Esta pesquisa foi apoiada por R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e os fundos de inicialização UT Southwestern (JPM).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de UT Southwestern Institutional Animal Care e Use, e foram escolhidos de modo a minimizar o estresse, desconforto e dor experimentada pelos animais experimentais. 1. Dissecção Secção Uma câmara de dissecção personalizada e pequena, prancha fina de plástico são necessários para obter os melhores resultados (Figura 1). Construir ou obter tal câmara antes de tentar esse protocolo. 2. Soluções de dissecação <ol><li> Prepare 1 litro de padrão artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) para uso em Passos 3,22-5,4. Adicionar NaCl a 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, mio-inositol, 3 mM, piruvato de sódio 2 mM, ascorbato de sódio 0,4 mM e glicose 25 mM a 1 L de água pyrogen livre. </li><li> Prepare o ACSF dissecção inicial (200 ml) parausar nos passos 3,3-3,22. Tome 200 ml de aCSF Padrão e aumentar a concentração de MgCl2 por 9 mm, adicionando 0,366 g de MgCl2 hexahydrate. </li><li> Preparar uma solução-padrão de Ringer para transportar estímulos à VNO através da cânula para utilização em passos 4,11-5,4 contendo NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl2 2 mM, NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM. </li><li> Bolha a 0,8 L de aCSF padrão e 0,5 L de Ringer com 95% de O2, 5% de CO 2 de gás em um banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min, até utilização. </li><li> Bolha os 200 ml de aCSF dissecção inicial com 95% de O2, 5% de CO 2 de gás em gelo durante 15-20 minutos, até que atinge 4 ° C. </li></ol> 3. Dissection primária <ol><li> Preparar a área de dissecção. Coloque três pratos de Petri 35 milímetros, oxigenado aCSF, tesouras decapitação, curvas dissecando tesoura, tesoura reta dissecando, fórceps Adson, um couro cabeludo # 11lâmina el e punho e uma lâmina de barbear no gelo. </li><li> Após oxigenado aCSF foi arrefecida a 4 ° C, profundamente anestesiar os animais numa câmara de dessecação usando 2-5 ml Isothesia (99,9% de isofluorano). Realizar testes de esmagamento da cauda e do pé para garantir que o animal está profundamente anestesiada. </li><li> Depois de uma anestesia profunda é confirmada, decapitar o animal e colocar imediatamente a cabeça numa placa de Petri cheio com o ACSF dissecção gelado. NOTA: Mergulhe o tecido em dissecção refrigerados aCSF para mantê-lo fresco durante todo o procedimento, quando não em uso. </li><li> Retire o aspecto inferior (ventral faringe, mandíbula e língua) com uma tesoura curva. </li><li> Usando Adson fórceps deglove (casca) da pele superficial e anexos musculares do crânio. Descasque o couro cabeludo de caudal para rostral até o único local de ligação é sobre os dentes da frente. Corte o tecido no ponto de fixação usando uma tesoura curva. Remova os olhos, segurando-o com uma pinça e puxá-lo para longe da preparação. Norelha a fim de o processo de Degloving, evitar o excesso de força sobre a cartilagem nasal delicada usando fórceps Adson para ligamentos musculares livres dos ossos do maxilar superior. NOTA: Retire o couro cabeludo do aspecto caudal do crânio com tesoura reta. </li><li> Com a tesoura reta, cortar a linha média do crânio de caudal para rostral até que as pontas de tesoura são alguns mm para os ossos frontais (apenas antes do seio rinal). </li><li> Retire o parietal e ossos frontais do crânio usando uma pinça Adson. NOTA: As partes do osso frontal, muitas vezes, permanecer solidários com os ossos nasais caudais ao seio rinal. Remova os pedaços com o cuidado de não contactar os bulbos olfatórios. </li><li> Use o bisturi para fazer um corte coronal através do lobo frontal 2 milímetros caudal para os seios e, em seguida, remover o caudal do cérebro para o corte. Garantir a ponta dos contatos bisturi o contorno ósseo do crânio ventral para cortar completamente o tecido posterior. NOTA: Isso permite queremoção da maior parte do cérebro, sem colocar estresse mecânico sobre os tratos olfatórios laterais