Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação (NIH / NIDCD 009269, 012831 e ARRA administrativos suplemento NIH) para Weihong Lin. Agradecemos especialmente Mr. Tim Ford em UMBC por sua assistência técnica na filmagem e processamento. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Daphne Blumberg, Ms. Chere Petty em UMBC eo Sr. Nicholas McCollum da Olympus America Inc. por sua assistência em equipamentos de filmagem.

1. Rato Nariz Preparação Usamos adultos camundongos C57BL / 6 fundo neste estudo. Todos os cuidados e procedimentos com animais são aprovados pelo Animal Care e Comitês de Uso (IACUC) da Universidade de Maryland, Baltimore County. 1.1 Adquirir o nariz de camundongos paraformaldahyde-fixados <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Ossos de um crânio de rato A:. Vista dorsal do crânio B:. Vista ventral do crânio com a mandíbula removida. O crânio foi preparado a partir de um ratinho de idade de 40 dias. Ossos individuais são coloridos para melhor visualização. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <ol><li> Perfundir transcardially para corrigir camundongos individuais seguindo ªe protocolo de Lin et ai., (2008) 16. Resumidamente, os ratos foram profundamente anestesiados com tribromoetanol (Avertin 250 ug / g de peso corporal), transcardially perfundidos com tampão fosfato 0,1 M (PB, 30-50 ml), seguido por um agente fixador de fosfato tamponada, contendo 3% de paraformaldeído, 19 mM de L-lisina monocloridrato, e 0,23% de m-periodato de sódio (cerca de 35-50 mL). Pode-se também seguir as etapas no artigo Jove para perfusão animais 35. </li><li> Utilizar um par de tesouras para cortar mandíbula (ou a mandíbula inferior) e retirar a pele da cabeça. </li><li> Separa-se toda a cabeça do resto do corpo. </li><li> Retire o paladar. Também, limpar e remover o tecido muscular e conjuntivo remanescente na superfície do crânio para obter a amostra representada nas Figuras 1A e 1B. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, remover o osso do crânio que cobre o cérebro e os bulbos olfactivos. Apare o excesso de tecido e ossos. Nãote, para a preparação de tecido estendido em que o cérebro e nariz permanecer ligado, apenas os ossos são removidos do crânio. Para as experiências de imuno-histoquímica, o tecido foi pós-fixada, durante 1,5 horas e transferidas para solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) com 25% de sacarose durante a noite. Tecido nasal deve ser mantida durante todo o humidif dissecção por imersão na solução de sacarose tamponada várias vezes. </li></ol> 1.2 Adquirir o nariz de camundongos recém-sacrificados <ol><li> Ratinhos individuais foram transferidas para uma gaiola limpa e exposto a gás de CO 2, o que foi seguido por deslocamento cervical 5 min após o sopro final. Para reduzir o sangue no tecido nariz utilize uma tesoura para abrir a caixa e cortar o coração para permitir que o sangue escorra. </li><li> Repita os passos 1.1.2 a 1.1.5, exceto a pós-fixação e crioproteção com 25% de sacarose. A amostra deve ser mantido humidificada e mantida com solução salina de Tyrode contendo (em mM): 140 de NaCl, 5 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 piruvato de Na, 10 em D-glucose, e 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanossulfónico tampão de ácido (HEPES, com pH ajustado para 7,4). Alternativamente, dobrar uma peça de Kimwipes, embeba-lo com uma solução de Tyrode, e colocar sob o espécime dissecando e ocasionalmente mergulhar o espécimen em solução a de Tyrode ou cair algumas solução sobre o tecido para o manter húmida para manter a viabilidade das células e dos tecidos . </li></ol> 2. Incisivo, Anterior Vomer e maxila remoção óssea <ol><li> Iniciar a partir de um ponto de vista ventral. Localize o osso vômer e quebrar o osso vômer ao longo de seu comprimento usando uma rongeur ou pinças com dentes para quebrar a maior parte ventral do osso. </li><li> Usando fórceps serrilhados, remover os segmentos quebradas do osso vômer dobrando suavemente os fragmentos do osso para fora do órgão vomeronasal (OVN). Note-se, para os ratos menos de um mês de idade, ou se apenas interessados ​​no MOE, estes dois steps pode ser ignorada. </li><li> Segure a cabeça firmemente com uma pinça. Utilizar a alveolótomo para quebrar a porção frontal dos incisivos e da região anterior da maxila articulada entre os dois incisivos e do osso vômer. </li><li> Ruptura da porção ventral da maxila direita na região imediatamente anterior ao arco zigomática até ao nível da placa zigomática dorsal. </li><li> Virar o nariz para um ponto de vista dorsal. Use o rongeur para quebrar o anterior maxilar direito da placa zigomática dorsal. Todo o anterior maxilar direito da placa zigomática deve ser solto. Use as pinça fina para separar delicadamente qualquer tecido nasal subjacente à maxila, e em seguida, levante suavemente o fragmento de osso. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5 para soltar o dente incisivo esquerdo e maxilar anterior esquerda e depois removê-los do osso nasal foi removido. </li></ol> 3. Osso nasal e Dorsal retirada da placa zigomático <ol><li> Usar o fórceps ou serrilhada o alveolótomo remover o restante dos ossos frontal apenas caudais para os ossos nasais. Depois de retirar esse pedaço de osso, a parte caudal do osso nasal pode ser tomado com a pinça. </li><li> Utilizar a alveolótomo para quebrar a porção anterior da arcada zigomática, o qual está ligado à placa zigomática. </li><li> Aqui as pinça fina na borda lateral da extremidade dorsal da placa zigomática e virar suavemente o osso e removê-lo. Se o osso não está solto, utilize o rongeur para apertá-lo suavemente para soltá-lo para remoção. </li><li> Utilizar as pinças finas ou uma lâmina de barbear para soltar o fio de sutura medial entre os ossos nasais direita e esquerda. </li><li> Use o serrilhada pinça para agarrar a extremidade caudal do osso nasal direita. Mova cuidadosamente o osso de um lado para outro para separá-lo do tecido subjacente. É útil para mover as pinças ao longo do terceiro caudal do osso nasal para mover o lado do osso para o outro. À medida que o separa do osso nasal, lentamente levantar o osso a partir da extremidade caudal. </li><li> Enquanto tele osso nasal é ligeiramente levantada, incline lateralmente o osso para revelar um afloramento laterais do osso que é forrado com tecido epitelial respiratória fina. Use uma pinça fina para libertar suavemente este tecido do osso nasal. Continue a levantar o osso nasal. Quando o osso está completamente separado do tecido subjacente, use uma tesoura para cortar o osso nasal no final rostral. </li><li> Repita os passos 3.1, 3.5 e 3.6 para a remoção de osso nasal esquerda. </li><li> Repita os passos 3.2 e 3.3 para o lado esquerdo do nariz. </li></ol> 4. Lateral retirada da placa zigomático <ol><li> Remova a placa zigomática um lado de cada vez. Ou placa zigomática pode ser removido primeiro. </li><li> Do ponto de vista ventral, quebrar o maxilar inferior do arco zigomático até a ruptura atinge o arco zigomático. </li><li> Do ponto de vista dorsal, pegue suavemente o arco zigomático e levantar a frente e lateral. Se a placa zigomática ainda está ligado a qualquer tecido, tomar a multafórceps e separam cuidadosamente as ligações entre o tecido eo osso. </li><li> Repetir para a placa zigomática no outro lado do nariz. </li></ol> 5. Orbit remoção óssea <ol><li> Do ponto de vista ventral, quebrar o osso palantine entre os molares do nariz. </li><li> Utilizar a alveolótomo para quebrar as três molares e da maxila de cada lado do nariz. </li><li> Quebrar e remover quaisquer pedaços grossos restantes do osso ventral e posterior aos cornetos em cada lado do nariz. </li></ol> 6. Remoção etmóide <ol><li> Quebrar qualquer parte do osso etmóide salientes caudal aos cornetos. Isso é necessário para evitar a perda de tecido concha ao remover partes finas do osso etmóide cobrindo os cornetos. </li><li> Para o lado direito do nariz, coloque as pinça fina na borda anterior do osso etmóide e remova-o suavemente. Se uma parte do osso permanece, repita esse procedimento até que todos osfino que cobre o osso das conchas foi removido. Os cornetos não precisa de ser retirada a maior parte das preparações. Em ratos idosos, a placa cribriforme torna-se frágil. Se cryosectioning do tecido nasal é necessário, remover pequenos pedaços da placa com uma pinça fina para reduzir o dano potencial causado pelo osso. </li><li> Repetir passo 6.2) para o lado esquerdo do nariz. </li><li> Remova todos os fragmentos de ossos restantes antes do corte. Nota: em animais com mais de um ano de idade, a região