이 작품은 Weihong 린에 연구 보조금 (NIH / NIDCD 009269, 012831 및 ARRA 관리 보충 NIH 보조금)에 의해 지원되었다. 우리는 특히 찍고 및 처리에있는 그의 기술 지원 UMBC에서 씨 팀 포드 감사합니다. 우리는 또한 찍고 자신의 장비 지원을 올림푸스 미국 주식 박사 다프네 베르크, UMBC에서 양 Chere 페티 니콜라스 McCollum에 감사하고 싶습니다.

1. 마우스 코 준비 우리는이 연구에서 성인 C57BL / 6 배경 마우스를 사용했습니다. 모든 동물 관리 및 사용 절차는 메릴랜드 대학 볼티모어 카운티의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인됩니다. 1.1 paraformaldahyde 고정 생쥐 코를 취득 <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> 그림 1. 마우스 두개골의 뼈 A :. 두개골의 등쪽보기 B :. 제거 하악과 두개골의 복부 볼 수 있습니다. 두개골은 40 일 오래된 마우스에서 준비되었다. 각각의 뼈가 더 나은 시각화를 위해 착색하는 것은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> 일에 따라 각각의 생쥐를 해결하기 위해 transcardially 붓는다린, 외.의 E 프로토콜 (2008) 16. 간단히 마우스는 3 % 파라 포름 알데히드가 포함 된 고정액 버퍼 인산 뒤에 0.1M 인산 버퍼 (PB, 30 ~ 50 ML)로 transcardially 관류 tribromoethanol (Avertin의 250 ㎍ / g 체중)와 깊이 마취 19 mM의 L-라이신 염산염, 0.23 % 나트륨 M-과 요오드 (약 35-50 ML). 하나는 동물의 재관류 35 조브 문서의 단계를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 하악을 잘라 (또는 아래턱)과 머리에 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 신체의 나머지 부분에서 전체 헤드를 분리합니다. </li><li> 미각을 제거합니다. 또한, 청소 및 통계 1A와 1B에 표시된 시료를 얻기 위해 두개골의 표면에 남아있는 결합 조직과 근육을 제거합니다. </li><li> 해부 현미경, 뇌와 후각 전구를 덮고있는 두개골 뼈를 제거합니다. 여분의 조직과 뼈를 잘라. 아니TE는 뇌와 코가 연결되어있는 확장 된 조직 준비를 위해, 단지 두개골의 뼈가 제거됩니다. 면역 실험을 위해, 조직은 1.5 시간 동안 후 고정 야간 25 % 자당과 (PBS) 식염수 버퍼 0.1M 인산 옮겨졌다. 비강 조직은 버퍼 자당 용액에 몇 번을 찍기로 해부를 통해 가습 보관해야합니다. </li></ol> 1.2 갓 안락사 쥐의 코를 취득 <ol><li> 개인 마우스는 깨끗한 케이지로 옮겨와 최종 흡입 후 자궁 전위 5 분으로 이어졌습니다 CO 2 가스에 노출되었다. 코 조직에 혈액을 줄이기 위해, 가슴을 열고 혈액을 배출 할 수 있도록 마음을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 25 % 자당을 가진 후 고정 및 cryoprotection 제외하고, 1.1.5 단계 1.1.2를 반복합니다. 시편은 가습 보관하고 Tyrode의 염분 함유 (mm 단위)로 유지해야한다 : 140 나CL, 5 KCl을, 1 MgCl 2, 1 염화칼슘 10 나의 피루 베이트 10 D-글루코오스, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-에탄 산 버퍼 (HEPES, pH를 7.4로 조정). 또는, 킴 와이프의 조각을 접어 해부하는 동안 시편 아래 Tyr​​ode의 솔루션과 장소를 흡수하고 때때로 세포와 조직의 생존을 유지하는 것이 가습 계속 Tyrode의 솔루션에 시험편을 찍어이나 조직에 어떤 해결책을 드롭 . </li></ol> 2. 앞니, 전방의 Vomer 및 상악골 뼈 제거 <ol><li> 복부 관점에서 시작합니다. vomer 뼈를 찾아 뼈의 복부 대부분을 깰 이빨 rongeur이나 집게를 사용하여 길이를 따라 vomer 뼈를 휴식. </li><li> 톱니 모양의 집게를 사용하여 부드럽게 vomeronasal 기관 (VNO)에서 떨어져 뼈 조각을 부지런히하여 vomer 뼈의 깨진 부분을 제거합니다. 참고, 이전 달보다 작거나 환경부에 관심이있는 경우에만 마우스를위한 두 인트PS는 생략 할 수 있습니다. </li><li> 집게로 단단히 머리를 잡아. 앞니와 두 개의 앞니와 vomer 뼈 사이의 상악 전치부의 관절 부위 모두의 앞 부분을 깰 수있는 rongeur를 사용합니다. </li><li> 최대 지느러미 광대뼈 판의 레벨로 광대뼈 아치 바로 전방 지역에서 오른쪽 상악의 복부 부분을 휴식. </li><li> 등의 견해 코 뒤집어. 지느러미 광대뼈 플레이트의 오른쪽 상악 전방을 깰 rongeur를 사용합니다. 