Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.

Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi. 1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma <ol><li> Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır. <ol><li> Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış tezgah steril koşullar altında tüm adımları uygulayın. </li><li> Septorinoplastiyi zamansal ekseni boyunca dilimin konumundan muhtemel müdahaleyi önlemek için, yalnızca hipokampal septal yarısı dilim kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> T kestiO cerrahi makas ile bir P4 fare yavru kafa. Resim anestezi Bu aşama için gereklidir. <ol><li> Beyin çevresinde kafatası çıkarın ve hemisferdeki ve orta beyinin kaudal ucu arasındaki fissür tespit. Dikkatle kafatasından orta beyin beynin rostral bir kısmını çıkarmak ve L-glutamin, stabilize edilmiş bir formu ile takviye edilmiş MEM oluşan buzla soğutulmuş Müstahzar ortamda yerleştirin. </li></ol></li><li> Beyin, buz gibi hazırlama ortamına daldırılmış edilir bir stereo mikroskop altında diseksiyon devam edin. Kortikal hemisferden kalan meninks çıkarın. Yarımkürenin orta kaudal yüzeyinde hipokampus belirlenmesi ve beynin geri kalanından komşu entorhinal korteks ile birlikte ayırın. <ol><li> Bir doku helikoptere doku aktarın ve hipokampus septorinoplastiyi-zamansal eksene aseptik koşullar altında çaprazlama 400 mikron kalınlığında dilimler kesilir. </li></ol></li><li> Ce üzerinde dilimlerini yerleştirinll kültür ekleri (yaklaşık 6 uç başına dilim) ve inkübasyon ortamının (47 mi, MEM, 25 mi Eagle Medium, oyuk başına 1 mi, 25 mi at serumu, bir 1 ml Glutamax I, 1 ml &#39;si ile 6-yuvalı plakalar içinde inkübe bunları 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde ve steril% 10 glükoz çözeltisi, pH 7.3). Konusu orta ertesi gün ve 1 hafta sonra her gün yukarı değiştirin. </li></ol> REPERFÜZYONUNDA Vitro Hipokside 2. ve Oksijen-glukoz Yoksunluk <ol><li> Prosedürün tam bir zaman çizelgesi için Tablo 1&#39;e bakınız. Hipoksi ve OGD&#39;ye maruz bırakılmadan önce 5 gün boyunca (DIV5) için kültür EHOSCs. Bu zaman noktasında, aşağıdaki bileşim ile serum içermeyen ortam,% 25 at serumu ihtiva eden inkübasyon ortamından orta geçiş: Neuro temelli vasat% 2 B27 takviyesi,% 1 Glutamax ve ilave% 0.1 glukoz ile birlikte. </li><li> Referans 7 bileşenlerin .The son konsantrasyonları ayrıntılı olarak aşağıdaki gibi olacaktır OGD ortamı hazırlayın: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5.25 mM NaHCO 3, 70 mM KCI, pH 6.8, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 ve 10 mM sukroz. Iki adet 6 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna OGD, ortamın 1 ml ilave edilir. <ol><li> Hipoksi bir odasında 1 saat süreyle N2 ile OGD, orta serpmek ve daha sonra sızdırmaz hale getirir ve tutmak O / 37 ° C&#39;de bir kuluçka K. </li><li> Hipoksik göstergeleri olarak anaerobik şeritler kullanın. Şeritlerin rengi beyaz pembeden değiştirildiğinde oksijensiz ortama düşünün. </li><li> Hypoxia, yerine OGD, ortamın glikoz ile serumsuz ortamı kullanmaktadır. Kullanmadan önce, OGD, orta kısmında anlatıldığı şekilde bir bölme hipoksi halinde N2 ile orta serpmek. </li></ol></li><li> Dilimleri OGD&#39;ye maruz kalan önce, 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek. 