עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת באזל, המחלקה ליו, והקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_141007). מרקוס Saxer סיפק תמיכה טכנית.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 22 ספטמבר 2010 (2010/63 / איחוד אירופי) ונסקרו והתיר על ידי הרשויות שוויצרית. .1 הגדרת תרבויות פרוסה Organotypic Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס (EHOSCs) מגורי 4 עכבר היום (P4) לאחר לידה באמצעות 4,11 שיטת הדגירה סטטי. כאן, להשתמש בעכברי C57BL6 וCB6F1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כ 30 דקות לכל גור עכבר להכנת תרבויות פרוסה, כלומר, 3 שעות להמלטה של 6 גורי עכבר. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים בזרימה שולחן עבודה מינרית עם מכשירי ניתוח עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להימנע מהפרעות אפשריות מהעמדה של הפרוסה לאורך ציר septo-זמני, להשתמש רק בהיפוקמפוס פרוסות של חצי במחיצה. אם לא צוין אחרת, לבצע את כל הצעדים על RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את tהוא בראש של גור עכבר P4 עם מספריים כירורגיות. אין הרדמה נדרשת לצעד זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגולגולת סביב המוח ולזהות את הסדק שבין סוף הזנב של אונות המוח והמוח התיכון. מוציא בזהירות את החלק ממקורי המוח אל המוח התיכון, מהגולגולת ולמקם אותו במדיום הכנה קר כקרח בהיקף של MEM השלים עם טופס התייצב של L-גלוטמין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לנתיחה תחת סטראו עם המוח להיות שקוע בבינוני הכנה קרה כקרח. הסר קרומי המוח שנותר מההמיספרות בקליפת המוח. זהה את ההיפוקמפוס במשטח הזנב המדיאלי של האונה ולהפריד אותו יחד עם קליפת entorhinal הסמוכה משאר המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה לרקמת מסוק ולחתוך 400 מיקרומטר פרוסות עבות תחת רוחבי תנאי ספטית לציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפרוסות על ceהתרבות מוסיף ll (כ 6 פרוסות לכל הכנס) ו דגירתם ב6 צלחות גם עם 1 מ&quot;ל לכל טוב של מדיום דגירה (47 מ&quot;ל MEM, 25 מ&quot;ל נשר בינוני, 25 מ&quot;ל סרום סוס, 1 מ&quot;ל Glutamax אני, 1 מ&quot;ל של פתרון סטרילי 10% גלוקוז, pH 7.3) באווירת humidified עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן בכל יום אחר שלשבוע 1. </li></ol> .2 במבחנה היפוקסיה והחמצן גלוקוז מניעת עם reperfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה טבלת מס &#39;1 ללוח זמנים מדויקים של ההליך. EHOSCs תרבות במשך 5 ימים (DIV5) לפני החשיפה להיפוקסיה או OGD. בנקודה זו בזמן לעבור בינוני ממדיום דגירה המכיל 25% בסרום סוס סרום בינוני חינם עם ההרכב הבא: בינוני Neurobasal עם 2% תוסף B27, Glutamax 1% וגלוקוז 0.1% נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום OGD כמפורט ב7 .the ריכוזים סופיים של רכיבי הפניה יהיה הבא: 0.3מ&quot;מ CaCl 2, 70 mM NaCl, 5.25 מ&quot;מ NaHCO 3, 70 מ&quot;מ KCl, 1.25 סוכרוז מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 2 מ&quot;מ MgSO 4, ו10 מ&quot;מ בpH 6.8. הוסף 1 מ&quot;ל של מדיום OGD היטב כל אחד משני לוחות תרבית רקמה 6 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse בינוני OGD עם N 2 עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברצועות אנאירובי כאינדיקטורים חוסר חמצן. קחו למשל את המדיום להיות חמצן חופשי כאשר את הצבע של הרצועות השתנה מורוד ללבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של היפוקסיה, להשתמש בינוני סרום ללא עם גלוקוז במקום בינוני OGD. לפני השימוש, תנקב בינוני עם N 2 בתא היפוקסיה, כמפורט לעיל למדיום OGD. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני פרוסות נחשפות לOGD, תנקב בינוני OGD שוב עם N 2 למשך 30 דקות. הוסף 2 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחררק פרוסות בריאים לניסויים כפי שצוינו על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוח הזמנים של חשיפת OGD וreperfusion מצויינים באיור 1. לשלול פרוסות או חמצן בלבד (היפוקסיה) או חמצן וגלוקוז (OGD) במשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של היפוקסיה או OGD, להעביר פרוסות לתוך מדיום OGD ולשמור במשך 15 דקות בתא היפוקסיה. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD ובחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היפוקסיה או OGD, להחליף את מדיום OGD עם מדיום סרום ללא מחומצן ותרבויות מותר להתאושש במשך 3, 24 או 48 שעות במדיום סרום ללא בחממה הרגילה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. להוסיף PI שוב לפני קיבוע לקביעת המוות של תאים. </li></ol></li></ol> 3 טיפולים תרופתיים של תרבויות Organotypic Slice Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CulturEHOSCs דואר במשך 5 ימים (DIV5) במדיום דגירה לפני החשיפה לטיפולים תרופתיים. התחל טיפולים תרופתיים או במהלך OGD או מייד לאחר OGD כאשר פרוסות מועברות למדיום חופשי בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים להגנה מפני OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מיקרומטר 6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-דיונה (CNQX) או tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) למדיום התרבות במהלך האינדוקציה OGD (ל15 דקות) או מייד אחרי גיוס OGD ל30 דקות. ואז, דגירה במדיום סרום ללא normoxic ל48 שעות לפני הקיבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים לזירוז מות הפעלת יתר רעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים בתרבויות מתג בינוני דגירה לסרום מדיום חופשי המכיל 100 מיקרומטר (RS) -α-אמינו-3-הידרוקסי 5-methyl-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות המכיל AMPA על ידי שאיפה (דואג להסיר כל מדיום שיורית על מוסיף), ולאחר מכן להעביר את הפרוסות לצלחות טריות עם מדיום סרום נורמלי חופשי ולשמור אותם ל48 שעות עד קיבעון. </li></ol></li></ol> .4 תרבויות Organotypic Slice קיבוע וImmunostaining של Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יודיד Propidium מכתים (PI). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף PI ל30 דקות למדיום התרבות של פרוסות המתגוררות בריכוז של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. צפה תרבויות לחיות עם מיקרוסקופ הפוך מצויד באופטיקה הקרינה ובחר פרוסות לטיפולים נוספים. עבור מכתים PI בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, להוסיף פתרון PI 30 דקות לפני הקיבוע של התרבויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של הפרוסות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מצלחת 6 היטב ולהוסיף 3 מ&quot;ל של paraformaldehyde מוכן טרי 4% (PFA) זה טוב. לאחר מכן למקם את צלחת 6 היטב במקרר ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PFA ביום שלמחרת ולשטוף את הפרוסות 3-4 פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת פרוסות מi תרבית תאיםnsert והליך חסימת אימונוהיסטוכימיה סעיפים ריחוף ללא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בזהירות ולהסיר את הפרוסות מהתרבות מוסיף באמצעות מברשת צבע אמנות של הגודל 0 או קטנים יותר. העבר את כל פרוסה בודדת לתוך באר של צלחת גם 96 מלאות בחסימת מאגר (PBS עם 3% בסרום נורמלי עז (NGS) ו -2% Triton-X100). שמור את הפרוסות במאגר החסימה לשעה 2 ב RT תחת תסיסה המתמדת של שייקר מסלולית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining של התרבויות הפרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג כלי דם להשתמש אנטי laminin polyclonal בדילול של 1: 200 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים תיוג להשתמש אנטי microtubule הקשורים החלבון 2 (MAP2) בדילול של 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הפרוסות עם נוגדנים ראשוניים ל48 שעות ב 4 ° C. עם תסיסה מתמדת. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף אותם בPBS עם 0.5% Triton-X100 ל3-4 פעמים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים משני 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. דגירה את הפרוסות לשעה 2 ב RT בחושך עם הנוגדנים משני מצומדות fluorophore Alexa. השתמש נגד הארנב המתאים העז או נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומדת לAlexa 350 או 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שנאגר מלוח טריס (TBS); לעלות אותם על שקופיות זכוכית וcoverslip השקופיות עם Mowiol. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופית של פרוסות המוכתמות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה פרוסות המוכתמות או במיקרוסקופ רגיל עם ציוד epifluorescence או עם מיקרוסקופ confocal. קח תמונות עם מצלמה מתאימה. עבור חלק מתמונות, להפוך את ניגוד הקרינה כדי להניב כלי קדרות צבעוניים על רקע בהיר (איורים 5, 6). </li></ol> .5 קביעת צפיפות כלי אזורית בתרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את vesseצפיפות l מבוססת על מעברי כלי כפי שמתואר בעיון 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפרוסות מוכתמות עבור laminin למדידות אלה. להרכיב תמונות מוקלטות של 10X הגדלה עם רשת 6 × 6, שבו כל רשת שווה לכל מ&quot;ר 100 x 100 מיקרומטר, שדה כולל של 0.25 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש רשתות כיסוי כזה באזור CA1, CA3, DG, וEC (איור 2). לספור את כלי חוצים את הקווים של הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות עם רלוונטיות סטטיסטיות טובות, לבצע מדידות בלפחות 3 ניסויים בלתי תלויים, כל נתוני, כולל מ3 גורי עכבר עם 3 פרוסות לגור עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הערך של מעברי כלי הממוצע מרשתות לכל אזור ולבצע ניתוח סטטיסטי על ידי ניתוח שונה עם תיקון Bonferroni כמבחן post hoc (p &lt;0.05 המוגדרים משמעותי כ) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית מועצת יום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ונסקרו והתירו על ידי הרשויות שוויצרית. יש לי המחברים אין לחשוף.