광대뼈 플레이트의 전체 오른쪽 상악골의 전방이 느슨합니다. 부드럽게 상악의 기초가 어떤 비강 조직을 분리하는 미세 집게를 사용하고 부드럽게 뼈 조각을 올립니다. </li><li> 왼쪽 앞니와 왼쪽 상악 전치부를 풀고 코 뼈가 제거 된 후 그들을 제거하는 단계 2.4 및 2.5를 반복합니다. </li></ol> 3. 코 뼈와 지느러미 광대뼈 플레이트 제거 <ol><li> 다시 톱니 모양의 집게 또는 rongeur를 사용하여코 뼈 바로 꼬리 정면 뼈의 나머지를 이동합니다. 뼈 조각을 제거한 후, 코 뼈의 꼬리 부분이 집게를 사용하여 파지 할 수 있습니다. </li><li> 광대뼈 플레이트에 연결되어있는 광대뼈 아치의 앞쪽 부분을 깨고 rongeur를 사용합니다. </li><li> 광대뼈 플레이트의 지느러미 끝의 측면 가장자리에 미세 집게를 타고 부드럽게 뼈를 뒤집어을 제거합니다. 뼈가 느슨한 경우, 제거를 풀어 부드럽게 클램프 rongeur를 사용합니다. </li><li> 왼쪽 및 오른쪽 코 뼈 사이의 중간 봉합을 느슨하게 미세 집게 또는 면도날을 사용합니다. </li><li> 오른쪽 코 뼈의 꼬리 끝을 그립하는 톱니 모양의 집게를 사용합니다. 부드럽게 조직을 기본 구분하기 위해 좌우로 뼈를 이동합니다. 그 옆에 뼈 측면 이동을위한 비강 뼈의 꼬리 세번째 따라 집게를 이동하는 데 유용합니다. 코 뼈가 분리로, 천천히 꼬리 끝에서 뼈를 들어 올립니다. </li><li> T가그는 코 뼈를 약간 들어 올려 얇은 호흡기 상피 조직 늘어서 뼈의 측면 outcropping 표시를 나타 내기 위해 측면으로 뼈를 기울이십시오. 부드럽게 비골에서이 조직을 해제하는 미세 집게를 사용합니다. 코 뼈가 들어 계속합니다. 뼈가 완전히 하부 조직에서 분리 될 때, 주동이의 끝에서 코 뼈를 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 왼쪽 코뼈를 제거하는 단계 3.1, 3.5 및 3.6를 반복합니다. </li><li> 단계 코의 왼쪽 3.2 및 3.3를 반복합니다. </li></ol> 4. 옆 광대뼈 플레이트 제거 <ol><li> 한 번에 광대뼈 플레이트 한쪽을 제거합니다. 어느 광대뼈 플레이트를 먼저 제거 할 수 있습니다. </li><li> 복부 관점에서, 휴식 광대뼈 아치에 도달 할 때까지 광대뼈 아치 열등 상악을 깰. </li><li> 등의 관점에서, 부드럽게 광대뼈 아치를 잡고 앞으로 측면 올립니다. 광대뼈 판은 여전히​​ 모든 조직에 연결되어있는 경우, 벌금을포셉 부드럽게 조직과 뼈 사이의 연결을 절단. </li><li> 코의 반대편에있는 광대뼈 플레이트를 반복합니다. </li></ol> 5. 궤도 뼈 제거 <ol><li> 복부 관점에서, 코의 어금니 사이 palantine 뼈를 휴식. </li><li> 코의 양쪽에 3 대구치와 상악을 깰 rongeur를 사용합니다. </li><li> 코의 양쪽 비갑개에 복부와 뒤쪽 뼈의 나머지 두꺼운 휴식 및 제거합니다. </li></ol> 6. 사골 뼈 제거 <ol><li> 비갑개에 꼬리 튀어 나온 사골 뼈의 일부를 휴식. 이 비갑개를 덮고있는 사골 뼈의 얇은 조각을 제거 할 때 비갑개 조직의 손실을 방지 할 필요가있다. </li><li> 코의 오른쪽 측면, 사골 뼈의 앞쪽 가장자리에 미세 집게를 놓고 조심스럽게 제거합니다. 뼈의 일부가 남아있는 경우, 모든 때까지이 절차를 반복비갑개를 덮고있는 얇은 뼈가 제거되었습니다. 비갑개 뼈 준비의 대부분 제거 할 필요가 없습니다. 세 생쥐에서 소공 질의 접시 취성됩니다. 비강 조직의 cryosectioning이 필요한 경우, 뼈에 의한 손상을 줄이기 위해 미세 집게로 접시의 작은 조각을 제거합니다. </li><li> 코의 왼쪽 측면 단계 6.2) 반복합니다. </li><li> 이전의 단면에 남아있는 뼈 조각을 제거합니다. 주 : 동물에서 더 중격 뼈의 살, posterodorsal 지역보다 다소 두껍고 단단하다. 하나는 미세 집게를 사용하여이 부분을 제거 할 수 있습니다. 심장의 뼈와 안감 상피 조직의 지느러미 부분을 분리하는 뼈의 양쪽에 집게의 끝 부분을 삽입합니다. 뼈를 잡고 시험편을 잡아 포셉 한 쌍을 사용합니다. 심장의 아래 연골 부분에서 위쪽 뼈 부분을 깨고 조심스럽게 제거 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. </li></ol><ol><li> 흡인기 진공 펌프를 설정합니다. </li><li> 임베딩 형에 코를 놓습니다. 10월 미디어 잠수함 코. </li><li> 코 조직 내에 갇혀있는 공기 방울을 제거하기 위해 진공을 사용합니다. 이 프로세스는 5 분 소요됩니다. </li><li> 기포를 제거한 후, 원하는 방향으로 조직을 설정합니다. </li><li> OCT를하고 드라이 아이스를 사용하여 금형 조직을 고정합니다. 내장 조직은 다음 즉시 cryosectioned 또는 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. </li></ol>