póstero do osso septo é um pouco espessa e difícil. Pode-se remover esta parte usando uma pinça fina. Inserir a ponta do fórceps para ambos os lados do osso para separar a porção dorsal do osso do septo e o forro de tecido epitelial. Use uma pinça para pegar o osso e manter o espécime. Use um outro par de fórceps para quebrar a parte superior óssea da parte inferior do septo cartilaginoso e removê-lo suavemente. </li></ol><ol><li> Configure a bomba de vácuo aspirador. </li><li> Coloque o nariz em um molde de incorporação. Submergir o nariz na mídia outubro </li><li> Usar um vácuo para remover as bolhas de ar aprisionadas no interior do tecido do nariz. Este processo leva até 5 min. </li><li> Depois de remover as bolhas de ar, definido o tecido na orientação desejada. </li><li> Congelar a outubro e de tecido no molde usando gelo seco. O tecido pode, então, ser incorporado cryosectioned imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro. </li></ol>

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R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, demonstramos um procedimento passo-a-passo para o isolamento de tecido olfactivo e respiratório intacto a partir do nariz do rato sequencialmente remoção dos ossos ao redor, enquanto poupando o tecido abaixo. Nós mostramos que a remoção cuidadosa de osso pode preservar até os tecidos mais delicados, na sua totalidade. Também compartilhar insights sobre possíveis modificações desta técnica, em que isolar tanto o cérebro eo tecido nariz juntos para preservar a conexão do nervo. Este novo método proporciona um meio para o isolamento de tecidos olfactivos e respiratória inteiras num espécime para processamento adicional em imuno-histoquímica, hibridação in situ de ARN, e as experiências fisiológicas. Vantagens da remoção de osso Antes que o nosso método, os agentes de descalcificação eram normalmente utilizados para amaciar os ossos para o seccionamento do tecido e imuno-histoquímica. No entanto, dependendo do tamanho do osso e da idade dos animais, descalcificaçãopode ser um processo demorado que exige incubação tecido ósseo descalcificadores por horas ou mesmo vários dias 29,30. Os agentes vulgarmente utilizados também contêm ácidos, que podem ter efeitos sobre o tecido que podem alterar ou impedir, imunomarcação 29,30. Para combater isso, alguns pesquisadores usam o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) solução para seqüestrar íons de cálcio do osso 24,26-28. Este método requer também de descalcificação dias. A dissecção mostrado aqui pode ser realizada em cerca de 20-30 minutos e não exige a aplicação de quaisquer soluções químicas, que podem alterar o stainability de tecido. O método também pode ser usado para obter tecido nasal intacto de narizes recentemente dissecados, proporcionando uma vantagem para a obtenção de tecido vivo para gravações fisiológicas. Por exemplo, as fatias de nariz são geralmente usados ​​para o Ca 2 + imagiologia de ORS e células de suporte no epitélio olfactivo 31,32. Estas fatias tem de serpreparada a partir de ratos neonatais antes dos ossos nos tecidos circundantes endurecidos. No entanto, as amostras não são neonatal idênticos aos adultos porque o epitélio olfactivo continua o desenvolvimento e a maturação pós-natal. Utilizando este método, os pesquisadores podem obter tecido olfativo intacto de ratos mais velhos do que as idades neonatais. Isto apresenta uma vantagem significativa, especialmente em estudos de alterações dependentes da idade. Modificações e resolução de problemas Nós mostramos uma seqüência eficaz para remover os ossos ao redor. No entanto, há outras sequências de remoção óssea para obter tecidos nasais intactas, e o procedimento passo a passo pode ser modificado dependendo das necessidades individuais do investigador e os tecidos de maior interesse. Por exemplo, se o órgão vomeronasal for necessário, o osso vômer deve ser removido no início do procedimento, uma vez que há mais do osso cobertas as áreas de agarrar para manter o tecido no local desejado durante a remoção. Por adapting o procedimento para cada aplicação, os tecidos de interesse são mais susceptíveis de se manter intacto durante o processamento. Os ossos nasais também tendem a ser difíceis de remover, tal como o tecido que se agarra abaixo dos ossos e, muitas