilidade do ensaio como uma ferramenta para analisar e quantificar intravasation, parada, extravasamento, colonização e como elementos individuais de metástases.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Usando PCR quantitativo, demonstramos como o bem-estabelecida pinto modelo CAM pode ser usado para analisar quantitativamente a metástase de células tumorais para órgãos distantes.

Análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de Embrião aviária

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

18.9K visualizações.  Vanderbilt University. Usando PCR quantitativo, demonstramos como o bem-estabelecida pinto modelo CAM pode ser usado para analisar quantitativamente a metástase de células tumorais para órgãos distantes.

Vídeo: Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Medicina

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualization quantitativos e Detecção de Câncer de Pele Usando imagens térmicas dinâmico

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modelos de metástase óssea

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...