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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에, 우리는 아래 조직을 살려주는 동안 순차적으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코에서 그대로 후각 및 호흡기 조직을 분리하기위한 단계별 절차를 보여 주었다. 우리는 조심 뼈 제거가 전체에서도 가장 민감한 조직을 보존 할 수 있다는 것을 보여. 우리는 또한 우리가 신경 연결을 유지하기 위해 함께 뇌와 코 조직을 모두 분리하는이 기술의 가능성 개조에 대한 통찰력을 공유 할 수 있습니다. 이 새로운 방법은 현장 하이브리드 화에 면역, RNA에서 추가 처리 및 생리 학적 실험 한 시편 전체 후각 및 호흡기 조직을 분리하는 방법을 제공합니다. 뼈 제거의 장점 우리의 방법 전에 decalcifying 에이전트는 일반적으로 조직 절편과 면역을위한 뼈를 부드럽게하는 데 사용되었습니다. 그러나 석회는 뼈의 크기와 동물의 나이에 따라시간 또는 며칠 29,30에 대한 뼈 decalcifiers의 조직 배양을 요구하는 긴 과정이 될 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 에이전트는 변경하거나 29,30을 immunolabeling의 방해 할 수 조직에 영향을 미칠 수 있습니다 산을 포함합니다. 이를 방지하기 위해 일부 연구자들은 뼈 24,26-28에서 칼슘 이온을 격리 할하려면 솔루션 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 사용합니다. 탈회이 방법은 또한 일을 필요로한다. 여기에 표시된 절개는 약 20 ~ 30 분에서 수행 할 수 있으며, 조직의 염색성을 변경할 수있는 화학 솔루션의 응용 프로그램을 필요로하지 않습니다. 우리의 방법은 생리 레코딩을위한 살아있는 조직을 얻기위한 이점을 제공 갓 해부 코에서 그대로 비강 조직을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 코, 조각은 일반적으로 칼슘에 사용되는 + 후각 상피 31,32에서 OSNs 및 지원 세포의 이미지. 이 조각해야경화 조직을 둘러싸고있는 뼈 전에 신생아 생쥐에서 준비합니다. 후각 상피 세포는 출생 후 발달과 성숙을 계속하고 있기 때문에, 신생아 표본은 성인과 동일하지 않습니다. 우리의 방법을 사용하여, 연구진은 신생아 나이보다 오래된 마우스에서 그대로 후각 조직을 얻을 수 있습니다. 이것은 특히 나이에 따라 변화 연구에 중요한 이점을 제공합니다. 수정 및 문제 해결 우리는 주변의 뼈를 제거하는 하나의 효과적인 순서를 보였다. 그러나, 그대로 비강 조직을 얻기 위해 뼈를 제거 다른 시퀀스가​​ 있으며, 단계 절차에 의해 단계는 연구원 및 가장 관심있는 조직의 개별 요구 사항에 따라 변경 될 수 있습니다. vomeronasal 기관이 필요한 경우 제거하는 동안 원하는 장소에 조직을 유지하기 위해 파악하기 위해 더 많은 골 덮인 부분이 있기 때문에 예를 들어, vomer 뼈는 초기 프로 시저에서 제거해야합니다. ADAP로딸랑 딸랑 각 응용 프로그램의 절차, 그 조직은 추가 처리를 위해 그대로 유지 가능성이 더 높습니다. 코 뼈는 아래의 조직이 뼈에 달라 붙고 뼈가 멀리 해제 될 때 자주 눈물 때문에 제거하기 어려운 경향이있다. 비디오와 같이 코 뼈를 흔드는뿐만 아니라, 작은 포셉 부드럽게 코 뼈 및 제거하는 동안 뼈 조직을 아래로 이동하고 멀리하는 데 도움이되는 기본 조직 사이에 삽입 할 수 있습니다. 절개는 약간 생쥐의 나이에 따라 다릅니다. 젊은 생쥐에서 뼈 나이가 생쥐의 뼈가 더 취성 강하게 일부 지역 주변의 뼈에 융합하면서 부드러운 경향이 있습니다. 부드러운 뼈 분리하고 열심히 뼈보다 작은 조각으로 제거하는 것이 더 쉽습니다. 이 차이는 쉽게 분리하고 깨끗한 제거에 도움 뼈 사이의 연결에 점수 나 부스러기에 집게를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 오래된 동물, posterodorsal 다시심장의 기온이 다소 두껍고 어렵고, cryosectioning하기 전에 제거해야합니다. 