vezes, lágrima como os ossos são retiradas. Além abanar os ossos nasais como mostrado no vídeo, pequenas pinças pode ser inserido suavemente entre o osso nasal e do tecido subjacente para ajudar a mover o tecido para baixo e para fora a partir dos ossos durante a remoção. A dissecação também varia ligeiramente, dependendo da idade dos ratos. Em ratos jovens, os ossos tendem a ser mais suaves, enquanto que os ossos dos ratinhos mais velhos são mais frágeis e fundidos com os ossos fortemente vizinhas em algumas regiões. Osso de baixa densidade é mais fácil de separar e remover em pedaços pequenos do que osso mais duro. Esta diferença pode ser facilmente superado usando uma pinça para marcar ou arranhão nas ligações entre os ossos para ajudar na sua separação e remoção limpa. Em animais mais velhos, o póstero região do septo é um pouco grosso e duro e deve ser removido antes de cryosectioning. A porção óssea do septo pode ser removido como descrito no procedimento 6.4. Embora existam pequenas diferenças na dissecação de ratos mais velhos e mais jovens, a idade não é um fator limitante. Em nossos estudos, nós preparamos com sucesso tecidos nasais intactas de ratos que variam de 14 dias a dois anos de idade. Não há nenhuma diferença significativa entre os passos de dissecação utilizadas para o nariz fixador fixa e para o nariz fresco, embora o tecido fresco é mais suave e requer manipulação mais cuidadosa. Em ambas as preparações, mantendo o tecido humedecido durante a dissecção é importante. Não é necessário para executar a dissecção do tecido fresco em salina tamponada, no entanto, mergulhando periodicamente o tecido em solução de Tyrode ou gotejamento da solução sobre o tecido, enquanto dissecação é crítica, uma vez que irá manter o tecido humedecido e nutrientes fornecidos para manter a sua vESPONSABILIDADE. O processo aqui apresentado pode ser ainda modificada para incluir a remoção de osso que deixa tanto o cérebro intacto e do nariz num espécime (Figura 2B). Esta modificação evita as conexões nervosas entre o cérebro eo nariz que passam através da placa cribiforme. Mais habilidade técnica e tempo são necessários para este dissecação que o nariz sozinho. No entanto, preservando as ligações a partir da periferia para o cérebro permite mais diversas aplicações deste método. Limitações Nós temos utilizado este método para preparar tecidos nasais para um certo número de estudos, incluindo o imuno-histoquímica e de ARNm de rotulagem em análise de hibridação in situ e foram rotulados com sucesso muitas proteínas em vias de sinalização, os marcadores de células coradas em diferentes populações de células, e examinou as características morfológicas e da distribuição de células através da cavidade nasal 16,17,36-39. Nós não explimitações erience em cryosectioning e imunomarcação. Para os estudos que requerem cryosectioning da preparação prolongada que mantém o cérebro e tecido nasal conectada em um único espécime, recomendamos o uso de camundongos com idade inferior a quatro meses desde que em ratos mais velhos da placa cribriforme frágil pode criar danos nos tecidos durante o corte. No entanto, para o tecido fresco destinado a registros eletrofisiológicos, os tecidos medial entre conchas não são facilmente acessíveis em toda a preparação de montagem. A remoção de pequenos pedaços de tecido ou a divisão em regiões discretas podem superar o problema. Porque convencional electro-olfactogram é feito na superfície medial do endo-cornetos 25,33,34, a nossa preparação do tecido pode permitir gravações de outras regiões com pouca manipulação. Aplicações além de imuno-histoquímica Existem muitas aplicações do procedimento para aqueles que dominam a técnica. Possível applicatíons incluem estudos zonais nos tecidos olfativos e respiratória, que, utilizando outros métodos, tem sido difícil obter intacto e em sua configuração anatómica original. Os aplicativos também existe para eletrofisiologia, permitindo em simultâneo múltiplas gravações integrais, tecidos frescos. Algumas destas aplicações, que são difíceis de realizar, utilizando técnicas existentes, são possibilitadas pelo nosso método desossamento. Além disso, este protocolo pode igualmente ser adaptado para estudos bioquímicos, genómico, e que necessitam de proteómica recolha de amostra consistente em várias regiões