ou bulbos olfatórios. </li><li> Retire os aspectos caudais expostas do crânio ventral com tesoura reta. Deixe os seios e tecido nervoso remanescente. </li><li> Retire o arco zigomático e músculos faciais no lado anatômico direito do crânio usando tesoura reta </li><li> Vire o focinho longo (lado ventral para cima) para expor o céu da boca. </li><li> Corte e retire o paladar imediatamente caudal aos incisivos. Faça isso inserindo a ponta da lâmina de bisturi sob o paladar paralelo ao céu da boca e, em seguida, mover a lâmina para os incisivos. </li><li> Segure a (rostral) borda livre do palato com uma pinça Adson e retire puxando caudal. </li><li> No lado esquerdo anatómica do crânio, utilizar a lâmina de bisturi para estender os forame palatino caudal, a partir das pequenas forame próximos molares. Conseguir isso inserindo a ponta do bisturi blades para o vazio perto dos molares e rotação do pulso. NOTA: Tenha muito cuidado ao usar apenas a ponta da lâmina - um corte profundo pode danificar o tecido septal. </li><li> Com a ponta da lâmina de bisturi, cortar a partir do forame palatino através dos incisivos, a partir rostral ao órgão anatómica vomeronasal esquerda. Utilize múltiplos cortes de pontuação. Não danificar o tecido septal e os nervos vomeronasais inserindo a lâmina muito profundo. </li><li> Vire o tecido de modo que o crânio dorsal está voltada para cima e, em seguida, orientar a lâmina reta na vertical (paralela à linha média) na borda caudal da preparação. </li><li> Na borda ventral do tecido, tocar a borda cortante da lâmina de barbear imediatamente à esquerda da linha média. Agite suavemente a lâmina e se movem ao longo do forame palatino esquerdas (cortar região introduzida na etapa 3.14). </li><li> No bordo dorsal do tecido, colocar a aresta de corte da navalha imediatamente à esquerda da linha média (inferior a 1 mm). </li><li> Manutençãoa lâmina paralela à linha média, agitar a lâmina lentamente com pressão em direcção ao anterior do tecido. Observe resistência na lâmina crivosa. Pare imediatamente após romper essa resistência. NOTA: Neste ponto, o hemisfério direito é solto a partir do hemisfério esquerdo. A conexão só é remanescente entre os hemisférios ao longo da dorsal focinho anterior à lâmina crivosa. </li><li> Separe os hemisférios, segurando-os perto dos lados caudais com os dedos enluvados e suavemente girando-os lateralmente e anteriormente. NOTA: Este passo é uma fonte de variabilidade experimental, especialmente em ratos com focinhos desviadas ou frágeis (por exemplo, ratos mais velhos). Além disso, ao tentar rodar os hemisférios de distância um do outro, se a resistência a forte for encontrado marcar o focinho dorsal (anterior à placa cribriforme) para enfraquecer os tecidos conjuntivos. Enquanto isso, tome muito cuidado para não inserir o bisturi profundamente, o que pode danificar a ti septalssue e nervos vomeronasal. </li><li> Aplique uma pequena quantidade (50-100 L) de cola de tecido para a prancha e coloque delicadamente a borda lateral do hemisfério direito para a cola usando a pinça Adson. Retire o excesso de umidade do lado lateral da preparação usando uma toalha de papel para evitar a polimerização prematura cola e adesão solto para a prancha. NOTA: Aplicar algumas gotas de dissecação o ACSF gelado na amostra para acelerar a polimerização de cola após o tecido é colocado sobre a cola. Isto assegura que o tecido se mantém firmemente retida à prancha. </li><li> Colocar uma pequena quantidade (3-5 mm de diâmetro, 2 mm, de profundidade) de graxa vácuo no meio da câmara de dissecção secundário e colocar o lado da prancha em frente ao tecido firmemente contra a graxa. Preencher imediatamente a câmara com dissecção refrigerados aCSF dissecção, a transferência para a área de dissecção fina e começar a perfusão com padrão aCSF oxigenado. Oriente a prancha para que o bulbo olfativo é diretamente nafluxo de aCSF padrão recém-oxigenado. </li></ol> 4. Dissecção secundário <ol><li> Remova qualquer contralateral (esquerdo) bulbo olfatório visível ou tecido cortical da preparação usando