עם השיטות שהוצגו כאן, ניתן להשתמש בתרבויות פרוסה organotypic היפוקמפוס ככלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. בעוד תרבויות הפרוסה organotypic היו בשימוש בעבר ללימוד תגובות עצביות לאחר איסכמיה 6, 7 ההיבט החדש של המחקר בו זמני של שינויים בכלי הדם משפר באופן משמעותי את היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. יתר על כן, גישת התרבות הפרוסה מאפשרת לא רק לומדת את ההשלכות של אתגר איסכמי אלא גם מאפשרת לבדיקה של אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection. תרבויות פרוסה לכן הם כלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי. השיטה המוצגת כאן היא קלה ליישום לכל המעבדות חהוינג קצת ניסיון עם תרבויות פרוסה במערכת העצבים המרכזית. החלת OGD או היפוקסיה דורשת איזון זהיר של מדיום התרבות עם N 2 על מנת להשיג תוצאות לשחזור. כמו כן, חשוב לתרבויות פרוסה שימוש רק עם מספר נמוך של תאי PI-חיובי לפני היישום של OGD. התנאים של חוסר חמצן (כלומר, הזמן שבי היפוקסיה או OGD מיושמים) יכול להיות מגוונים ומותאם בהתאם לסוג של התרבות הפרוסה בשימוש. בעוד תגובות עצביות לאיסכמיה נחקרו רב יש רק מעט מידע זמין על שינויים בכלי הדם לאחר פגיעה מוחית חוסר חמצן-איסכמי. מציאת שכלי דם ואפילו סמנים של מחסום דם המוח נשמרים בתרבויות פרוסה organotypic לתקופה של עד שבוע 8, 9 פתחו את ההזדמנות ללמוד שינויים של כלי הדם לאחר אתגר היפוקסיה בהגדרה של תרבויות הפרוסה organotypic היפוקמפוס 10. כמובן שזה צריךלהיות הבין שהכולים שנשמרים בתרבויות פרוסה אינם perfused. יתר על כן, יש לנו ציינו הבדלים באיבוד דם כלי קיימים מראש ולא ההיווצרות נרחבת של כלי דם רומן. מערכת מודל זה היא, לכן, סביר להניח שלא אופטימלי לחקר היווצרות כלי חדש אחרי עלבון איסכמי. האפשרות להשתמש בתרבויות הפרוסה בהיפוקמפוס organotypic להבהרה נוספת של יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וכלי הדם פותח שדה חדש של מחקר ומבטיח לעזור השגת הבנה טובה יותר של ופיתוח אפשרויות טיפול חדשות לטיפול בהפרעות עצבים וכלי דם, באיסכמיה מוחית בפרט לאחר שבץ.

