We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com a legislação local e da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins experimentais (Directiva 86/609 / CEE) e com as recomendações apresentadas pela Federação das Associações de Ciência Animal Laboratório Europeu (FELASA). Ambos os ratinhos C57BL / 6 e ratinhos FPR-RS3-i-Vénus foram alojados em grupos de ambos os sexos à temperatura ambiente num 12 h ciclo de luz / escuro com comida e água disponíveis ad libitum. Para as experiências foram utilizados os jovens adultos (6-20 semanas) de ambos os sexos. Não foram observadas diferenças óbvias dependente do género. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Preparar solução extracelular S 1: 4- (2-Hidroxi-etil) -piperazina-1-ácido etanossulf único (HEPES) tamponada solução extracelular contendo (em mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado com NaOH); osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose). </li><li> Prepare extracelluLar solução S 2: Carbogen-oxigenada (95% O2, 5% de CO 2) solução extracelular contendo (em mM) 125 de NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, BES 5; pH = 7,3; osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose). </li><li> Preparar a solução de agarose 4% de baixa de gelificação (S 3) para a incorporação de tecido: 4% de agarose de baixa temperatura-gelificação. Dissolve-se 2 g de agarose de baixa de gelificação em 50 ml de S 1 em 100 ml de um frasco de vidro de laboratório em conjunto com um agitador magnético. Para derreter a agarose, colocar a garrafa num banho de água (com a tampa não hermeticamente fechado) a 70 ° C durante aproximadamente 20 min ou até a solução torna-se transparente, enquanto se agitava. Arrefecer e manter a agarose fundida em um segundo banho de água a 42 ° C até à sua utilização. </li><li> Preparar solução intracelular S 4: Adição da solução de contendo (em mM) 143 KCl, 2 de KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (livre de Ca 2+ = 110 nM), 10 de HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajustado com KOH); osmolaridade = 290 mOsm. </li><li> Modificar / ajustar a composição de S 1, S 2, S e 4 de acordo com o desenho experimental individual (por exemplo, bloqueadores farmacológicos para isolar certos tipos de correntes activadas por tensão). </li></ol> 2. Preparação Workspace <ol><li> Preencha oxigenar câmara de fatia armazenar com S 2, pelo menos, 30 minutos antes da dissecação, colocar no gelo para ajuste de temperatura e pH e solução de oxigenar continuamente. </li><li> Encha o reservatório de superfusão fatia na configuração de gravação com S 2 e oxigenar continuamente. </li><li> Antes de dissecção, preencha vibratome de câmara com S 2 e organizar gelo picado ao redor da câmara. Em alternativa, transferir solução oxigenada de reposição de gelo frio de oxigenar câmara em vibratome câmara e manter a oxigenação continuamente. </li><li> Organizar instrumentos cirúrgicos e produtos de consumo. </li><li> Coloque pacote de gel de gelo sob dissecandomicroscópio, cubra com uma toalha de papel para evitar que o tecido VNO de congelar até a parte inferior do prato. </li><li> lâmina limpa por lavagem brevemente em 70% de etanol e água destilada e de montagem para vibratome. Substituir para cada sessão de corte. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> O sacrifício de animais por uma breve exposição ao CO 2 e decapitar usando uma tesoura cirúrgica afiadas. Observação: Como o tempo de sacrificar o animal para colocar a cápsula VNO em gelo é crítica, minimizar o tempo de menos de 2 minutos. Para manter a viabilidade do tecido, incorporar tanto VNOs totalmente dissecada em agarose em menos de 30 min. </li><li> Remova a mandíbula inferior com grandes tesouras cirúrgicas. Entre através da cavidade bucal e cortar os ossos da mandíbula e músculos de cada lado separadamente. </li><li> Coloque a parte restante da cabeça para baixo na placa de Petri grande. </li><li> Se afastar da pele da maxila superior e em torno da ponta do nariz com uma pinça médias para obter um melhor acesso aoincisivos. </li><li> Utilize uma tesoura