절차 6.4에 설명 된대로 심장의 뼈 부분을 제거 할 수 있습니다. 나이가 어린 쥐의 해부의 작은 차이가 있지만, 나이는 제한 요인이되지 않습니다. 우리의 연구에서, 우리는 성공적으로 십사일에서 두 살까지 쥐에서 그대로 비강 조직을 준비했습니다. 신선한 조직이 연약하고 더 조심 조작을 필요로하지만 고정액 고정 코와 신선한 코에 사용 해부 단계 사이에는 큰 차이가 없습니다. 모두 준비에서 해부하는 동안 조직 가습을 유지하는 것이 중요합니다. 주기적으로 그것의 V을 유지하기 위해 공급 조직이 가습 및 영양소 유지되므로 중요합니다 Tyrode의 솔루션의 조직을 찍기 또는 해부하는 동안 조직에 솔루션을 떨어지는 그러나, 버퍼 식염수에 신선한 조직의 절개를 수행 할 필요가 없습니다iability. 여기에 제시된 절차는 더 이상 하나의 시편 (그림 2B)의 뇌와 코를 모두 그대로 유지 뼈 제거를 포함하도록 수정 될 수 있습니다. 이 수정은 소공 질의 플레이트를 통해 해당 패스 뇌와 코 사이의 신경 연결을 여분. 더 많은 기술과 시간을 혼자 코보다이 해부가 필요합니다. 그러나 주변에서 뇌에 연결을 유지하는 것은이 방법의보다 다양한 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 제한 우리는 현장 하이브리드 화 분석에서 면역 라벨 및 mRNA를 포함하여 연구의 숫자에 대한 비강 조직을 준비하기 위해이 방법을 사용했으며, 성공적으로 신호 전달 경로, 다양한 세포 인구의 스테인드 세포 마커 많은 단백질을 표시했으며, 형태 학적 특징과 세포의 분포를 조사 비강 16,17,36-39를 통해. 우리는 특급하지 않았다cryosectioning 및 immunolabeling의의의 erience 제한합니다. 하나의 표본에 연결된 뇌와 비강 조직을 유지 확장 준비의 cryosectioning이 필요한 연구를 위해, 우리는 나이가 생쥐에서 취성 소공 질의 플레이트 단면 동안 조직 손상을 만들 수 있기 때문에 4개월 미만의 쥐를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 전기 생리학 녹음위한 새로운 조직을 위해, 비갑개 사이의 중간 조직은 전체 마운트 준비에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이산 지역 조직 또는 분할의 작은 조각의 제거는 문제를 극복 할 수 있습니다. 기존의 전기 olfactogram는 엔도 비갑개 25,33,34의 내측 표면에서 수행되기 때문에, 우리의 조직 준비는 거의 조작으로 다른 지역에서 녹음을 허용 할 수 있습니다. 면역 이상 신청 절차의 대부분의 응용 프로그램 기술을 익힌 사람들을 위해 존재한다. 가능한 입학 원서이온은 다른 방법을 사용하여 그대로 원래의 해부학 적 구성에서 얻기 어려운되었습니다, 후각 및 호흡기 조직에 존의 연구를 포함한다. 또한 응용 프로그램은 전체, 신선한 조직에 동시 다중 녹음을 허용하여 전기 생리학을 위해 존재한다. 기존 기술을 사용하여 수행하기 어려운 된 이러한 응용 프로그램 중 일부는 우리의 발골 방법에 의해 가능하게된다. 또한,이 프로토콜은 또한 중요한 비교를 위해 다양한 지역에서 일관된 시료 채취를 요구 생화학 게놈 및 프로테옴 연구에 적용 할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 신속하고 안정적​​으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코 후각 및 호흡기 조직에 액세스 할 수있는 절차를 개발했습니다. 이 방법은 석회 같은 일반적으로 사용되는 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 우리의 방법은 화학 처리가 필요하지 않으므로 조직을 immunohistochemist에있는 사용을 위해 제한되지 않습니다스피 실험뿐만 아니라, 현장 하이브리드 화 및 생리 학적 연구에 적용 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 추가 처리를 위해 마우스 코를 준비하는 더 빠르고 직접적인 방법입니다. 우리는 우리의 방법은 비강 지역에서 후각과 호흡 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.