uma pinça fina. Segure as pinça fina (formando um ponto sem corte semi), e, em seguida, colocá-lo no dorsal e porção caudal do tecido perto da linha média. Suavemente executar o fórceps pinçados ao longo da linha média, descamação do tecido longe do hemisfério direito lentamente em movimento anterior. Remover todo o tecido contralateral, incluindo o tecido bulbo olfativo contralateral. Tome muito cuidado para não apunhalar através do tecido, o que pode causar danos ao AOB ou nervo vomeronasal. </li><li> Observe a dura-máter branco ao longo da superfície dorsal / medial do bulbo olfatório. Arrancar essa dura-máter ao longo da borda dorsal / caudal do bulbo olfatório, segurando na parte mais branca da dura com dois pares de uma pinça fina e puxe-los a partir desse ponto. A dura-máter é firmementeenrolada em torno do bulbo olfatório, e pode facilmente cortar através do tecido em si, enquanto ele está sendo removido. Evite danos à superfície medial do bulbo olfatório eo próprio AOB. NOTA: Se a dura resiste rasgar facilmente, neste ponto, introduzir um pequeno corte com tesoura de dissecção ponta primavera finas para facilitar a separação. </li><li> Lenta e cuidadosamente descascar o córtex frontal com uma pinça fina, sem danificar os bulbos olfatórios subjacentes. Observar uma coleção de vasos sanguíneos que aparecem como uma rede semi-transparente imediatamente caudal ao AOB. Remover esta rede com uma pinça fina para facilitar a penetração do eletrodo em experimentos eletrofisiológicos. Segure a net com uma pinça, uma vez que se separa da AOB durante frontal retração córtex e remova-o puxando caudal e medial, tendo o cuidado para não tocar a AOB. Uma vez que o córtex frontal foi separado dos bulbos olfativos, removê-lo através do corte com uma pinça ventrais e posteriores para o MAA. NOTA: Tome extreme cuidado com a remoção net, para se for feito demasiado aproximadamente a camada glomerular pode ser danificado. </li><li> Na cavidade nasal contralateral exposta, remover qualquer tecido septal contralateral restante (folha frágil amarelado contendo vasos sanguíneos), usando a pinça fina. Segure o tecido na região caudal / dorsal (perto do osso do septo) e puxe / levantar o tecido para o lado anterior. NOTA: O tecido septal contralateral pode ser inadvertidamente removido durante o passo de hemisecção (Passo 3,20). Em tal caso, observar uma cartilagem septal branco, avasculares e o osso do septo ligeiramente transparente, vascularizado. Se for este o caso, o Passo 4.4 pode ser ignorada. </li><li> Retire cuidadosamente o VNO contralateral, executando um único ponto dos pinça fina entre a cartilagem do septo e da &quot;asa&quot; VNO (um pequeno pedaço de tecido ósseo que corre ao longo da borda dorsal de ambos VNOs. <ol><li> Após o desprendimento da asa da cartilagem, mova a ponta do fórceps ventrallyno VNO contralateral perto da linha média. Repita este passo em vários locais ao longo do eixo caudal / rostral do VNO contralateral para soltá-lo, permitindo que ele seja removido, segurando com uma pinça e levantando distância. </li></ol></li><li> Prepare-se para remover a cartilagem do septo, fazendo um corte na borda ventral / caudal (onde se restringe a uma faixa avascular branco corrida ao longo da borda ventral do osso do septo) com uma pinça fina. </li><li> Retire a cartilagem do septo por beliscar junto a pinça fina para fazer um ponto sem corte semi. Identificar o corte feito no passo 4.6, inserir a pinça pinçados por trás (lateral) para que corte, e, em seguida, levantar-se lentamente a cartilagem longe do tecido septal e procedendo rostralmente. NOTA: Não interromper o tecido septal subjacente. Como a cartilagem é levantada, observar a folha subjacente de tecido stretch septal devido a aderências frouxas para a cartilagem. Um movimento periódico, suave e estável dos pinça fina pinçados ao longo deste local de solta umdhesion pode facilitar a separação bem sucedida das duas estruturas. </li><li> Use um par de fórceps # 3 com uma ponta curvada para remover o osso septal. Aproximamos do osso do septo com um ângulo