de comparação crítica. Em resumo, temos desenvolvido um procedimento para acessar de forma rápida e confiável tecidos olfativos e respiratórios no nariz do mouse, removendo os ossos ao redor. Este método possui vantagens significativas sobre as técnicas vulgarmente utilizadas, tais como a descalcificação. Além disso, o nosso método não requer nenhum tratamento químico e, portanto, os tecidos não estão limitados à utilização em immunohistochemistry experiências, mas também pode ser aplicável para a hibridação in situ e os estudos fisiológicos. Assim, o nosso método é a forma mais rápida e direta para preparar o nariz do rato para posterior processamento. Esperamos que o nosso método vai facilitar estudos olfativos e respiratórias em regiões nasais.

A cavidade nasal de mamíferos contém vários tipos de tecidos e órgãos que servem funções distintas. A cavidade nasal constitui a porção de entrada do tracto respiratório superior, o que permite viajar ar para dentro e para fora dos pulmões. Ar inalado passa através da cavidade nasal, onde é submetido a temperatura e humidade condicionado 1, bem como a limpeza ou a filtração para remover as substâncias tóxicos e irritantes e microrganismos infecciosos 2. Ambos os tratamentos são efectuados pelo epitélio nasal e subepiteliais tecidos, incluindo as glândulas e vasos e são críticos para proteger as vias aéreas inferiores e dos pulmões. Em adição ao seu papel na respiração e de defesa do epitélio, o tecido nasal também contém aparelhos sensoriais periféricos dos sistemas olfactivos e trigeminal, que detectam uma vasta gama de substâncias químicas na passagem de ar. Dependendo de qual o sistema é activado, a detecção sensorial dos produtos químicos no nariz pode provocar querum sentido de cheiro, irritação ou dor 3,4. O sistema olfativo periférica é complexo e composto de vários órgãos sensoriais olfativos anatomicamente separados dentro da cavidade nasal. Entre eles, o epitélio olfactivo principal (MOE) é o maior, o que representa cerca de 45-52% do epitélio nasal em roedores 5 e está localizado na região posterior. Na região anteroventral, existe um par de estruturas tubulares conhecidos como o órgão vomeronasal 6, que sentar-se ao longo de cada lado do septo nasal. Dois pequenos agrupamentos adicionais de neurónios sensoriais olfactivos, conhecidos como o órgão de septo de Masera 7,8 e gânglio Grüneberg 9, reside ao longo do septo ventral e dorsal da região de entrada da cavidade nasal, respectivamente. Estes órgãos periféricos conter neuro-epitélio com características distintivas em morfologia, expressão marcador celular e função fisiológica. Juntos, eles detectar milhares de odormoléculas com requintada sensibilidade 10-12. Além dos órgãos sensoriais olfactivos, na cavidade nasal também abriga outros sistemas sensoriais. Sabe-se que as fibras do nervo trigeminal peptidérgicas estão presentes no epitélio nasal, especialmente o epitélio respiratório 13,14. Algumas dessas fibras detectar produtos químicos tóxicos e irritantes e são responsáveis ​​por iniciar reflexos protetores, tais como tosse e espirros 4,15. Compostos odoríferos e amargo Irritante também pode ser detectada por uma população de células recentemente descoberto quimio solitários (SCCs), muitos dos quais são inervados por fibras nervosas trigeminais 16-19. Estes CCEs estão localizados em maior densidade na região da entrada da cavidade nasal e os dutos de entrada vomeronasal, dando a entender que eles também podem ter uma função protetora 16-18. Assim, o epitélio nasal pode variar substancialmente em função, morfologia e composição celular em função da sualocalizações anatômicas. Mesmo dentro de um epitélio único e especializado, existem diferenças regionais. O MOE é um exemplo. As linhas MOE vários cornetos, que são complicados e estruturas enrolado. Por causa deles, diferentes regiões da experiência de taxas de fluxo de ar diferentes Moe, e, portanto, diferente de difusão e taxas de depuração de moléculas de odor no ar 20. Além disso, sabe-se que os neurónios sensoriais olfactivos (ORS) que expressam um dado receptor de odor estão localizados numa das quatro zonas contornadas do MOE 21,22. Como esta diferença local afecta a resposta de um OSN a odorantes largamente não é conhecido. Além disso, algumas populações OSN exibem preferência