Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, ea National Science Foundation suíço (31003A_141007). Markus Saxer prestou apoio técnico.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. 1 Configurando culturas fatia Organotípicas Entorhino-hipocampo <ol><li> Prepare entorhino-hipocampal culturas organotípicas (EHOSCs) de pós-natal filhotes dia 4 (P4) do mouse usando o método de incubação 4,11 estática. Aqui, utilizam ratinhos C57BL6 e CB6F1. <ol><li> Tome cerca de 30 min por rato filhote para a preparação de culturas fatia, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Realizar todas as etapas em condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar com instrumentos cirúrgicos esterilizados. </li><li> A fim de evitar uma possível interferência a partir da posição do corte ao longo do eixo do septo-temporal, usar apenas o hipocampo fatias de metade do septo. Se não for indicado de outra forma, realizar todos os passos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Corte tele cabeça de um filhote de cachorro P4 rato com uma tesoura cirúrgica. Sem anestesia é necessário para este passo. <ol><li> Remover o crânio em volta do cérebro e identificar a fenda entre a extremidade caudal dos hemisférios cerebrais e mesencéfalo. Cuidadosamente remover a parte do cérebro para rostral do mesencéfalo do crânio e colocá-lo no meio de preparação de gelado consistindo em MEM suplementado com uma forma estabilizada de L-glutamina. </li></ol></li><li> Continue a dissecção sob microscópio estereoscópico com o cérebro estar imerso no gelo médio preparação frio. Remover meninges remanescentes dos hemisférios corticais. Identificar o hipocampo na superfície caudal medial do hemisfério e separá-lo em conjunto com o córtex entorrinal adjacente do resto do cérebro. <ol><li> Transferir o tecido de um cortador de tecido e cortado 400 um de espessura, sob condições assépticas, transversal ao eixo septo-temporal do hipocampo. </li></ol></li><li> Coloque as fatias sobre ceinserções de cultura II (aproximadamente 6 fatias por pastilha) e incubar em placas de 6 poços com 1 ml por poço de meio de incubação (47 ml de MEM, 25 ml de Meio Eagle, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml I glutamax, 1 ml de uma solução estéril de glicose a 10%, pH 7,3) numa atmosfera húmida com 5% de CO 2, a 37 ° C. Troca da mídia no dia seguinte e, em seguida, a cada dois dias até uma semana. </li></ol> 2 In Vitro hipóxia e oxigênio-glicose Privação com reperfusão <ol><li> Ver Tabela 1 para um horário exato momento do procedimento. EHOSCs de cultura para 5 dias (DIV5) antes da exposição a hipoxia ou POG. Neste ponto de tempo mudar a forma de meio de incubação contendo 25% de soro de cavalo para meio isento de soro, com a seguinte composição: meio Neurobasal com suplemento B27 a 2%, 1% de glucose e glutamax adicional de 0,1%. </li><li> Preparar o meio OGD como detalhado em 7 de referência .As concentrações finais dos componentes é a seguinte: 0,3mM de CaCl2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM de NaHCO3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM de MgSO4 e 10 mM de sacarose a pH 6.8. Adicionar 1 ml de meio a cada poço OGD de duas placas de cultura de tecidos de 6 poços. <ol><li> Perfundir a forma OGD com N 2 durante 1 hora, em uma câmara de hipoxia e, em seguida, vedar e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C. </li><li> Use tiras de anaeróbios como indicadores de hipóxia. Considere o meio estar livre de oxigénio quando a cor das tiras mudou de rosa para branco. </li><li> Para a indução da hipóxia, utilizar meio isento de soro com glucose, em vez de meio de OGD. Antes da utilização, o meio de perfundir com N 2, em uma câmara de hipoxia como descrito acima para o meio de OGD. </li></ol></li><li> Antes de as fatias são expostas a OGD, perfundir a forma OGD novamente com N 2 durante 30 min. Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionarapenas fatias saudáveis ​​para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI. </li><li> Utilizar o modelo de exposição OGD e reperfusão indicado na Figura 1. Privar fatias de oxigénio ou apenas (hipoxia) ou de oxigénio e glicose (POG), durante 15 min. <ol><li> Para a indução de hipoxia ou OGD, transferir as fatias em forma OGD e manter por 15 minutos em câmara de hipóxia. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para OGD médio e para trás. </li><li> Após a hipoxia ou OGD, substituir o meio de OGD com meio isento de soro e oxigenado culturas são deixados a recuperar durante 3, 24 ou 48 horas em meio isento de soro na incubadora normal a 37 ° C com 5% de CO 2. Adicionar PI novamente antes da fixação para a determinação da morte celular. </li></ol></li></ol> 3. tratamentos farmacológicos de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia <ol><li> Culture EHOSCs durante 5 dias (DIV5) em meio de incubação antes de exposição a tratamentos farmacológicos. Iniciar os tratamentos farmacológicos ou durante ou imediatamente após a OGD OGD quando fatias são transferidas para meio isento de soro. </li><li> Tratamentos para proteção contra POG. <ol><li> Adicionar 100 | iM 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) ou 1 uM a tetrodotoxina (TTX) ao meio de cultura durante a indução OGD (durante 15 min) ou imediatamente após a indução OGD durante 30 min. Em seguida, incuba-se meio isento de soro durante 48 horas normóxica antes da fixação. </li></ol></li><li> Os tratamentos para a indução da morte excitotóxica. <ol><li> Após 5 dias de incubação em culturas de meio interruptor para meio isento de soro contendo 100 uM (RS) -α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA), durante 30 min. </li><li> Retire o meio de cultura contendo AMPA por aspiração (ter o cuidado de remover qualquer meio residual em inserções), em seguida, transferir as fatias para placas novas com acesso médio e soro normalmantê-los por 48 horas, até a fixação. </li></ol></li></ol> 4. Fixação e Imunocoloração de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia <ol><li> O iodeto de propídio (PI) a coloração. <ol><li> Adicionar PI durante 30 min para o meio de cultura de fatias de vida, a uma concentração de 2 ug / ml. Ver culturas vivas com um microscópio invertido equipado com óptica de fluorescência e selecione fatias para mais tratamentos. Para a coloração de PI em combinação com imuno-histoquímica, adicionar solução de PI 30 min antes da fixação das culturas. </li></ol></li><li> A fixação das fatias. <ol><li> Remover o meio de cultura da placa de 6 poços e adicionar 3 ml de preparado de fresco a 4% de paraformaldeído (PFA) a cada poço. Em seguida, colocar a placa de 6 cavidades em uma geladeira e fixar O / N a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de PFA no dia seguinte e as fatias de lavar 3-4 vezes com tampão fosfato salino (PBS). </li></ol></li><li> A remoção das fatias a partir da cultura de células insert e procedimento de bloqueio para imuno-histoquímica de secções de livre flutuação. <ol><li> Retirar cuidadosamente e retire as fatias das inserções de cultura utilizando uma arte pincel do tamanho 0 ou menor. Transferir cada faixa individual num poço de uma placa de 96 poços preenchidos com tampão de bloqueio (PBS com 3% de soro de cabra normal (NGS) e 2% de Triton-X100). Manter as fatias em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação constante por um agitador orbital. </li></ol></li><li> A imunocoloração das culturas de fatias <ol><li> Para a marcação dos vasos sanguíneos usar policlonal anti-laminina a uma diluição de 1: 200 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. </li><li> Para os neurónios rotulagem utilizar anti-microtúbulo associado proteína 2 (MAP2), a uma diluição de 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. </li><li> Incubar as fatias com anticorpos primários durante 48 horas a 4 ° C com agitação constante. Após o período de incubação, lavá-las em PBS com 0,5% Triton-X100 em 3-4 vezes. </li&gt; <li> Dilui-se anticorpos secundários 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. Incubar as fatias durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro, com os anticorpos secundários conjugados com Alexa fluoróforo. Use de cabra anti-coelho adequado ou anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com Alexa 350 ou 488. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário e lava-se as fatias de três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); montá-los em lâminas de vidro e lamela as lâminas com Mowiol. </li></ol></li><li> Microscopia das fatias coradas </li><li> Ver as fatias manchadas ou em um microscópio padrão com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal. Tire fotos com uma câmera apropriada. Para algumas imagens, inverter o contraste de fluorescência, a fim de produzir vasos com uma coloração escura sobre um fundo claro (Figuras 5 e 6). </li></ol> 5 Determinação da densidade de vasos Regional nas culturas <ol><li> Quantificar o vessel com base na densidade de vasos passagens como descrito na Referência 8. </li><li> Use fatias manchadas para laminina para essas medições. Sobreponha as imagens gravadas de aumento de 10x com uma grade 6 x 6, onde cada grade é igual a 100 x 100 mm por metro quadrado, área total de 0,25 milímetros 2. </li><li> Sobreposição três dessas redes na região CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Conte as embarcações que cruzam as linhas do grid. </li><li> Para a obtenção de resultados com uma boa relevância estatística, fazer medições em pelo menos três experiências independentes, cada uma das quais os dados a partir de 3 filhotes de rato com três fatias por ratinho filhote. </li><li> Determine o valor médio das passagens de navio da grades para cada região e realizar uma análise estatística por ANOVA com correção de Bonferroni como post hoc teste (p &lt;0,05 considerada significativa), utilizando software estatístico adequado. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. 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Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609 / CEE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. Os autores não têm nada a revelar.

Com os métodos aqui apresentados, hipocampo culturas organotípicas de fatias pode ser utilizado como uma ferramenta versátil para estudar alterações plásticas no tecido neural após a lesão. Enquanto as culturas organotípicas de fatias tenha sido utilizado no passado para o estudo de reacções neuronais após isquemia 6, 7, o novo aspecto do estudo simultâneo de alterações vasculares aumenta significativamente as aplicações potenciais do presente método. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Além disso, a abordagem da cultura fatia permite não apenas estudar as consequências do desafio isquêmico, mas também permite o teste de medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção. Culturas de fatias, por conseguinte, são uma ferramenta atraente e importante para o estudo da lesão cerebral isquémica. O método aqui apresentado é de fácil implementação para todos os laboratórios haVing alguma experiência com o SNC fatia culturas. Aplicando a OGD ou hipoxia requer um equilíbrio cuidadoso do meio de cultura com N 2, a fim de obter resultados reprodutíveis. É também importante a utilização apenas culturas de fatias com um baixo número de células PI-positivas antes da aplicação de OGD. As condições de hipoxia (isto é, o tempo para que a hipoxia ou POG é aplicada) pode ser variada e optimizada de acordo com o tipo de fatia de cultura utilizado. Enquanto as reações neuronais à isquemia têm sido estudados extensivamente só existe pouca informação disponível sobre alterações vasculares após a lesão cerebral hipóxico-isquêmica. A constatação de que os vasos sanguíneos e até mesmo marcadores da barreira hemato-encefálica são mantidos em culturas fatia organotypic por até uma semana 8, 9, abriu a oportunidade de estudar as alterações da vasculatura após o desafio hipóxia na definição de culturas fatia do hipocampo organotypic 10. É claro que ele deveter em conta que os navios que são mantidos em culturas fatia não são perfundidos. Além disso, observou-se diferenças na perda de vasos sanguíneos pré-existente ao invés de extensa formação de novos vasos sanguíneos. Este modelo de sistema é, por conseguinte, provavelmente não é óptimo para estudar a formação de novos vasos após um insulto isquémico. A possibilidade de utilizar culturas organotípicas do hipocampo para a elucidação da complexa interação entre os neurônios e vasculatura abre um novo campo de estudo e promete ajudar a conseguir uma melhor compreensão e desenvolvimento de novas opções de tratamento para distúrbios neurovasculares, em particular após a isquemia cerebral acidente vascular cerebral.