quase paralela ao plano do osso do septo. Insira a ponta curvada entre o tecido ósseo do septo e septal. Segure o osso com a pinça e gentilmente mover o osso e para trás até que ele racha perto da lâmina crivosa. NOTA: Em alguns casos, o osso do septo vai resistir quebrando perto da lâmina crivosa. Neste caso, use uma pinça fina para marcar suavemente o osso ao longo do septo / eixo ventral dorsal apenas anterior à lâmina crivosa, em seguida, repita o passo 4.8. </li><li> Retire a cartilagem branco apenas rostral ao VNO por beliscar com um par de fórceps finos na entrada e puxando rostralmente com outro par de fórceps finos. </li><li> Anexar a cânula de poliimida para um dispositivo de perfusão rápida e iniciar o fluxo de solução de Ringer (0,1-0,3 ml / min) através da cânula de poliimida.NOTA: vazão medida com, um medidor de fluxo pequeno volume in-line. Uso de computador controlado dispositivo de comutação pneumática estímulo reduz a alterações na taxa de fluxo durante a estimulação. Comparar as respostas neurais para testar estímulos com respostas a um estímulo simulada (controle solução de Ringer) para assegurar respostas são específicas de estímulo. </li><li> Oriente a cânula paralelo à entrada VNO. Quando a cânula está satisfatoriamente paralela à entrada VNO, ver como a pressão de saída faz com que o VNO para &quot;encher&quot;, levando a evacuação do vaso sanguíneo. Imediatamente inserir a cânula no VNO, mantendo o ângulo da constante de cula, de modo que continua a ser paralela à abertura VNO. Nota: Pode ser útil para manter a cânula com um par de fórceps finos contra a prancha de plástico e usar um outro par de uma pinça fina para o ângulo de ponta da cânula ligeiramente para cima. Se, inadvertidamente, se coloca a cânula para trás o VNO, a saída também pode fazer com que o vaso sanguíneo VNOevacuar, dando a impressão de uma punção adequada foi realizada. A localização adequada pode ser confirmada através da incorporação de um corante na solução de Ringer. Quando a cânula está devidamente colocado, o corante só deve sair pela entrada VNO. Além disso, pode-se confirmar o posicionamento adequado, garantindo que a cânula é facilmente visível através do aspecto medial semi-transparente do VNO. </li><li> Mova a prancha plástico lentamente até a AOB é o fluxo direto do padrão aCSF, tomando cuidado para não deslocar a cânula do VNO. A dissecção é completa e avaliação da função fisiológica pode começar imediatamente. Passo 5 descreve brevemente uma abordagem para fazer essa avaliação. </li></ol> 5. Avaliação <ol><li> Penetram na superfície da AOB com 2-4 mohms microeléctrodo de vidro de borosilicato ligado a um amplificador e extracelular osciloscópio. </li><li> Lentamente avançar o microeléctrodo a uma profundidade de 100-200 mM dosuperfície a uma taxa de 50 mm / min. NOTA: Nesta profundidade tecido, um vai encontrar ocasionais ação espontânea potenciais ondas exemplificadas por breves (~ 1-2 ms) deformações acentuadas, na tensão de microeletrodos. </li><li> Ao encontrar uma potencial onda de ação, parar o avanço do microeletrodos. </li><li> Observe e / ou gravar a taxa potencial de ação ao alterar a solução de entrega de estímulo do controle de Ringer a um ativador conhecido da atividade VSN (por exemplo, solução de Ringer contendo KCl 50 mM). Se a dissecção foi bem sucedida, uma mudança dependente do estímulo da taxa potencial de ação ou potencial de campo local pode ser observada. NOTA: Nem todos os neurônios AOB vai responder a cada estímulo com um aumento na taxa de disparo (incluindo solução de Ringer contendo KCl 50 mM). Uma diminuição dependente do estímulo na taxa de disparo também indica a conectividade funcional e uma dissecção de sucesso. No caso em que dois ou mais neurónios que são encontradosnão respondem à estimulação VNO, ou se há potenciais de ação são observados após várias penetrações eletrodo, isso sugere uma dissecção sem sucesso. Se este for o caso, uma nova dissecção pode ser iniciada no passo 3. </li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse significativos para divulgar.