מערכת העצבים המרכזית היא רגישה במיוחד לאובדן או הפחתה של חמצן ואספקת הגלוקוז על ידי מערכת כלי הדם. אפילו הפרעה קצרה ולא של אספקת דם למוח יכולה לגרום לאובדן קבוע של תפקוד של אזורי המוח הרלוונטיים מובילים לתסמונות שבץ טיפוסיות. בנוסף לאובדן העצבי באזורים שנפגעו העיקריים, יש בדרך כלל הוא אובדן עצבי המאוחר נוסף באמצעות נזק המשני. לרוע המזל עד עכשיו, אין טיפול נוירו להפחתת מוות עצבי המשני היה זמין 1. מאמצי מחקר לחקר המנגנונים של נזק משני מסתמכים על השימוש במודלים של בעלי החיים של איסכמיה המוחית כמו עורקים התיכון ספיגה מוחין וטכניקות שונות טרומבוטיים חסימה (לסקירה האחרונה לראות 2). במקביל, גם בשל מגבלות וחששות אתיים עם השימוש במודלים של בעלי חיים, התרבות הפרוסה organotypic של רקמות CNS השונות היה בשימוש המאפשר סטהdy של תגובות עצביות לסוג שונים של פציעות 3-5. ללימוד התגובה העצבית בתנאים המחקים פגיעה מוחית איסכמי, מערכת המודל של חסך גלוקוז החמצן (OGD) פותחה. במודל זה, תרבויות פרוסה באופן זמני נחשפו למדיום שחסר גלוקוז וכבר equilibrated עם גז חנקן בהיעדר החמצן. עם טיפול כזה, ניתן לגרום לפגיעה עצבית ואובדן שהוא די דומה לזה שנצפה לאחר פגיעת איסכמית in vivo 6, 7. בהיפוקמפוס, טיפול כזה גורם לאיבוד עצבי במיוחד בCA1, אך לא ב אזור CA3 או gyrus המשונן של ההיפוקמפוס. בניגוד לכך, המחקר של תגובות של כלי דם בתרבויות פרוסה עד כה לא בוצע באופן נרחב. סיבה ברורה היא חוסר זרימת הדם וזלוף כלי דם במודל התרבות הפרוסה. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן לשמור בכלי lood במערכת העצבים המרכזית פורסים תרבויות במשך כמה ימים 8, 9. המטרה הכללית של שיטה זו היא לפקח לא רק את גורלם של תאי עצב לאחר OGD אבל להאריך את המחקר לגורל והשיפוץ של כלי הדם שהוא חלק חשוב מהתגובה לפציעה. עד כה מחקרים כאלה דורשים השימוש בניסויים בבעלי חיים (דה יונג et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). בפרוטוקול מובא כאן, אנו פירוט כיצד ניתן לעשות מחקרים כאלה בתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס תיגר גם עם היפוקסיה או על ידי נגעי הפעלת יתר רעילים ואחריו ניתוח של שתי תגובות הישרדות וכלי דם עצביות. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר שפורסם בעבר בנושא זה 10 ויכול להיות שימושי עבור כל מעבדה מתעניינת באינטראקציות עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית.

<table><tbody><tr><td>Minimum Essential Medium MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilized form of L-glutamine</td></tr><tr><td>Millicell cell culture inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium Eagle&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobic strips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-rabbit 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

פגיעה המוחית איסכמי היא בין המצבים השכיחים וההרסניים ביותר להתפשר תפקוד מוח תקין, ולעתים קרובות מובילה למתמידים ליקויים תפקודיים בחולים שנפגעו. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, עדיין אין אפשרות טיפול יעילה זמינה המפחיתה את פגיעה עצבית ומגנה על תאי עצב באזורי איסכמי ממוות שני מעוכב. מחקר בתחום זה בדרך כלל כרוך בשימוש במודלים של בעלי חיים מורכבים ובעייתיים. תרבויות הפרוסה organotypic Entorhino-היפוקמפוס תיגר עם חמצן וקיפוח גלוקוז (OGD) הוקמו במודלים חוץ גופית המחקים איסכמיה מוחית. ההיבט החדשני של מחקר זה הוא ששינויים של כלי דם במוח נלמדים בנוסף לשינויים עצביים ואת התגובה של שניהם תא העצבי וכלי דם התא ניתן להשוות ומתואם. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה באופן משמעותי להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של אוגישת התרבות הפרוסה ganotypic. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. זאת בניגוד מוחלט לניסויים בבעלי החיים מסובכים ובעייתיים גרימת שבץ ואיסכמיה in vivo. על ידי הרחבת הניתוח לכולל את חקר התגובה של כלי הדם יכול לספק דרכים חדשות על איך לשמר ולשחזר תפקודי מוח. גישת התרבות הפרוסה המוצגת כאן עשויה להתפתח לכלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי ועשויה להיות שימושי לבדיקת אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection.

