Apresentamos um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes livres de tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva. Esta cultura é receptiva a realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular ou imunohistoquímica. Espera-se que contribua para a elucidação do mecanismo de neurodegeneração subjacente em doenças cerebrais associadas.
A principal vantagem dessa técnica é que é uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo clássico de cultura de fatias usando pastilhas de membrana. Embora o protocolo geral não seja complexo, algumas etapas como a remoção de meninges, colação do tecido ao disco do espécime vibratome e a ressecção para a imunohistoquímica são melhor compreendidas quando demonstradas visualmente. Ajudando a demonstrar o procedimento estarão Niele Mendes e Glaucia Almedia, que são estudantes de pós-graduação, e Giovanna Nogueira, outra estudante de pós-graduação.
Para começar este procedimento, adicione sal a um balde de gelo. Transfira a solução de fatiamento para este balde e deixe descansar sob a mistura de carbogen borbulhando por pelo menos 20 minutos antes de usar. Em seguida, prepare um bloco de 3% de agarose que é de cerca de dois centímetros por dois centímetros por dois centímetros.
Super cola o bloco de agarose no disco da amostra de vibratome, a fim de criar suporte mecânico adicional à amostra de tecido durante o corte. No vibratome, ajuste a espessura da seção para 200 micrômetros, a frequência de vibração para 100 hertz, e escolha uma velocidade de corte entre 0,5 e 1,0 milímetros por segundo. Em seguida, bloqueie a bandeja de tampão de vibratome na base do vibratome e adicione gelo para mantê-lo refrigerado antes de receber a solução de corte e a amostra e durante todo o procedimento de corte.
Primeiro, configure um aparelho de transporte que consiste em um cilindro de gás portátil contendo uma mistura de carbogen conectada a uma válvula de fluxo de pressão que controla a saída de gás conectada à tubulação de silicone que conecta a saída de gás ao navio de transporte e ao navio de transporte que contém a solução de transporte e gelo para resfriamento amostral durante o transporte. Recolher e transportar o espécime e o transporte conforme descrito no protocolo de texto. Transfira o espécime para uma placa de Petri contendo solução de corte.
Utilizando ferramentas cirúrgicas finas, remova cuidadosamente o máximo possível de meninges restantes. Escolha a melhor orientação de espécime para produzir fatias com as características particulares do design experimental e use uma lâmina de bisturi número 24 para aparar uma superfície plana para ser a base que será colada ao disco da amostra. Utilizando uma colher de plástico de disposição e pincéis delicados, colete o fragmento da placa de Petri e seque a solução em excesso com papel filtro.
Em seguida, use super cola para anexar o tecido ao prato da amostra de vibratome até que ele seja firmemente aderido ao prato e em contato com o bloco de agarose. Coloque o disco da amostra de vibratome na bandeja de tampão vibratome. Bloqueie o suporte da faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada.
Adicione a solução de corte e certifique-se de que está cobrindo o espécime e a lâmina. Em seguida, comece a cortar o espécime em fatias de 200 micrômetros. Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri contendo solução de corte e corte todas as bordas soltas e excesso de matéria branca para uma proporção de aproximadamente 70% de córtex e 30% de matéria branca.
Em um gabinete de fluxo laminar, adicione 600 microliters de cultura média a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos antes de emplacar as fatias. Depois disso, use um pincel para emplacar uma fatia em cada poço. Se houver algum poço nãoutado na placa, encha-os com 400 microliters de água estéril.
Incubar a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Suplementar 10 mililitros do meio de cultura previamente preparado com fator neurotrófico derivado do cérebro a uma concentração de 50 nanogramas por mililitro. Após oito a 16 horas, remova 333 microliters do meio condicionado de cada poço e adicione 133 microliters de meio fresco BDNF.
Substitua um terço do meio condicionado por meio complementado BDNF fresco a cada 24 horas. Primeiro, transfira as fatias dos poços que contêm meio de cultura para uma nova placa de 24 poços contendo PBS. Remova o PBS de cada poço e substitua-o por um mililitro de 4%de paraformaldeído.
Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova cuidadosamente o paraformaldeído dos poços e substitua-o por um mililitro de solução de 30% de sacarose. Incubar a 4 graus Celsius por 48 horas.
Depois de 48 horas, coloque o microtome congelante em 40 graus Celsius negativo. Prepare uma base de sacarose no estágio do microtome onde as fatias devem ser colocadas. Depois de completamente congelado, corte parte da sacarose congelada para produzir uma superfície plana na qual a fatia será colocada.
Em seguida, coloque cada fatia sobre uma película de plástico esticada e use um pincel para achatar o tecido. Em um único movimento, transfira a fatia esticada para a base de sacarose congelada. Depois que a fatia tiver descansado por cinco a 10 minutos para congelar corretamente, corte a fatia em seções de 30 micrômetros.
Transfira as seções de 30 micrômetros para uma placa de Petri contendo PBS e prossiga para um protocolo de histologia adequado para o projeto experimental. Ao determinar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas, um aspecto crítico a ser avaliado é a presença e a morfologia típica dos tipos de células neurais esperadas, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana é observada em uma fatia no dia in vitro quatro revelada pelo imunolabelamento neuronal.
Além disso, observa-se também a presença esperada de microglia e astroglia. Esses resultados demonstram que a arquitetura tecidual não é significativamente afetada nem pelo procedimento cirúrgico, pelo processamento da amostra, ou pelo curto período in vitro. A resposta neuronal à despolarização induzida pelo cloreto de potássio também foi quantificada em fatias cultivadas seguindo a fosforilação ERK.
Curiosamente, um claro aumento na fosforilação ERK é visto em fatias tratadas com cloreto de potássio no dia quatro in vitro. Finalmente, a resposta de fatias no dia 4 a um desafio tóxico é avaliada com um conhecido peróxido de hidrogênio indutora de estresse oxidativo. Expor as fatias a peróxido de hidrogênio de 300 mililitros por 24 horas levou a uma redução robusta na redução de MTT.
Juntos, a morte celular maciça observada no dia in vitro cinco fatias após o desafio do peróxido de hidrogênio e os resultados de despolarização induzidos pelo cloreto de potássio indicam a saúde geral preservada das fatias no dia 4 in vitro que respondem a um estímulo tóxico, como o estresse oxidativo. Este protocolo é dedicado principalmente a estudos baseados em ensaios com duração de uma semana, como a investigação de mecanismos moleculares de neurotoxicidade e neuroproteção por drogas candidatas. Embora este protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico para epilepsia do lobo temporal micro resistente, é provável que o tecido coletado de outras regiões ou condições cerebrais também possa ser fonte para produzir culturas de fatias flutuantes livres.
Culturas de fatias do cérebro humano adulto podem ser fundamentais para avançar nossa compreensão das neuropatologias humanas devido aos seus circuitos celulares únicos e máquinas moleculares carentes de fatias produzidas a partir de cérebros de roedores.