O VNO-AOB ex preparação vivo descrito neste protocolo é uma alternativa útil para anestesiados in vivo 5-7 e fatia vivo agudo 17 experimentos de função AOB. Ao contrário de experimentos fatia AOB agudas, que também expõem elementos do circuito para registros eletrofisiológicos e ópticos, esta preparação mantém todos os aferentes sensoriais e conexões intra-AOB. Embora isso também pode ser dito de anestesiado em abordagens in vivo, a presença de anestésicos altera necessariamente função neural, ou seja, o equilíbrio excitatório / inibitório, que é crucial para o processamento de informações neste e em outros circuitos olfativos 18. Porque a preparação evita a utilização de anestésicos, e porque a superfície de MAA é completamente exposto ao superfusate, é passível de investigações farmacológicas para processamento neuronal local. Há, é claro, algumas limitações desta preparação. Há evdência para a degeneração gradual das camadas mais profundas AOB, ou seja, as partes profundas da camada celular interna, que abriga muitas células granulares inibitórios 16. Além disso, as entradas centrífugas são cortados durante a dissecção, eliminando-os da participação ativa na função AOB. A canulação do VNO ignora a acção normal da bomba vomeronasal, e elimina os fluidos endógenas presentes no lúmen VNO. Passos fundamentais para alcançar o sucesso com este método são a hemissecção delicado (Passo 3,20) e VNO punção (Passo 4.11). Pode-se esperar para exigir prática extensiva para produzir de forma confiável ex vivo preparações funcionalmente conectados. A câmara de dissecção secundário utilizado aqui pode ser utilizado para avaliar a ligação funcional, utilizando gravações único de eléctrodos durante a estimulação do VNO com fontes de feromonas de ratinho (tal como urina diluída). 13,15 Modificações da câmara de dissecção secundário pode be fez que permitir que a preparação rodada para ângulos adequados para outros fins, tais como imagens multiphoton. Os muitos obstáculos técnicos para estudar a AOB vivendo há muito tempo representava uma barreira para a nossa compreensão de odor social e processamento sensorial feromônio. Dissecando longe os componentes neurais mais antigos desta via sensorial neste protocolo dissecação, um é capaz de obter acesso experimental para estes circuitos de difícil estudo. Temos utilizado esta preparação para investigações mais detalhadas em processamento sensorial vomeronasal 19 e mapeamento sensorial (Hammen et al., Não publicado). Esta técnica será útil para futuros estudos sobre o processamento sensorial na AOB, especialmente aqueles que requerem acesso óptico para o tecido (por exemplo, imagens e multiphoton optogenetics). Os benefícios desta abordagem complementar os de abordagens in vivo, e melhorar o nosso kit de ferramentas para investigar os mecanismos neurais de modo mediado por vomeronasalcomportamentos sociais e reprodutivos.

Processamento sensorial no cérebro de mamíferos tipicamente se estende por vários circuitos neuronais reciprocamente conectados, cada um dos quais extrai as características particulares de estímulos sensoriais. Em vias sensoriais, processamento de informação precoce é vital para a percepção eo comportamento normal. No sistema olfativo acessório (AOS), o bulbo olfativo acessório (AOB) é o principal circuito neural que liga a periferia sensorial para estruturas a jusante que ditam o equilíbrio hormonal 1,2, agressão 3 e 4 excitação. Como tal, o processamento de informações dentro deste circuito está fortemente ligada a mudanças no comportamento animal. O bulbo olfativo acessório está localizado em camundongos e ratos no aspecto dorsal / caudal / posterior do bulbo olfatório (MOB) sob o denso, vascularizado seio rinal. A AOB recebe inervação aferente de axônios dos neurônios sensoriais vomeronasais periférica (VSNs) que residem no órgão vomeronasal (VNO), um small tubo cego terminou no focinho anterior logo acima do palato mole. Estes axónios atravessar