포유류 비강은 조직과 별개의 기능을 제공 기관의 다양한 유형을 포함하고 있습니다. 비강은 폐에 그리고 밖으로 항공 여행을 할 수 상부 호흡기의 입구 부분을 차지합니다. 흡입 공기는 그것뿐만 아니라 청소를하거나, 자극성 및 독성 물질 및 전염성 미생물 2를 제거하는 필터링으로 온도와 습도 조절 1 거쳐 비강을 통해 전달합니다. 두 치료는 비강 상피와 땀샘과 혈관을 포함하여 피하 조직에 의해 수행과 하부기도와 폐를 보호하기 위해 중요합니다. 호흡 상피 방어의 역할뿐만 아니라, 비강 조직은 지나가는 공기에 화학 물질의 넓은 범위를 감지 후각과 삼차 시스템의 말초 감각기구를 포함합니다. 활성화되는 시스템에 따라, 코 화학 물질의 감각 감지 중 하나를 유도 할 수냄새, 자극, 또는 고통 3,4의 감각. 주변 후각 시스템은 복잡하고 비강 내에서 여러 해부학 적으로 분리 후각 감각 기관으로 구성되어 있습니다. 그 중에서도, 주요 후각 상피 세포 (MOE)는 설치류 5 비강 상피 세포의 약 45~52%을하게하고 후방 지역에 위치한 가장 큰 것입니다. anteroventral 지역에서 비중격의 각 측면을 따라 앉아 vomeronasal 기관 6로 알려진 관상 구조의 쌍입니다. Masera 7,8와 Gruneberg 신경절 9 중격 기관으로 알려진 후각 감각 뉴런의 두 개의 추가 작은 그룹, 각각 복부 중격과 비강 등의 항목 영역을 함께 상주합니다. 이러한 주변 장기 독특한 형태의 기능, 세포 마커 발현 및 생리 기능과 신경 상피가 포함되어 있습니다. 이들은 냄새의 수천을 감지절묘한 감도 10-12를 가진 분자. 후각 감각 기관뿐만 아니라, 비강도 다른 감각 시스템을 전시하고 있습니다. 그것은 peptidergic 삼차 신경 섬유는 비강 상피 세포, 특히 호흡기 상피 세포 13,14에 존재하는 것으로 알려져있다. 이러한 섬유의 일부는 자극과 독성 화학 물질을 감지하고 기침과 4,15 재채기 등의 보호 반사를 개시 할 책임이 있습니다. 자극성 악취 쓴 화합물은 또한 그 중 대부분은 삼차 신경 섬유 16-19로 떨어짐을하는 고독한 chemosensory 세포 (SCC에)의 최근에 발견 된 인구 감지 할 수 있습니다. 이 SCC에들은 또한 보호 기능에게 16-18를 제공 할 수 있다는 암시, 비강 및 vomeronasal 항목 덕트의 입구 영역에서 높은 밀도에 있습니다. 따라서, 비강 상피 기능, 형태 실질적으로 다를 수 있고, 세포 성분은에 따라해부학 적 위치. 심지어 하나의 전문 상피 세포 내에서 지역적 차이가 있습니다. 환경부는 하나의 예입니다. 복잡하고 구조 말려 MOE 줄 다양한 비갑개. 따라서 그 때문에, 다른 MOE 경험을 다른 공기 유량 영역, 그리고 다른 확산 및 공기 냄새 분자 (20)의 제거율. 또한, 그것은 특정 냄새 수용체를 표현하는 후각 감각 뉴런 (OSNs)은 환경부 21,22의 영역을 우회 네 가지 중 하나에있는 것으로 알려져있다. 이 위치의 차이에 미치는 영향에 악취에 OSN의 반응은 대부분 알려져 있지 않다. 또한, 일부 OSN 인구는 지역의 환경 설정을 나타냅니다. Guanylyl cyclase의-D (GC-D) 표현 OSNs는 ectoturbinates 23,24의 막 다른 골목 영역을 선호 존의 분포가있다. 더 최근에, 우리는 (TR 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 M5를 표현 정식 OSNs의 모집단을 발견PM5)과는 우선적으로 측면과 복부 지역 25에 위치하고 있습니다. 이러한 결과는 환경부가 균일하지 않습니다 나타냅니다. 그러나 이러한 지역적 차이는 후각 코딩에 어떻게 영향을 미치는지 이해되지 않습니다. 철저한 생리 환경부의 조사와 코는 현재의 방법을 사용하여 보존 해부학 적 조직 손상 비강 상피 세포를 얻기의 어려움에 의해 제한되어 있기 때문에이 부분에 있습니다. 비강 상피는 주로 비강, 상악, 라틴, 광대뼈, 그리고 사골 뼈를 포함하여 두개골의 앞쪽 뼈에 의해 둘러싸여 있습니다. 