regional. Guanilato ciclase-D (GC-D) expressando ORS têm distribuições zonais favorecendo as regiões cul-de-sac das ectoturbinates 23,24. Mais recentemente, verificou-se uma subpopulação de ORS canônicas que expressa transitória receptor potencial canal M5 (trPM5) e localiza-se preferencialmente nas regiões laterais e ventral 25. Estes resultados indicam que o MOE não é uniforme. No entanto, como estas diferenças regionais afectar codificação olfactivos não é compreendido. Isto é em parte porque a investigação aprofundada fisiológica do MOE e do nariz tem sido limitada pela dificuldade de obtenção de epitélio nasal intacto com organização anatómica preservados utilizando métodos correntes. O epitélio nasal são predominantemente cercado pelos ossos anterior do crânio, incluindo o nasal, maxila, palatino, zigomático, e os ossos etmoidais. Em camundongos adultos e outros modelos de roedores, estes ossos são duros e difíceis de remover sem danificar o tecido nasal intimamente associada, especialmente dos cornetos delicados. Muitas vezes, descalcificação de base química é utilizada para amolecer ossos para permitir cryosectioning dos tecidos nasais para morfológica, imuno-histoquímica, e em estudos de hibridação in situ, no entanto, dependendo da idade do animal, do processo de descalcificação pode durar até durante a noite a 7 ​​dias 24,26-28. Este tratamento também é limitada, porque requer tecido fixador ser preservada. Além disso, a descalcificação química pode ser dura e afetar a imunomarcação de alguns anticorpos sensíveis 29,30. Para os estudos fisiológicos, tecido vivo é necessário e, portanto, estas experiências são frequentemente executadas em ORS isoladas ou fatias de MOE obtidos a partir de recém-nascidos, cujos ossos do crânio são fina e macia 17,31,32. Estudos fisiológicos também podem utilizar os preparativos de montagem inteiros, dividindo a cabeça 25,33,34, mas geralmente apenas a superfície medial do nariz é facilmente acessível, limitando gravações fisiológicas em outras áreas. Aqui, descrevemos, um método de desossa manual do efetivo para preparar tecidos nasais intactas com organização anatómica original preservada e morfologia. Nós sequencialmente remover os principais ossos do anteriorÉ necessário crânio sob um microscópio de dissecação para expor um epitélio nasal quase inteiramente intactas, mantendo os ossos finos cornetos intacta, a menos que os ratos são muito antigas e cryosectioning. Nós também estender o método para preservar a conexão entre os tecidos nasais e bolbos olfactivos, assim como o resto do cérebro, facilitando, assim, análise simultânea dos circuitos centrais e periféricos. O método pode ser utilizado para preparar o paraformaldeído fixo, bem como fresco, tecido nasal vivo. Assim, espera-se o nosso método para facilitar estudos morfológicos, imuno-histoquímica e fisiológico da respiração, olfato e nasal danos e doenças.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501333</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 3 </td><td>WPI</td><td>503235</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 55</td><td>WPI</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont AA</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>WPI</td><td>501753</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, Straight</td><td>Miltex</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tissue embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastic embedding mold</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator vacuum pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-960-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Section staining &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutral red</td><td>ACROS Organic</td><td>CAS 553-24-2</td><td>Nuclei staining</td></tr></tbody></table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