a folha de tecido delicado do septo no limite medial das passagens nasais. Vários estudos investigaram as respostas neurais AOB a fontes de odores AOS (tais como a urina de rato) in vivo com ratos anestesiados 5-7 ou animais livremente explorando 8. O heróico anestesiados estudos in vivo envolvidos (a) traqueostomia para garantir a anestesia profunda e evitar a aspiração de estímulos líquido 5-7, (b) de estimulação do gânglio cervical simpático 6 ou punção direta do órgão vomeronasal 5,7 introduzir odores voláteis e (c) com ou sem craniotomias ablações do lobo frontal para permitir o avanço do eléctrodo para o MAA 6. Awake / comportando estudos 8-10 implantação cirúrgica envolvida de um Microdrive. Em suma, esses paradigmas experimentais são poderosos, mas extremamente difícil e muitas vezes requer anestesia. (ex vivo) com algum sucesso 11-15. Porque as conexões entre o VNO e AOB permanecer ipsilateral, e porque o tecido da linha média do septo pode ser exposto a superfusate oxigenado em um único hemisfério, buscou-se desenvolver uma abordagem ex vivo de um único hemisfério para isolar essas estruturas, mantendo sua conectividade funcional. Recentemente, conseguiu atingir esta meta 16. Esta preparação mantém tanto o VNO e AOB vivo e funcionalmente ligados por pelo menos 4-6 horas porque ambos os axônios (ao longo do tecido septal suave linha média) e AOB são relativamente rasas &lt;600 mM recursos que são acessíveis a superfundidos oxigenado artificial líquido cefalorraquidiano ( ACSF). Este VNO-AOB ex vivo preparação permite a introdução de estímulos controlados para o VNO através de uma cânula fina, eacesso visual direto para a pequena AOB para a colocação do eletrodo-alvo e / ou microscopia de fluorescência ao vivo. Este método é vantajoso quando se deseja estudar estes circuitos na ausência de anestésico. Como essa abordagem rompe ligações centrífugas, não é bem adequado para investigações sobre a modulação da função centrífuga AOB. O VNO-AOB ex vivo preparação é difícil de aprender, mas uma vez alcançado produz uma plataforma confiável sobre a qual a investigar organização circuito, processamento de informação, e plasticidade neural neste circuito sensorial poderosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

O sistema olfativo acessório rato (AOS) é um caminho sensorial especializado para detectar odores voláteis sociais, feromônios e cairomônios. O primeiro circuito neural na via AOS, chamado bulbo olfatório acessório (AOB), desempenha um papel importante no estabelecimento de comportamentos típicos do sexo, como a agressão territorial e acasalamento. Este circuito pequeno (&lt;1 mm 3) possui a capacidade de distinguir estados comportamentais únicas, tais como sexo, tensão e estresse a partir de sugestões de quimio nas secreções e excreções de animais da mesma espécie. Enquanto a organização compacta deste sistema apresenta oportunidades únicas para a gravação de grandes porções do circuito ao mesmo tempo, a investigação de processamento sensorial no AOB continua sendo um desafio, em grande parte devido à sua localização experimentalmente desvantajosa no cérebro. Aqui, nós demonstramos uma dissecação de várias etapas que remove a AOB intacta dentro de um único hemisfério do crânio anterior mouse, deixando conectaríons para ambos os vomeronasais periférica neurônios sensoriais (VSNs) e circuitos neuronais locais intactos. O processo apresenta a superfície de MAA para dirigir a inspecção visual, facilitando electrofisiológico e gravações ópticas de AOB elementos de circuito, na ausência de anestésico. Após a inserção de uma cânula fina no órgão vomeronasal (VNO), que abriga os VSNs, pode-se expor diretamente da periferia de odores e feromônios sociais durante a gravação de actividade a jusante da AOB. Este procedimento permite investigações controladas em AOS processamento de informação, que pode lançar luz sobre mecanismos que ligam a exposição feromônio a mudanças no comportamento.