para cortar osso a maior parte dos incisivos a um ângulo de 45 ° ~ no sentido rostral (Figura 1A). Isto irá facilitar a remoção da cápsula VNO a partir da cavidade nasal. Nota: Não corte para a raiz do dente para evitar danos na ponta da cápsula VNO. </li><li> Pegue o palato superior rígida na sua parte rostral com uma pinça médias e cuidadosamente descascar volta em uma peça em um ângulo plano (Figura 1B). Nota: Repetidamente lavar com gelado S 2. </li><li> Use micro tesouras para cortar a mola fusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula. Insira as pontas de tesoura com a parte curva da ponta apontando para fora longe do VNO e cuidadosamente cortar o osso em pequenos passos, tanto da esquerda e lateral direita para a cápsula VNO. </li><li> Para remover a cápsula VNO, usar tesoura micro mola para cortar através do osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer fora do ncavidade asal usando uma pinça médios. transferir imediatamente o VNO para um pequeno prato de petri sob um microscópio estéreo em um bloco de gel de gelo, onde as etapas restantes da dissecção será executada. </li><li> Enxaguar o VNO em uma pequena quantidade de gelado S 2 para evitar que o tecido seque. </li><li> Separaram-se as cápsulas que contêm os cartilaginosos tecidos moles VNO, agarrando a parte de trás do osso vômer com fórceps médias. Posicionar a cápsula para uma vista dorsal para que uma divisão entre ambos VNOs se torna visível (Figura 1D i). </li><li> Use a ponta de uma pinça fina para separar ambos cartilagem cápsulas VNO do osso central, mantendo o osso vômer fixado para baixo na parte traseira. Nota: Use uma pinça-se apenas com o rebordo da cápsula de cartilagem e ter muito cuidado de não perfurar a cartilagem como o epitélio sensorial delicado é facilmente danificada. </li><li> Uma vez que os dois VNOs são separados, começar a remover a cartilagem encapsulando os abetost VNO. </li><li> Agarre a borda superior da cápsula com uma pinça fina e se separou da parede cartilagem que foi previamente ligado ao osso vômer (lado medial). </li><li> Para remover o restante cartilagem transformar o VNO com o seu lado lateral curvado para o fundo do prato e com segurança o pino para baixo da cartilagem de um lado com a pinça. Mova cuidadosamente a segunda pinça fina do lado de trás em um ângulo muito plana entre a cartilagem e VNO para soltar a ligação entre o tecido e cartilagem. </li><li> Lentamente descascar a VNO longe da cartilagem, segurando-o em sua ponta caudal, para evitar danificar o epitélio sensorial. </li><li> Uma vez que o VNO é alavancado a partir da cápsula, certifique-se de remover todas as partes da cartilagem pequenas restantes como todos os pedaços de cartilagem irá separar o tecido circundante agarose durante o processo de corte. </li><li> Colocar uma pequena gota de gelado S 2 no primeiro VNO dissecados para evitar danos nos tecidos. Um vaso sanguíneo grande no wil lateralL se tornar visível o que indica que o órgão está ainda intacto e não foi grosseiramente danificado durante a dissecção (Figura 2A II). No caso do vaso sanguíneo ficou danificado, ainda vai valer a pena continuar com cortando o VNO, desde que a morfologia geral não foi claramente prejudicada. </li><li> dissecar imediatamente a segunda VNO. </li><li> Para incorporar a VNOs, preencha os dois pequenos pratos de Petri até a borda com S derretida 3 (armazenado em banho de água a 42 ° C; ver 1.3). </li><li> Segurar o VNO na extremidade caudal mais amplo com uma pinça fina para evitar danos ao epitélio sensorial. </li><li> Mergulha-se o VNO na agarose e movê-lo horizontalmente e para trás diversas vezes para remover a película de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar a partir da sua superfície. </li><li> Posicionar o VNO verticalmente com a ponta virada para o caudal inferior do prato. Em vez de beliscar a VNO com a pinça diretamente, ajustar a orientação, movendo a ponta fórceps em estreita proximity ao VNO. Nota: Orientação durante a incorporação é crucial, uma vez que determina plano de corte e acessibilidade aos neurônios sensoriais durante o experimento. </li><li> Coloque