성인 마우스 및 기타 설치류 모델에서,이 뼈는 특히 밀접한 관련이 비강 조직, 섬세한 비갑개를 손상없이 제거하기 어렵고 어렵다. 종종, 화학 기반의 탈회는 면역, 형태, 및 현장 하이브리드 화 연구에서 비강 조직의 cryosectioning 수 있도록 뼈를 부드럽게하는 데 사용되지만, depen딩은 동물의 연령, 탈회 과정은 하룻밤 7 일에게 24,26-28을 지속 할 수있다. 그것은 조직이 정착 보존 할 필요하기 때문에이 치료는 제한됩니다. 또한, 화학 탈회는 가혹한 일부 민감한 항체 29,30의 immunolabeling의 영향을 미칠 수 있습니다. 생리 학적 연구에, 살아있는 조직이 필요하며, 따라서이 실험은 종종 고립 OSNs 또는 그 두개골 뼈 얇고 17,31,32 부드러운 신생아에서 얻은 MOE 조각에 실시하고 있습니다. 생리 학적 연구는 또한 분할 머리 25,33,34에게로 전체 마운트 준비를 활용할 수 있지만, 코의 내측 표면에 일반적으로 다른 영역에 생리 녹음을 제한, 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 여기, 우리는 보존 원래의 해부학 적 조직 형태로 그대로 비강 조직을 준비하는 효과적인, 수동 발골 방법을 설명합니다. 우리는 순차적으로 전방의 주요 뼈를 제거마우스가 아주 오래된 않는 얇은 비갑개의 뼈는 그대로 유지하고 cryosectioning 동안 거의 그대로 비강 상피 세포를 노출 해부 현미경 두개골이 필요합니다. 우리는 또한 이렇게 주변과 중앙 두 회로의 동시 검사를 촉진, 비강 조직과 후각 전구 사이의 연결뿐만 아니라, 뇌의 나머지 부분을 유지하기 위해 방법을 확장합니다. 우리의 방법은 파라 포름 알데히드 고정뿐만 아니라, 신선한, 살아있는 비강 조직을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 호흡, 후각, 그리고 비강 손상 및 질병, 형태 면역 및 생리 학적 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501333</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 3 </td><td>WPI</td><td>503235</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 55</td><td>WPI</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont AA</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>WPI</td><td>501753</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, Straight</td><td>Miltex</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tissue embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastic embedding mold</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator vacuum pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-960-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Section staining &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutral red</td><td>ACROS Organic</td><td>CAS 553-24-2</td><td>Nuclei staining</td></tr></tbody></table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