קיפוח גלוקוז חמצן וחוסר חמצן גורמים למוות עצבי וירידה של כלי דם באופן ספציפי באזור CA1 בהיפוקמפוס. OGD או חמצן קיפוח לבד במשך 15 דקות מושרה אינדוקציה חזקה של מוות של תאים כפי שהם נראים על ידי מכתים יודיד propidium במיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס (איור 3) הדומה כפי שתואר לעיל 7. עם סמנים כדי להמחיש את הרשת של כלי דם, נמצא כי צפיפות כלי דם והארגון הופיעו דומה לשליטה אחרי אתגר OGD ברוב חלקי התרבות למעט אזור CA1. יש צפיפות כלי דם ירד ורשת כלי דם באופן חלקי שיבשו (איור 3, E ו F). שינויים אלה נראים רק באזור שבו צביעת יודיד propidium הוגדלה. במהלך השינויים בכלי הדם בזמן מקביל לזה של neurניוון onal. יש לנו למדנו את הקורס של שני אובדן כלי הניוון ודם העצבי הזמן בCA1 באמצעות נקודות זמן ב3 שעות, 24 שעות ו48 שעות לאחר מחסור בחמצן (היפוקסיה). ב3 הודעה היפוקסיה שעה, לא היה מכתים יודיד propidium גלוי ולא חלו שינויים הנוכחיים בארכיטקטורת כלי דם המצביעים על כך בשלב זה לא חל שינויים היו עדיין נראים לעין (איור 4, וב &#39;). ב24 הודעה hr היפוקסיה הייתה הופעה של מכתים יודיד propidium המציינת את ההתקדמות של מוות של תאים בCA1. בנקודה זו בזמן הרשת של כלי דם כבר הייתה מוטרדת וכלי דם אבדו באזור CA1 (איור 4, C, D). שני, מכתים יודיד propidium ואובדן של כלי דם הפכו בולטים יותר בהודעת היפוקסיה 48 שעה (איור 4, E ו F). ושניהם מוות עצביהאובדן של כלי דם מונע על ידי חסימת עירור לאחר OGD או היפוקסיה. כאשר אנו בשילוב OGD עם טיפולים תרופתיים שמנעו שחרור עודף גלוטמט, ניתן היה להציל את תאי עצב ממוות של תאים הנגרם על ידי OGD. טיפול עם TTX (אשר מעכב דור פעולה פוטנציאלי וכתוצאה מכך ההשתקה של מסופים מביא) או טיפול בCNQX (אשר מעכב קולטני גלוטמט AMPA-סוג) תאים פירמידליים CA1 הצילו ממוות עצבי (איור 5, D ו F). תוצאות אלו מצביעות על כך שמוות עצבי לאחר OGD מתווך על ידי פעולת הפעלת יתר רעילה של גלוטמט. לאחר טיפולים אלה, לא המוות של תאים עצביים רק נמנע, אלא גם על שלמות הספינה השתמרה והאובדן של כלי דם בCA1 נמנע (איור 5, C, E). טיפול AMPA גורם מוות עצבי הפעלת יתר רעיל נפוץ בbu היפוקמפוסאובדן כלי t מוגבל לCA1. OGD כשמש במחקר זה גורם מוות עצבי במיוחד בCA1. בניגוד לכך, טיפול ב100 מיקרומטר AMPA ל30 דקות מושרה איבוד עצבי נפוץ בכלל ammonis cornu של ההיפוקמפוס (CA1 וCA3) וsubiculum אך לא ברכס המשונן (איור 6 ג). מעניין, אובדן כלי דם היה מוגבל לאזור CA1, למרות איבוד עצבי דומה בCA3 לא היה הפסד של כלי דם באזור זה (איור 6 ד). ברכס המשונן לא היה לא אובדן מוות ולא כלי דם עצבי. כימות של צפיפות כלי מאשרת כי כלי דם הולכים לאיבוד בCA1, אך לא באזורים האחרים של תרבות איור 6E. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig1highres.jpg" width="500" /> לוח זמנים איור 1 של חשיפת OGD וreperfusion. אחרי 5 ימים בתרבויות חוץ גופית חשופים לOGD, היפוקסיה או טיפול AMPA. תרבויות הם קבועים לאחר זמן הישרדות של 3 שעות, 24 שעות ו48 שעות. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig2highres.jpg" width="500" /> כימות איור 2 של צפיפות כלי דם באזורים שונים של התרבויות הפרוסה entorhino-היפוקמפוס. Three 6 x 6 רשתות (כאן מוצגות כריבועים) הם כיסו באזור CA1, CA3, DG, וEC. כלי הדם שחצו את הקווים הפנימיים של הרשת נספרו עבור כל ריבוע. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" width="500" /> טיפול .3 היפוקסיה איור גורם למוות עצבי ואובדן של כלי דם בCA1. (,תרבויות שליטת C, E), (תרבויות B, D, F) נתון לטיפול היפוקסיה ואחריו 48 שעות של normoxia. immunostaining Laminin בהגדלה נמוכה בירוק (A, B), מכתים PI בהגדלה גבוהה יותר באדום (ג ד), התמזג תמונות לצביעת laminin וPI ב( E) ו( F). ברים סולם ב( B ל, B) ו( F לC, D, E, F) = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 כמובן זמן של שינויים ועצביים וכלי דםניוון אחרי מחסור בחמצן (היפוקסיה). צביעת PI באדום שמוצג ב( A, C, E), התמזג תמונות עבור PI מכתים וlaminin (ירוק) מוצגות ב( B, D, F). בטיפול שלאחר היפוקסיה 3 שעות, אין כתמי PI גלויים ולא חלו שינויים בכלי הדם ניכרים (A, B). לאחר 24 מכתים PI שעה עולה ואובדן של כלי דם ניכר גם (C, D). שני כתמי PI והאובדן של כלי דם להיות ברורים יותר לאחר 48 שעה (E, F). סרגל קנה מידה ב( F) = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5.; אובדן מוות וכלי דם עצבי נמנעים על ידי חוסמי של עירור עצבי יישום או TTX (C, D) או CNQX (E, F) מנע שני איבוד עצבי כפי שניתן לראות עם מכתים PI (B, D, F) וכלי דם. הפסד חשף על ידי צביעת laminin (A, C, E). OGD לבד גורם גם איבוד עצבי ואובדן של כלי דם בCA1 (A, B). סרגל קנה מידה ב( F) = 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 עצבי מוות ואובדן של כלי דם לאחר טיפול AMPA. טיפול ב100 מיקרומטר AMPA ל30 דקות מושרה נפוץאיבוד עצבי ברוב האזורים של ההיפוקמפוס (C), אבל האובדן של כלי דם נשאר מוגבל לCA1 האזור (D). סרגל קנה מידה ב( D) = 100 מיקרומטר. כימות של כלי דם מאשרת את האובדן סלקטיבי באזור CA1 (E). עמודות מראות את המספר הממוצע של מעברי כלי, ברים שגיאה מראים SEM. הבדלים משמעותיים מסומנים עם ** לp &lt;0.01. תוצאות נלקחו מתוך שלושה ניסויים בלתי תלויים עם שלוש תרבויות ניתחו כל אחת (n = 9) לכל אזור. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52023/52023fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זמן </td><td> פעולה </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> הכן OGD או בינוני היפוקסיה </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> Perfuse OGD אובינוני היפוקסיה עם N 2 עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> DIV 4 </td><td> לעבור תרבויות עד בינוני סרום ללא Neurobasal + גלוקוז ממדיום דגירה, לאפשר להם לנוח O / N או 1 יום </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Perfuse הבינוני OGD שוב עם N 2 למשך 30 דקות </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> הוסף 2 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחרו פרוסות בריאים רק לניסויים כפי שצוין על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> למצוץ הבינוני הרגיל ולהוסיף בינוני OGD לבארות. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD / היפוקסיה ובחזרה. העבר את הצלחת לחדר היפוקסיה </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> Perfuse עם N 2 ל15 דקות בתא היפוקסיה </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> הסר את הצלחת מחדר. לחזור לבינוני Neurobasal ומניח בחזרה בחממת humidified עם 5% CO 2 </td></tr><tr><td> DIV 5 </td><td> להוסיף PI ולתקן 3 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח של 3 שעות </td></tr><tr><td> DIV 6 </td><td> להוסיף PI ולתקן 24 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח 24 שעות </td></tr><tr><td> DIV 7 </td><td> להוסיף PI ולתקן 48 שעות לאחר OGD / היפוקסיה למרווח 48 שעות </td></tr></tbody></table> טבלת 1 רצף זמן מפורט של צעדים לטיפול OGD / היפוקסיה.

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Views.  University of Basel.  פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. 

Video: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Developmental Biology

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...