pratos no bloco de gelo gel e esperar até agarose solidificou. Nota: Não alterar a orientação VNO uma vez que a agarose começou a solidificar como isso irá separar o tecido do agarose circundante. </li></ol> 4. Tissue VNO Coronal Cortando <ol><li> Use pequena espátula para remover bloco de agarose do pequeno prato na tampa de uma grande placa de Petri, virar a agarose de cabeça para baixo deixando a ponta do caudal do VNO virada para cima. </li><li> Cortar o bloco em uma forma piramidal usando um bisturi cirúrgico (3-4 mm na ponta, 8-10 mm na parte inferior). Tome cuidado para não danificar o tecido incorporado. </li><li> Use super-cola para fixar o bloco em forma de pirâmide para o centro da placa de amostras vibratome e esperar ~ 1 min para a cola secar completamente. </li><li> Transferir a placa de amostra para o corte cHamber e preparar a segunda VNO, em conformidade. Mantenha a placa com a segunda amostra a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Use um micrótomo lâmina vibrando com as seguintes configurações: espessura: 150-200 mm; velocidade: 3.5 au = 0,15 mm / seg; frequência: 7,5 au = 75 Hz. Transfira as fatias para a câmara oxigenar até à sua utilização depois de inspecionar brevemente morfologia fatia sob o microscópio de dissecação. Fatias pode ser mantida por várias horas. </li></ol> 5. de uma única célula eletrofisiológicos Gravações <ol><li> Para as gravações, usar um microscópio de platina fixa vertical equipado com objectivos de imersão em água, ou Dodt diferencial interferir contraste infravermelho (IR-DIC), e de epi-fluorescência assim como uma câmara CCD arrefecida. Para aquisição de dados, use um amplificador de patch-clamp, palco cabeça, AD / DA placa de interface e um PC (incluindo software de gravação). </li><li> Prepare um estoque de 10-20 pipetas de patch (4-7 mohms). pipetas puxar de capilares de vidro de borosilicato (1,50 mm de diâmetro externo / 0,86 mm DI) usinga extrator micropipeta e fogo-polonês com um microforge. Nota: Fogo polir as pontas de pipeta é crucial quando remendar os bastante pequenas VSNs. Isso ajudará a impedir a ruptura da membrana celular quando a aplicação de pressão negativa, a fim de obter um selo de resistência elevada. Após o polimento da abertura da pipeta deverá ser de aproximadamente 1 uM. </li><li> Manter pipetas num frasco de armazenamento da pipeta para evitar danos e a acumulação de pó até à sua utilização. </li><li> Prepare o sistema de perfusão por encher os reservatórios de solução e tubulação acordo com o projeto experimental. Nota: Remova as bolhas de ar tubulação completamente como eles vão fortemente interferir com registros eletrofisiológicos. </li><li> Ajuste a pressão para alcançar ~ 3 min fluxo ml /. Nota: As altas pressões vão fazer com que o movimento da fatia de tecido, bem como terminação de registos electrofisiolicos. </li><li> Transferir fatia VNO a câmara de imagem e corrigir a posição fatia usando âncora de aço inoxidável com fio com 0,1 mm de espessura syntfibras hetic (Figura 2B - C). Nota: Não cubra a fatia de tecido com um dos fios de fibras sintéticas, mas sim a agarose em torno da fatia. </li><li> Câmara de imagem transferência para a gravação e configuração fatia continuamente superfuse com S oxigenado 2 à temperatura ambiente através de uma aplicação banho. </li><li> Ajustar o capilar de sucção para a superfície da solução para criar uma sucção constante lenta para a troca de solução de banho. Ajuste o 8-em-1 multi-barrel &quot;lápis de perfusão&quot; acima e perto da parte não-sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A) 50. Será benéfico para providenciar lápis perfusão e pipeta de gravação para ficar voltada para a fatia a partir de direcções opostas. </li><li> Ligue o eléctrodo de referência e uma solução de banho através de uma ponte de agar em forma de L (preenchido com KCl 150 mM). </li><li> Preencha pipeta de remendo com uma solução de pipeta S 4. </li><li> Monte a pipeta sobre o eléctrodo adesivo revestido de cloreto de prata ligado ao estágio cabeça sem raspar o revestimento e anexar firmemente. </li><li> Aplicar ligeira pressão positiva (cerca de 1 ml de uma seringa de plástico de 10 ml) para a pipeta patch antes de entrar no banho. </li><li> Abaixe a pipeta no banho usando micro manipuladores longe o suficiente para ser capaz de submergir o objetivo sem bater-lo (Figura 2D). </li><li> Monitorar a resistência da pipeta (R pip, entre 4-7 mohms) usando software eletrofisiologia ligado ao palco cabeça. Nota: Se R pip é &lt;4 mohms a ponta de vidro está quebrado. Se R pip é&gt; 10 mohms, a ponta é mais provável entupidos e da pipeta deve ser substituído. </li><li> Visualize a fatia VNO com um CCD-câmara utilizando contraste de interferência diferencial infravermelho otimizado (DIC) e identificar FPR-RS3-i-Venus células que expressam (ou semelhante neurónios marcados) usando iluminação de fluorescênciae um cubo de filtro apropriado. </li><li> Concentre-se e fluorescentes alvo ou células não-fluorescentes, dependendo do projeto experimental. </li><li> Para se aproximar do corpo celular, usar rodas de mão para o máximo de sensibilidade. Devido à pressão positiva, uma pequena mossa na membrana soma célula torna-se visível uma vez que a ponta da pipeta está em estreita proximidade. </li><li> Libertar a pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para aspirar a membrana celular a fim de obter um selo de resistência elevada (1-20 GÊ). Aplicar sucção curto e suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. </li><li> Monitorar a resistência acesso constante durante a experiência. Nota: Inclua apenas os neurônios que apresentam pequena e estável resistência de acesso (≤3% de entrada R; mudança &lt;20% ao longo do experimento) para análise. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O VNO é uma estrutura quimio que detecta semioquímicos. Até à data, a maioria dos receptores vomeronasais continua a ser deorphanized como apenas pares receptor-ligando algumas foram identificadas. Entre aqueles, V1rb2 foi descrito para ser especificamente activada pela feromona urinária 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado pelo macho feromona específica esp1 57, bem como V2r1b e V2rf2 para ser activado pelos péptidos MHC SYFPEITHI 48 e SEIDLILGY 58, respectivamente. Um pré-requisito para a transdução de compreender as relações de ligandos de receptor de sinal e é o conhecimento das características biofísicas das populações vsn definidos num ambiente nativo. propriedades da membrana passiva e ativa, conductances iônicos dependentes de voltagem e padrões de descarga de ação potencial de definir os meios e em que medida os neurônios receptores respondem a quimio estímulos. registros eletrofisiológicos em fatias de tecido agudos e, em particular, quegravações de patch-clamp de células-le fornecer um excelente método para analisar essas propriedades em grande detalhe. Um passo crítico para gravações fisiológicas bem sucedidos e confiáveis ​​em fatias de tecido é da própria preparação. Para maximizar o intervalo de tempo para realizar experimentos, o tecido deve ser cortado e transferido para solução oxigenada gelada imediatamente após a dissecação. Em seguida, as fatias pode ser mantido por várias horas permitindo a análise de um número substancial de células por dia experimental. É preciso alguma prática para reduzir o tempo para dissecar e incorporar tanto VNOs de um animal em menos de 30 min. Depois disso, a taxa de sucesso por um experimentador experiente para obter várias fatias de tecido intacto com células viáveis ​​é bem acima de 75%. Realizando gravações de patch-clamp é uma abordagem experimental de baixo rendimento em comparação à imagem Ca 2+. No entanto, ele permite uma análise mais detalhada e versátil da atividade no nível de uma única célula com um temporais muito mais elevadoresolução. Na configuração de célula inteira, a forma intracelular é dialisada por a solução da pipeta. Enquanto a solução da pipeta pode não refletir a composição citosólica exato, ele fornece o experimentador com controle exato sobre ambas as condições iônicos extra e intracelulares. Para interpretação confiável de resultados, monitorização contínua da resistência de acesso e corrente de fuga é