O nariz de mamífero é um órgão multi-funcional com estruturas internas intrincados. A cavidade nasal é revestida com vários epitélios, tais como epitélio olfatório, respiratória e escamosas que diferem acentuadamente em localizações anatômicas, morfologia e funções. Em ratinhos adultos, o nariz é coberto com vários ossos do crânio, limitando o acesso experimental para as estruturas internas, especialmente aquelas na região posterior, tais como o epitélio olfactivo principal (MOE). Aqui nós descrevemos um método eficaz para a obtenção de quase os tecidos nasais inteiros e intactos, com organização anatômica preservada. Usando ferramentas cirúrgicas sob um microscópio de dissecação, que sequencialmente remover os ossos do crânio em torno do tecido nasal. Este procedimento pode ser realizado em ambas as cabeças de pele de rato paraformaldeído fixos e recém-dissecados. O processo de desossamento inteiro leva cerca de 20-30 minutos, o que é significativamente mais curto do que o tempo necessário para experimental convencional de química baseadacalcificação. Além disso, apresentamos um método fácil para remover as bolhas de ar presas entre os cornetos, o que é fundamental para a obtenção de seções horizontais ou coronal e sagital finas intactas desde a preparação do tecido nasal. Tecido nasal preparado utilizando o nosso método pode ser utilizado para a observação de toda a montagem de todo o epitélio, bem como características morfológicas, imunocitoquímica, de hibridação de ARN in situ e os estudos fisiológicos, especialmente em estudos onde o exame específico de região e comparação de interesse.

Usando esse método, podemos obter de forma confiável tecido nasal quase inteiramente intactas. Figura 2A mostra uma imagem de amostra nasal adulto de uma cabeça paraformaldeído fixo. Neste modelo, todas as quatro sub-órgãos sensoriais olfactivos, incluindo a, órgão MOE do septo, o gânglio Grüneberg e VNO, estão intactas. Além disso, o epitélio respiratório e tecidos subepiteliais, tais como glândulas e vasos, são preservados. Nós utilizamos com sucesso este método de uma série de estudos em que se investigou a morfologia, a distribuição, a inervação do nervo, e a expressão dos marcadores de células em várias populações de células sensoriais especializados 16,17,36-38. A figura 2B mostra uma amostra com o cérebro, bolbos olfactivos, e nariz juntos. Esta preparação prolongado é especialmente útil em estudos que requerem ligação entre os sistemas nervoso central e periférico olfactivos. Nós preparamos este espécime, removendo os ossos do crânio surrounding cérebro antes da remoção dos ossos faciais. Nosso método estendido permite aos investigadores para realizar experimentos sobre o sistema olfativo periférico e central em uma única preparação. O tecido nasal mostrado na Figura 2 pode ser utilizado para a observação de toda a montagem, bem como para a preparação de secções de tecido. Figura 3A mostra uma secção de corte horizontal através de ambas as regiões de MOE e respiratória. Figura 3B mostra uma secção coronal cortado pelo meio do MOE. Nós manchou as seções com vermelho neutro para uma melhor visualização de vários tipos de estruturas epiteliais e submucosa em diferentes localizações anatômicas. Estes resultados demonstram que nossa técnica preserva até mesmo a delicada estrutura da concha MOE e organização anatômica do nariz, que permitem investigação abrangente e comparativa das alterações morfológicas e funcionais nasais em condições normais e patológicas. <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2highres.jpg"/> Figura 2. Isolado nasal e tecido cerebral A:.. Vista dorsal do tecido nariz intacto dissecado usando o nosso método de desossa B:. Vista dorsal de um nariz e do cérebro com conexões neurais entre os sistemas olfativos central e periférica intacta <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3highres.jpg"/> Figura 3. Seções de tecidos nasais A:.. Uma seção horizontal mostrando epitélio olfativo e respiratórias, bem como outras estruturas nasais B: Secção coronal através do cornetos of a MOE no posterior do nariz. Ambas as seções foram 14 m de espessura e coradas com vermelho neutro MOE:. Epitélio olfatório principal RE:.. Epitélio respiratório <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> .

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

an-effective-manual-deboning-method-to-prepare-intact-mouse-nasal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

35.1K visualizações.  University of Maryland Baltimore County. 

Vídeo: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Fixação de Perfusão todo animal para Roedores

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Imunologia e Infecção

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.