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml &#39;lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve seçmek, 2 uldeney için, sadece sağlıklı dilim PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi. </li><li> . OGD maruz kalma ve reperfüzyon Şekil 1&#39;de gösterildiği zamanlamasını kullanın 15 dakika boyunca ya oksijen sadece (hipoksi) veya oksijen ve glikoz (OGD) dilimleri mahrum. <ol><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye indüksiyonu için OGD ortamına dilim aktarmak ve hipoksi odası içinde 15 dakika için tutun. Kültürler, orta ve arka OGD düzenli ortamından açıldığında, insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun. </li><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye sonra, oksijenli serum barındırmayan ortam maddesi ile OGD, orta yerine ve kültürler,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de normal inkübatörde serum barındırmayan ortam içinde 3, 24 veya 48 saat süre ile iyileşmelerine izin verilir. Hücre ölümü tespiti için tespit için önce yeniden PI ekleyin. </li></ol></li></ol> Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler 3. Farmakolojik Tedaviler <ol><li> Kültürfarmakolojik tedavilere maruz bırakılmadan önce, kuluçkalama ortamı içinde 5 gün (DIV5) e EHOSCs. Farmakolojik tedaviler sırasında veya hemen OGD&#39;ye dilim serumsuz ortama transfer zaman sonra OGD, ya başlatın. </li><li> OGD&#39;ye koruması için Tedaviler. <ol><li> OGD, 30 dakika boyunca, indüksiyondan sonra hemen 100 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) ya da (15 dk) OGD, indüksiyon sırasında kültür ortamına 1 uM Tetrodotoksin (TTX) veya ekleyin. Daha sonra, tespitten önce, 48 saat boyunca normoksik, serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilir. </li></ol></li><li> Eksitotoksik ölüme indüksiyonu için tedaviler. <ol><li> Kuluçka ortamı anahtar kültürlerinde 5 gün sonra, 30 dakika boyunca 100 uM, (RS) -α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) içeren içermeyen ortam serum. </li><li> Aspirasyon (ekler üzerinde herhangi bir kalıntı orta kaldırmak için özen) tarafından AMPA içeren kültür ortamı çıkarın, sonra da normal serum serbest orta ve taze plakaları dilim aktarmakfiksasyon kadar 48 saat boyunca saklayın. </li></ol></li></ol> 4. Fiksasyon ve immün Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler <ol><li> Propidium iyodür (PI) boyama. <ol><li> 2 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda canlı dilimlerin kültür ortamına PI, 30 dakika boyunca ilave edin. Floresan optik ile donatılan bir ters mikroskop ile canlı kültürler el ve daha fazla tedavi için dilim seçmek. Immünhistokimya ile birlikte PI boyama için, önce kültürlerin tespit PI boňaltılması 30 dakika ekleyin. </li></ol></li><li> Dilimleri Fiksasyon. <ol><li> 6-delikli plaka kültür Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA), 3 ml ekleyin. Daha sonra, bir buzdolabı içinde 6 oyuklu plaka yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de O / N düzeltin. </li><li> PFA çözüme ertesi gün çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dilimleri 3-4 kez yıkayın. </li></ol></li><li> Hücre kültürü i ikinci dilim uzaklaştırılmasınsert ve serbest yüzen bölümlerinin imünohistokimya için engelleme prosedürü. <ol><li> Dikkatlice ayırın ve boyutu 0 veya daha küçük bir sanat boya fırçası kullanılarak kültürü ekler gelen dilim çıkarın. (% 3 normal keçi serumu (NGS) ve 2% Triton-X100 ile PBS) ile bloke edici tampon ile doldurulmuş bir 96 gözenekli plakanın bir kuyuya her bir dilim aktarın. Orbital bir karıştırıcı ile sabit çalkalama altında, oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon dilimleri tutun. </li></ol></li><li> Dilim kültürlerin immün <ol><li> Etiketleme için kan damarları 1 bir seyreltme poliklonal anti-laminin kullanın: 200 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. </li><li> PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 içeren 500: etiketleme nöronlar 1 bir seyreltme proteini 2 (MAP2) ilgili anti-mikrotübül kullanın. </li><li> Sürekli çalkalama ile 4 ° C&#39;de 48 saat için primer antikorlar ile inkübe dilimleri. İnkübasyon