포유 동물의 코는 복잡한 내부 구조를 가진 다기능 기관이다. 비강은 이러한 해부학 적 위치, 형태 및 기능에 크게 차이, 후각 호흡하고, 편평 상피 등 다양한 상피 세포에 늘어서있다. 성인 쥐에서 코는 특히 내부 구조, 주요 후각 상피 세포 (MOE)와 같은 후방 등의 사람들에게 실험적인 접근을 제한하는 각종 두개골 뼈 덮여있다. 여기에 우리가 보존 해부 조직과 거의 전체와 그대로 비강 조직을 얻기위한 효과적인 방법을 설명합니다. 해부 현미경 수술 도구를 사용하여, 우리는 순차적으로 비강 조직을 둘러싼 두개골 뼈를 제거합니다. 이 절차는 모두 파라 포름 알데히드 고정 갓 해부, 피부 마우스 머리에 수행 할 수 있습니다. 전체 발골 절차는 기존 화학 기반 데 필요한 실험 시간보다 훨씬 짧은 20 ~ 30 분 정도를 소요석회화. 또한, 우리는 비강 조직 준비에서 그대로 얇은 수평 또는 관상 또는 시상 부분을 얻기위한 중요한 비갑개 사이에 갇힌 공기 방울을 제거하는 쉬운 방법을 제시한다. 우리의 방법을 사용하여 준비 비강 조직은 특히 특정 지역과 관련된 검사와 비교가 관심의 연구에서, 전체 마운트 전체 상피 세포의 관찰뿐만 아니라, 형태 학적, 면역 세포, RNA 등의 현장 하이브리드 화, 그리고 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다.