Alcançar o sucesso com esta preparação requer prática extensa, e tem várias fases em que ele pode falhar. Deve-se esperar para exigir várias tentativas antes de alcançar o sucesso. A câmara de dissecção personalizada é necessária para a conclusão bem sucedida deste protocolo, e deve ser obtido antes de iniciar os estágios mais avançados da dissecção. A concepção da câmara apresentada na Figura 1 é suficiente para esta finalidade, e pode ser feito de materiais plásticos relativamente baratos, com exigências mínimas de usinagem. Se alguém não tem a capacidade de produzir uma tal câmara, as empresas de usinagem local ou on-line pode ser consultado e pode construir a câmara para uma taxa. Uma grande fonte de variabilidade entre preparações é a densidade e a fragilidade dos ossos do crânio e focinho dos animais experimentais. Durante os passos de hemisecção (Passos 3,14-3,20), o objectivo é isolar ambos os órgãos vomeronasal, juntamente com o tecido do septo e ipsilateralbulbo olfatório acessório ipsilateral. No entanto, não é incomum para o tecido do septo para permanecer ligada ao hemisfério contralateral, especialmente perto de pontos de fixação para os ossos dorsais do focinho. Figura 2 mostra um exemplo de uma hemisecção eficazes e ineficazes. Outros erros comuns de dissecação surgir durante a dissecção fina, durante a qual os axônios do nervo vomeronasal podem ser danificados no tecido septal perto do órgão vomeronasal (Figuras 3A e 3B) ou perto da AOB (Figuras 3C e 3D). Estas e outras eventos resultará em conectividade incompleta entre VSNs ea AOB, tornando os preparativos inutilizável. O último obstáculo para o sucesso da preparação é o passo canulação VNO (Step 4.11). O posicionamento adequado da cânula VNO irá resultar em pressurização do lúmen VNO, causando a expulsão imediata de<html> sangue residual da bomba vomeronasal. A cânula deve ser claramente visível sob o epitélio vomeronasal relativamente transparente e a aparência da cânula deve ser uniforme ao longo do seu comprimento no interior do VNO. Após a conclusão do procedimento, pode-se verificar a conectividade funcional usando um ensaio fisiológico como única unidade registros eletrofisiológicos de atividade neural em resposta à estimulação VNO com uma fonte conhecida de odores VSN (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg" /> Figura 1. A) Desenhos de engenharia da câmara de dissecção personalizado usado em Passos 3,22-5,4. NOTA: Pequenos buracos podem ser perfurados para acomodar solução e gaseamento entradas e saídas como B) fotografia desejada Exemplo de câmara de dissecação utilizado neste protocolo..<html> m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig2highres.jpg" /> Figura 2. A, B) Imagens representativas de bem sucedida (A) e sem sucesso (B) As preparações após a fase de hemisecção (Passo 3,20). O VNO, os tecidos do septo, e bulbos olfatórios (OBs) todos devem ser mantidos a partir do hemisfério ipsilateral (neste caso, o direito (em baixo) hemisfério. Se cornetos nasais são visíveis no hemisfério ipsilateral, a dissecção falhou. Tick marcas são um milímetro de distância. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51813/51813fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;width =&quot; 600 d/51813/51813fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. A, B) Imagens representativas de tecido septal intactos e danificados entre o VNO e AOB. Em B, a pinça de dissecação fez contato inadvertido com o tecido, prejudicando os tratos axônio VN. C, D) AOBs intactas e danificadas. Em D, remoção da dura circundante o OB ipsilateral resultou em cortar o nervo vomeronasal perto do MAA, fazendo com que uma gota visível de tecido perto do AOB medial. As barras de escala são de 1 mm de comprimento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51813/51813fig4highres.jpg" /> Figura 4. A) enredo Exemplo de varredura de potenciais de ação gravados a partir de um neurônio AOB (extracelular gravação única unidade), em uma preparação bem sucedida. Traços na mostra preta nenhuma mudança na taxa de disparo quando a solução de controle de Ringer foi entregue ao VNO por 5 seg (cinza bboi). Traços em vermelho mostram a resposta do mesmo neurônio à estimulação VNO com BALB / c fêmea urina do rato diluído 100 vezes em solução salina de Ringer. B) Peri-estímulo tempo histograma das mesmas respostas em um arquivo. As barras de erro representam os erros padrão da média.

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

O mouse do bulbo olfativo acessório (AOB) tem sido difícil de estudar, no contexto da codificação sensorial. Aqui, nós demonstramos uma dissecação que produz uma preparação ex vivo em que os neurônios AOB permanecem funcionalmente ligados às suas entradas periféricas, facilitando a investigação sobre o processamento de informações de feromônios e cairomônios rato.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K visualizações.  UT Southwestern Medical Center.  O mouse do bulbo olfativo acessório (AOB) tem sido difícil de estudar, no contexto da codificação sensorial. Aqui, nós demonstramos uma dissecação que produz uma preparação ex vivo em que os neurônios AOB permanecem funcionalmente ligados às suas entradas periféricas, facilitando a investigação sobre o processamento de informações de feromônios e cairomônios rato. 

Vídeo: Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Multieletrodo Recordings Matriz do Epitélio Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Gravação induzida pela temperatura actividade neuronal através de monitoramento das alterações de cálcio no bulbo olfativo de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...