O sistema nervoso central é particularmente sensível a uma perda ou redução do fornecimento de oxigénio e glicose pela vasculatura. Mesmo um tanto curta interrupção do fornecimento de sangue para o cérebro pode induzir uma perda permanente da função das áreas cerebrais relevantes que levam às síndromes típicas tempos. Além da perda de neurônios nas áreas afetadas primários, há normalmente uma perda neuronal atraso adicional através de danos secundários. Infelizmente, até agora, nenhum tratamento neuroprotector para a redução da morte neuronal secundária estava disponível um. Os esforços de pesquisa para estudar os mecanismos de lesão secundária se baseiam na utilização de modelos animais de isquemia cerebral como a oclusão da artéria cerebral média e de várias técnicas de oclusão trombótica (para uma revisão recente ver 2). Em paralelo, também devido a limitações e preocupações éticas com o uso de modelos animais, cultura fatia organotípica de vários tecidos do sistema nervoso central têm sido utilizados que permitam o study de reações neuronais para vários tipos de lesões 3-5. Para estudar a reacção neuronais sob condições que imitam a lesão cerebral isquémica, o sistema modelo de privação de oxigénio glicose (OGD) foi desenvolvido. Neste modelo, as culturas de fatia são temporariamente expostos a um meio que carece de glicose, tendo sido equilibrada com o gás de azoto na ausência de oxigénio. Com um tal tratamento, é possível induzir a lesão neuronal e perda, que é bastante semelhante ao observado após lesão isquémica in vivo de 6, 7. No hipocampo, um tal tratamento induz a perda neuronal em CA1 especificamente, mas não no área CA3 ou do giro dentado do hipocampo. Em contraste, o estudo de reacções vasculares em culturas de fatias até agora não tem sido amplamente realizadas. Uma razão óbvia é a falta de circulação e de vasos sanguíneos de perfusão no modelo de cultura de fatia. Contudo, mostrámos previamente que é possível manter bvasos Lood em CNS fatia culturas por vários dias 8, 9. O objetivo geral deste método é monitorar não só o destino dos neurônios após POG, mas estender o estudo para o destino e remodelação da vasculatura que é uma parte importante da resposta a uma lesão. Até agora, os estudos têm exigido a utilização de experiências com animais (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). No protocolo apresentado aqui, vamos detalhar como tais estudos podem ser feitos em culturas fatia organotypic entorhino-hipocampal desafiou tanto a hipóxia ou por lesões excitotóxicos seguida da análise de ambos os sobrevivência e vasos sanguíneos reações neuronais. Este protocolo é baseado em um estudo publicado anteriormente sobre o assunto 10 e pode ser útil para qualquer laboratório interessado em interações neurovasculares no SNC.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilized form of L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobic strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Lesão cerebral isquêmica é uma das condições mais comuns e devastadoras que comprometem a função cerebral adequada e muitas vezes leva a persistir déficits funcionais nos pacientes afetados. Apesar dos esforços de pesquisa intensiva, ainda não existe uma opção de tratamento eficaz disponível, que reduz a lesão neuronal e protege os neurônios nas áreas isquêmicas da morte secundário atrasado. A investigação nesta área, tipicamente envolve a utilização de modelos animais e elaborados problemáticos. Culturas fatia organotípica Entorhino-hipocampal desafiados com privação de oxigênio e glicose (POG) são estabelecidos em modelos in vitro que mimetizam isquemia cerebral. O aspecto inovador deste estudo é que as alterações dos vasos sanguíneos do cérebro são estudadas, além de alterações neuronais ea reação tanto do compartimento neuronal e compartimento vascular podem ser comparados e correlacionados. Os métodos apresentados neste protocolo ampliar substancialmente as aplicações potenciais da ouabordagem da cultura fatia ganotypic. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Isto está em contraste com os experimentos em animais complexos e problemáticos induzindo acidente vascular cerebral e isquemia in vivo. Ao ampliar a análise para incluir o estudo da reação da vasculatura poderia fornecer novas maneiras de como preservar e restaurar as funções cerebrais. A abordagem da cultura fatia apresentado aqui pode se transformar em uma ferramenta atrativa e importante para o estudo da lesão isquêmica cerebral e pode ser útil para testar medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção.