süresinden sonra, 3-4 kez,% 0.5 Triton-X100 ile PBS ile yıkayın. </li&gt; <li> İkincil antikorlar 1 seyreltin: 500 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. Alexa fluorofor konjüge sekonder antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe dilimleri. Alexa 350 veya 488 konjuge uygun keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare ikincil antikoru kullanın. </li><li> Ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) ile dilimleri üç defa yıkamak; cam slaytlar takar ve Mowiol ile slaytlar lamel. </li></ol></li><li> Lekelenmiş dilimlerin Mikroskopi </li><li> Epifloresans donanımları ile standart bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile ya lekeli dilimleri gör. Uygun bir kamera ile çektiğiniz görüntüleri. Bazı görüntüler için, parlak arka planda koyu renkte boyalı gemileri elde etmek için floresan kontrast (Şekil 5 ve 6) ters çevirin. </li></ol> Kültürlerin Bölgesel Gemi Yoğunluk 5. Belirlenmesi <ol><li> Vesse niceliğiniReferans 8&#39;de tarif edildiği gibi kap geçişleri göre L. yoğunluğu. </li><li> Bu ölçümler için laminin lekeli dilimleri kullanın. Her grid kare başına 100 x 100 mikron, 0.25 mm 2 toplam alanına eşit bir 6 x 6 ızgara ile 10X büyütme Kayıtlı görüntüleri üst üste. </li><li> CA1, CA3, DG ve AK bölgede bindirme böyle üç ızgaraları (Şekil 2). Izgara çizgileri geçen gemileri saymak. </li><li> İyi bir istatistik alaka ile sonuç elde etmek için, fare yavru başına 3 dilim ile 3 fare yavrular, en az 3 bağımsız deneyde dahil her veri ölçümlerini yapmak. </li><li> Her bölge için ızgaralardan damar geçişlerinin ortalama değerini belirler ve uygun istatistik yazılımı kullanılarak (anlamlı olarak tanımlanan p &lt;0.05) post hoc test olarak Bonferroni düzeltmeli ANOVA ile istatistiksel analiz yapmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Ayrıca, dilim kültür yaklaşımı sadece iskemik meydan sonuçlarını okuyan değil verir ama aynı zamanda nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test için izin verir. Dilim kültürler nedenle iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araçtır. Burada sunulan yöntem, ha tüm laboratuvarlar için uygulamak kolayMSS dilim kültürleri ile bazı deneyimi Ving. OGD veya hipoksinin uygulayarak yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için N2 ile kültür ortamına dikkatli bir şekilde dengelenmesini gerektirir. Ayrıca bir ön OGD&#39;ye uygulanmasından PI-pozitif hücre düşük sayıda tek kullanım alanı dilim kültürlerinin önemlidir. Hipoksi koşulları (yani uygulandığı ve hipoksi için zaman OGD) çeşitli ve ikinci dilim kültür tipine göre optimize edilebilir. Iskemi nöronal tepkiler olarak çalışılırken yaygın hipoksik-iskemik beyin hasarı sonrası damar değişiklikleri hakkında az bilgi mevcuttur orada sadece. Bir hafta kadar 8, 9 hipokampal organotipik dilim kültürlerin 10 ortamda hipoksi mücadeleden sonra damar değişiklikleri incelemek için fırsat açtı boyunca kan damarları ve kan beyin bariyerinin bile belirteçleri bulma organotipik dilim kültürlerde tutulur. Tabii ki gerekiyordilim kültürlerde tutulur gemilerin perfüze olmadığını fark edilebilir. Ayrıca, daha önceden var olan kan damarlarının-yerine, yeni kan damarlarının oluşumu geniş kaybına farklılıklar gözlenmiştir. Bu model sistemi, büyük ihtimalle, bu nedenle, bu değer iskemik zedelenmeden sonra, yeni damar oluşumu çalışmak için optimal değildir. Olasılık nöronlar arasındaki karmaşık etkileşimin daha aydınlatılması için organotipik hipokampal dilim kültürleri kullanmak ve damar çalışma yeni bir alan açar ve sonrası özellikle serebral iskemi, daha iyi bir anlayış sağlanması ve nörovasküler bozukluklar için yeni tedavi seçenekleri gelişmekte yardım sözü verdi inme.

Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikleri gibi serebral iskemi ile ilgili deneysel modellerinin kullanımına dayalı (güncel bir değerlendirme için bakınız 2). Buna paralel olarak,, aynı zamanda, sınırlama ve hayvan modellerinde, çeşitli merkezi sinir sistemi dokuların Organotipik kesit kültürünün kullanımı ile etik kaygılar Stu izin veren kullanılmıştıryaralanma 3-5 çeşitli tip nöronal reaksiyonların dy. Iskemik beyin yaralanmasının taklit koşullarda nöronal reaksiyonun incelenmesi için, oksijen glikoz yoksunluğu model sistem (OGD) geliştirilmiştir. Bu modelde, dilim kültürler geçici olarak glikoz yoksun ve oksijenin yokluğunda azot gazı ile dengeye getirilmiş olan bir ortama maruz bırakılır. Bu tür bir işlem ile, in vivo 6, 7 iskemik yaralanma sonrası gözlenen ile oldukça benzer nöronal yaralanma ve kaybını uyarmak mümkündür. Hipokampta, böyle bir tedavi olarak, özellikle CA1 nöronal kaybı uyarmaktadır ama CA3 alan veya hipokampus dentat girus. Bunun aksine, kesit kültürlerinde vasküler reaksiyonların Bu güne kadar geniş ele edilmemiştir. Bir belirgin bir neden dilim kültürü modelinde dolaşım ve kan damarı perfüzyon olmamasıdır. Bununla birlikte, bu B korumak mümkün olduğunu göstermiştikMSS lood gemiler 9, birkaç gün 8 kültürleri dilim. Bu yöntemin genel amacı OGD&#39;ye sonra nöronların kaderi izlemek, ancak yaralanma yanıtın önemli bir parçası olan damar kaderi ve biçimlenme çalışma genişletmek için değil sadece. Şimdiye kadar bu tür çalışmalar, hayvan deneylerinde kullanımını gerektirmiştir (. De Jong ve arkadaşları, 1999; Cavaglia ve diğerleri, 2001.). Protokol Burada yer olarak, bu tür çalışmalar, hipoksi ile birlikte ya da her ikisi nöronal hayatta kalma ve damar reaksiyonlarının analizi ile takip eksitotoksik lezyonlar ya meydan entorhino-hipokampal kesit kültürlerinde Organotipik detay yapılabilir nasıl. Bu protokol, bu konuda 10 önceden yayımlanan bir çalışmada dayanmaktadır ve MSS nörovasküler etkileşimleri ilgilenen herhangi bir laboratuvar için yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilized form of L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobic strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.

Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 &#39;e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve kurum CA1 bölgesinde hariç kültür çoğu bölümünde OGD cebine kontrolüne benzer olmuştur olduğu bulunmuştur. Damar yoğunluk azalma oldu ve kan damar ağı kısmen (Şekil 3, E ve F) kesilmiş olabilir. Bu değişiklikler sadece propidyum iyodid lekeleme artmıştır bölgesinde görüldü. Vasküler değişikliklerin zaman ders Neur paralellikonal dejenerasyon. Bu, 3 saat, 24 saat ve oksijen tükenmesi (hipoksi) sonra 48 saat zaman noktalarında kullanılarak CA1 hem nöronal dejenerasyon ve damar kaybı zaman sürecini inceledik. 3 saat sonrası hipoksi, hiçbir propidiyum iyodür boyama görünür oldu ve şu anda herhangi bir değişiklik görülüyordu henüz belirten damar mimarisi mevcut hiçbir değişiklik (Şekil 4, A ve B) vardı. 24 saat sonrası hipoksi &#39;de CA1 bölgesindeki hücre ölümü sürecini gösteren propidyum iyodid lekeleme görünümü oldu. Bu zaman noktasında kan damarlarının ağ zaten bozulmuş ve kan damarları CA1 bölgesinde (Şekil 4, C ve D) olarak kaybedilmiştir. Hem propidiyum iyodür boyama ve kan damarı kaybı (Şekil 4, E ve F) 48 saat sonrası hipoksi daha belirginleşmiştir. Nöronal ölüm hemkan damarı kaybı OGD&#39;ye veya hipoksi sonra uyarma engelleyerek önlenir. Biz aşırı glutamat engelledi farmakolojik tedaviler ile OGD birleştirildiğinde, OGD kaynaklı hücre ölümünden nöronlar kurtarmak mümkün olmuştur. Nöronal ölümlere (Şekil 5, D ve F) ile birlikte ya da tedavi CNQX (AMPA-tipi glütamat reseptörlerini inhibe eden) kurtarıldı CA1 piramidal hücreleri (aksiyon potansiyeli iletici terminalleri susturulması sonuçlanan üretimini inhibe eden) TTX ile tedavi. Bu sonuçlar, OGD&#39;ye nöronal ölüm glutamat eksitotoksik hareketi ile aracılık ettiğini göstermektedir. Bu işlemlerden sonra, sadece nöron hücresi ölümü önlenmiştir, ama aynı zamanda kap bütünlüğünün korunması ve CA1 bölgesindeki kan damarlarının kaybı (Şekil 5, C ve E) önlenmiştir. AMPA tedavi hipokampus met yaygın Eksitotoksik nöron ölümünü indüklert damar kaybı CA1 sınırlıdır. Bu çalışmada kullanılan OGD CA1 spesifik nöronal ölüme neden olur. Buna karşılık, 30 dakika boyunca 100 uM AMPA ile tedavi, ancak kıvrımlarının (Şekil 6C) hipokampusun (CA1 ve CA3) ve subikulum tüm cornu ammonis yaygın bir nöron kaybında. İlginçtir, kan damarı kaybı bu bölgede (Şekil 6D) hiçbir kan damarı kaybı oldu CA3 benzer nöronal kaybına rağmen, CA1 bölgesinde sınırlı oldu. Kıvrımlarının içinde ne nöronal ölüm, ne kan damarı kaybı oldu. Damar yoğunluğu ölçümü kan damarları değil kültürün Şekil 6E diğer bölgelerinde, CA1 kayıp olduğunu onaylar. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig1highres.jpg" width="500" /> OGD maruz kalma ve reperfusio Şekil 1. Takvimi: n. vitro kültürlerinde 5 gün OGD, hipoksi veya AMPA işlemine tabi sonra. Kültürler 3 saat, 24 saat ve 48 saat bir yaşam süre sonra sabitlenir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig2highres.jpg" width="500" /> Entorhino-hipokampal dilim kültürlerin farklı bölgelerinde kan damarı yoğunluğu Şekil 2. Kantitasyonu. (Burada kareler olarak gösterilen) Üç 6 x 6 ızgaraları CA1, CA3, DG ve AK bölgede üst üste. Izgaranın iç sınırı aşması damarlar, her kare için sayıldı. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. Hipoksi tedavisi, nöronal ölüm ve CA1 bölgesindeki kan damarı kaybı uyarmaktadır. (A,C, e) kontrol kültürleri (B, D, F) kültür normoksiyada 48 saat, ardından hipoksi muamelesine tabi tutulmuştur. Yeşil düşük büyütmede laminin immünoboyamasıdır kırmızı (C D) yüksek büyütmede (A, B), PI boyama, (E) laminin ve PI boyama görüntüleri birleşti ve (F). Ve (A, B için B) Ölçek bar = 100 mikron (C, D, E, F F). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" width="500" /> Vasküler değişiklikler ve nöronal Şekil 4. Zaman kursuOksijen yoksunluğun (hipoksi). (A, C, E) gösterilen kırmızı PI boyama sonra dejenerasyon, (B, D, F) gösterilen PI boyama ve laminin (yeşil) için görüntüleri birleşti. 3 saat sonrası hipoksi tedavi de, orada görünür hiçbir PI boyama ve hiçbir vasküler değişiklikler (A, B) belirgindir. 24 saat PI boyama ortaya çıkan ve kan damarı kaybı da (C, D) sonra belirgin. PI boyama ve kan damarı kaybı hem de 48 saat (E, F) sonra daha belirgin hale gelir. (F) Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,., Nöronal ölüm, ve damar kaybı nöronal uyarım blokerleri ile önlenmektedir PI boyama (B, D, F) ve damar ile görüldüğü gibi TTX (C ve D) ya da CNQX (E, F) her iki nöron kaybı önlenir ya da uygulanması. Laminin zarar lekelemesi (A, C, D) ile ifade edilir. OGD, tek başına CA1 nöronal kayıp ve kan damarlarının kaybı (A, B) her ikisi de neden olur. (F) Ölçek çubuğu 100 mikron =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Nöronal ölüm, ve damar kaybı, AMPA sonra değerlendirildi. Yaygın kaynaklı Tedavi 100 uM AMPA ile 30 dakika boyuncanöronal hipokamp (C) pek çok alanda kaybı, fakat kan damarlarının kaybı alanı CA1 (D) sınırlı kalmıştır. (D) Ölçek çubuğu 100 mikron =. Kan damarlarının miktar CA1 bölgesinde (E) &#39;de seçici kaybı teyit etmektedir. Sütunlar gemi geçişleri, SEM gösteren hata çubukları ortalama sayısını gösterir. Önemli farklılıklar p &lt;0.01 ** ile gösterilir. Sonuçlar üç analiz kültürleri ile üç bağımsız deneyler türetilen her (n = 9), her bölge için. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775"><tbody><tr><td> Zaman </td><td> Eylem </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> OGD veya hipoksi ortamı hazırlayın </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> OGD serpmek veyadaha sonra 1 hipoksi bir odasında saat ve N2 ile hipoksi orta kapatılır ve 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde O / N tutmak </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> , Inkübasyon ortamından Neurobasal serum serbest ortamı + glikoz kültürleri geçin onları O / N veya 1 gün dinlenmek için izin </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> 2 ul 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml &#39;lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi deney için, sadece sağlıklı dilim seçmek </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Düzenli orta emmek ve kuyulara OGD orta ekleyin. Kültürler arka OGD / hipoksi ortamına normal ortamından açılır ve zaman insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun. Hipoksi odasına plaka transfer </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Hipoksi bölmesi içinde 15 dakika süreyle N2 ile perfüze </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Odasından plakasını çıkarın. Geri Neurobasal orta geçin ve% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör geri koyun </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> PI ekleyin ve 3 saat aralığı için OGD / hipoksi 3 saat sonra düzeltmek </td></tr><tr><td> DIV 6 </td><td> PI ekleyin ve 24 saat aralığı için OGD / hipoksi 24 saat sonra düzeltmek </td></tr><tr><td> DIV 7 </td><td> PI ekleyin ve 48 saat aralığı için OGD / hipoksi sonra 48 saat düzeltmek </td></tr></tbody></table> OGD / hipoksi tedavisi için adımlar Tablo 1. ayrıntılı zamanı dizisi.

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Görüntüleme.  University of Basel.  Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır. 

Video: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Gelişim Biyolojisi

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...