이 방법을 사용하여, 우리는 신뢰성 거의 그대로 비강 조직을 얻을 수 있습니다. 그림 2A는 파라 포름 알데히드 고정 머리에서 성인 코 시편의 이미지를 보여줍니다. 이 시편에서, 환경부, 중격 기관, Gruneberg 신경절 및 VNO 등 네 가지 하위 후각 감각 기관은 그대로입니다. 또한, 호흡 상피와 같은 땀샘과 혈관 등의 피하 조직은 보존됩니다. 우리는 성공적으로 우리가 형태, 분포, 신경 신경 분포, 다양한 특수 감각 세포 집단 16,17,36-38의 세포 마커 발현을 조사하는 연구의 숫자에이 방법을 사용했습니다. 그림 2B 함께 뇌, 후각 전구 및 코 표본을 보여줍니다. 이 확장 준비는 주변과 중앙 후각 시스템 사이의 신경 연결이 필요 연구에 특히 유용합니다. 우리는 두개골 뼈 스와을 제거하여이 시편 준비전에 얼굴 뼈의 제거에 머리를 rrounding. 우리의 확장 방법은 연구자가 하나의 준비에 주변과 중앙 모두 후각 시스템에서 실험을 수행 할 수 있습니다. 그림 2에서와 같이 비강 조직은 전체 마운트 관찰뿐만 아니라, 조직 절편의 준비에 사용할 수 있습니다. 그림 3A는 환경부와 호흡 영역 모두를 통해 수평 단면 컷을 보여줍니다. 그림 3B는 중간을 잘라 코로나 섹션을 보여줍니다 환경부의. 우리는 다른 해부학 적 위치에서 상피 점막 구조의 다양한 유형의 더 나은 전망을위한 중립 빨간색 부분을 염색. 이러한 결과는 우리의 기술은 정상 및 병적 상태에서 코 형태 및 기능 변화의 포괄적 인 비교 연구를 활성화도 섬세한 MOE 비갑개의 구조와 코의 해부학 적 조직을 유지하는 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig2highres.jpg"/> 그림 2. 절연 코와 뇌 조직 A :.. 우리 발골 방법을 사용하여 해부 그대로 코 조직의 등쪽보기 B :. 그대로 중앙과 말초 후각 시스템 사이의 신경 연결과 코와 뇌의 등쪽보기 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig3highres.jpg"/> 그림 3. 비강 조직의 섹션 A :.. 후각 및 호흡기 상피뿐만 아니라 다른 비강 구조를 보여주는 수평 섹션 B : 비갑개 O를 통해 코로나 섹션F 코의 후방에있는 MOE. 두 절은 중립 레드 14 μm의 두께 및 스테인드했다 MOE :. 주요 후각 상피 RE :.. 호흡기 상피 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50538/50538fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

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비디오: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

연구

신경과학

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

설치류에 대한 전체 동물 관류 고정

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

장기 상승 작용으로 매우 안정하고 재현성 기록을위한 향상된 준비 및 해마 마우스 조각의 보존

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

발생학

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

면역학 및 감염병학

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.