Oxygen privação de glicose e hipóxia induzir a morte neuronal e redução dos vasos sanguíneos, especificamente na região CA1 do hipocampo. OGD ou privação de oxigénio e durante 15 min, sozinho induziu uma forte indução de morte celular como observado por coloração com iodeto de propídio, especificamente na área CA1 do hipocampo (Figura 3), semelhante ao descrito anteriormente 7. Com marcadores para visualizar a rede de vasos sanguíneos, verificou-se que a densidade dos vasos sanguíneos e organização parece ser similar à do controlo após desafio OGD na maioria das partes da cultura com a excepção da região CA1. Há a densidade dos vasos sanguíneos foi diminuída e a rede de vasos sanguíneos foi parcialmente interrompido (Figura 3, E e F). Estas alterações ocorreram apenas na área onde a coloração com iodeto de propídio foi aumentada. O decurso de tempo das alterações vasculares paralelo ao da neurdegeneração onal. Temos estudado o curso de tempo de ambos degeneração e perda de sangue navio neuronal em CA1 usando pontos de tempo em 3 horas, 24 horas e 48 horas após a privação de oxigénio (hipoxia). Em 3 horas após a hipóxia, não houve iodeto de propídio a coloração visível e não houve mudanças presentes na arquitectura do vaso sanguíneo, indicando que neste momento não há mudanças ainda eram visíveis (Figura 4, A e B). Aos 24 hr pós hipoxia houve aparecimento de iodeto de propídio que indica a coloração de progressão de morte celular em CA1. Neste ponto de tempo da rede de vasos sanguíneos que já foi perturbado e vasos sanguíneos foram perdidos na região CA1 (Figura 4, C e D). Ambos, coloração com iodeto de propídio e a perda de vasos sanguíneos tornou-se mais pronunciado a 48 hr pós hipoxia (Figura 4, E e F). Tanto a morte neuronal eperda de vasos sanguíneos são impedidos, por bloqueio de excitação após OGD ou hipoxia. Quando combinado com tratamentos farmacológicos OGD que impediram o excesso de libertação de glutamato, foi possível salvar neurónios da morte celular induzida por OGD. O tratamento com TTX (que inibe a acção de geração potencial resultando no silenciamento de terminais aferentes) ou tratamento com CNQX (que inibem os receptores de glutamato do tipo AMPA) células piramidais de CA1 resgatados da morte neuronal (Figura 5, D e F). Estes resultados indicam que a morte neuronal após POG é mediada pela acção excitotóxica de glutamato. Após estes tratamentos, não apenas a morte das células neuronais foi impedido, mas também a integridade do vaso foi preservada e a perda de vasos sanguíneos em CA1 foi impedido (Figura 5, C e E). AMPA tratamento induz a morte neuronal excitotoxic generalizada nas bu hipocampoperda de t navio está restrita a CA1. OGD, como utilizado no presente estudo induz especificamente a morte neuronal em CA1. Em contraste, o tratamento com 100 uM durante 30 min AMPA induzida uma perda neuronal generalizada em todo o cornu Ammonis do hipocampo (CA1 e CA3) e o subiculum, mas não no giro dentado (Figura 6C). Curiosamente, a perda de vasos sanguíneos foi confinada à região CA1, apesar de uma perda neuronal no CA3 semelhante não houve perda de vasos sanguíneos na região (Figura 6D). No giro denteado não havia nem a morte, nem vaso sanguíneo perda neuronal. A quantificação da densidade de vasos confirma que os vasos sanguíneos são perdidos em CA1, mas não em outras regiões de cultura Figura 6E. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Horário da exposição POG e reperfusion. Após 5 dias em culturas in vitro são sujeitos a OGD, a hipoxia ou tratamento de AMPA. Culturas são fixadas depois de um tempo de sobrevivência de 3 horas, 24 horas e 48 horas. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Quantificação da densidade de vasos sanguíneos em diferentes regiões das culturas fatia entorhino-hipocampal. Três 6 x 6 grids (aqui mostrados como quadrados) são sobrepostas na região CA1, CA3, DG e CE. Os vasos sanguíneos que atravessam as linhas internas da grade foram contadas para cada quadrado. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" width="500" /> Figura tratamento 3. hipóxia induz a morte neuronal e perda de vasos sanguíneos em CA1. (A,C, E) culturas de controle, (B, D, F) culturas submetidas a tratamento hipóxia seguido de 48 horas de normóxia. Imunomarcação Laminin com pequeno aumento em verde (A, B), coloração PI em maior ampliação em vermelho (C. D), fundiu imagens para laminina e PI coloração em (E) e (F). Barras de escala em (B para A, B) e (F para C, D, E, F) = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Claro Tempo de alterações vasculares e neuronaldegeneração após a privação de oxigénio (hipoxia). coloração PI é mostrada na (A, C, E) vermelho, fundiu imagens para PI coloração e laminina (verde) mostrado em (B, D, F). Em 3 horas após o tratamento de hipóxia, não existe coloração PI visível e não há alterações vasculares são evidentes (A, B). Após 24 horas de coloração PI emerge e perda de vasos sanguíneos também é evidente (C, D). Ambos coloração PI e perda de vasos sanguíneos tornam-se mais evidente após 48 horas (E, F). Barra de escala em (F) = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5.; Morte neuronal e perda de vasos sanguíneos são impedidos, por bloqueadores de excitação neuronal aplicação de qualquer TTX (C, D) ou CNQX (E, F), preveniu quer a perda neuronal tal como observado com a coloração de PI (B, D, F) e dos vasos sanguíneos. perda revelado pela coloração com laminina (A, C, E). OGD sozinho induz tanto a perda neuronal e perda de vasos sanguíneos em CA1 (A, B). Barra de escala em (F) = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 morte neuronal e perda do vaso sanguíneo após tratamentos de AMPA. Tratamento com 100 uM durante 30 min AMPA induzida generalizadaperda neuronal na maioria das áreas do hipocampo (C), mas a perda de vasos sanguíneos permaneceu restrito à área CA1 (D). A barra de escala em (D) = 100 pm. A quantificação de vasos sanguíneos confirma a perda selectiva na área CA1 (E). As colunas mostram o número médio de passagens de navio, barras de erro mostram o SEM. As diferenças significativas estão indicadas com ** para p &lt;0,01. Os resultados foram obtidos a partir de três experimentos independentes com três culturas analisadas cada (n = 9) para cada região. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Ação </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> Prepare POG ou médio hipóxia </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> Perfundir o POG oumeio hipoxia com N 2 durante 1 hora numa câmara e, em seguida, vedar hipoxia e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> Alterne as culturas para meio livre de soro Neurobasal + glicose do meio de incubação, que lhes permita descansar O / N ou um dia </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Perfundir a forma OGD novamente com N 2 durante 30 min </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionar apenas as fatias saudáveis ​​para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Chupam a forma regular e adicionar meio de OGD aos poços. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para meio POG / hipóxia e para trás. Transferir a placa para a câmara de hipóxia </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Perfundir com N 2 durante 15 minutos na câmara de hipóxia </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Retire a placa da câmara. Volte para o meio Neurobasal e coloque de volta na incubadora umidificada com 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Adicionar PI e corrigir 3 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 3 horas </td></tr><tr><td> DIV 6 </td><td> Adicionar PI e corrigir 24 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 24 horas </td></tr><tr><td> DIV 7 </td><td> Adicionar PI e corrigir 48 horas após POG / hipóxia para o intervalo de 48 horas </td></tr></tbody></table> Tabela 1 hora sequência detalhada das etapas de tratamento POG / hipóxia.

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K visualizações.  University of Basel.  Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão. 

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Biologia do Desenvolvimento

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurociência

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...