crucial. Às vezes, um aumento significativo ou forte mudança na resistência de acesso ou vazamento de leads atuais para resultados não interpretáveis ​​e, portanto, exige tais gravações para ser descartados. Além disso, é importante notar que alguns compostos ligam irreversivelmente farmacológicas que os torne necessário substituir as fatias após cada gravação. Gravação na configuração ligado à célula de diálise impede de componentes intracelulares e não influencia o potencial de membrana da célula. Assim, esta técnica fornece uma maneira menos invasiva e relativamente rápido de rastreio. No entanto, este aproACH é geralmente limitado à gravação de super-limiar-driven potenciais de acção correntes capacitivas do lado de fora da membrana celular. Gravações Loose-remendo têm provado ser adequado para analisar o comportamento spiking de um maior número de neurônios sensoriais em fatias VNO 38,54. O modelo transgénico empregada aqui fornece uma ferramenta confiável para identificar e analisar a população de FPR-RS3 expressando VSNs. Além disso, a técnica aqui descrita pode ser estendida a outras linhas, independentemente do seu genótipo. Apesar do enorme vantagem de investigar um tipo celular definido, utilizando ratinhos transgénicos limita experiências para as linhas disponíveis. Recentemente, no entanto, a edição genoma alvo tornou-se mais rápido e mais acessível com a CRISPR / técnica Cas9 59. Em conclusão, alvo gravações de patch-clamp em fatias de tecido vomeronasal agudas proporcionar uma abordagem versátil para caracterizar as propriedades biofísicas e fisiológicas de uma populat definidoion de neurônios sensoriais.

A maioria dos animais dependem muito de seus sentidos químicos para interagir com os seus arredores. O sentido do olfato desempenha um papel essencial para encontrar e avaliar alimentos, evitando predadores e localização de parceiros de acasalamento adequados. Na maior parte dos mamíferos, o sistema olfactivo consiste em, pelo menos, quatro subsistemas anatomicamente e funcionalmente distintas: periféricas do epitélio olfactivo principal de 1,2, o gânglio Grueneberg 3,4, o órgão do septo de Masera 5,6 e o órgão vomeronasal. O VNO compreende a estrutura sensorial periférica do sistema olfativo acessório (AOS), que desempenha um papel importante na detecção de sinais químicos que transmitem informações sobre a identidade, sexo, classe social e estado sexual 7-10. O VNO está localizado na base do septo nasal direita acima do palato. Em ratos, que é um tubo que termina bilateral-cego contidas numa cápsula cartilaginosa 11-13. O órgão consiste em um Epítetos sensorial medial em forma de crescentelium que abriga os VSNs e de uma parte não-sensorial no lado lateral. Entre ambos os epitélios encontra-se um lúmen cheio de muco que está ligado à cavidade nasal através da conduta 14 estreita vomeronasal. Um grande vaso sanguíneo lateral no tecido não-sensorial fornece um mecanismo de bombagem vasculares para facilitar a entrada de moléculas relativamente grandes, na sua maior parte não-voláteis, tais como péptidos ou proteínas pequenas para o lúmen através VNO pressão negativa 15,16. Os componentes estruturais da VNO estão presentes no nascimento e o órgão atinge o tamanho adulto logo antes da puberdade 17. No entanto, se a AOS roedor já é funcional em juvenis ainda está sujeito a debate 18-20. VSNs distinguem-se por tanto a sua localização epitelial e do tipo de receptor de eles expressam. VSNs mostram uma morfologia bipolar com um axónio e não mielinizadas um único dendrite apical que se projecta para o lúmen e termina num botão dendrítica microvilosidades. ax VSNons fasciculate para formar o nervo vomeronasal, que deixa a cápsula cartilaginosa no final dorso-caudal, ascende ao longo do septo, passa a placa cribiforme e projetos para o bulbo olfativo acessório (AOB) 21,22. O epitélio sensorial vomeronasal consiste de duas camadas: a camada apical está localizada mais perto do lado luminal e portos tanto V1R- e todos menos um tipo de FPR-rs-expressando neurónios. Esses neurônios co-expressar o G αi2 à proteína G α-subunidade e projeto para a parte anterior da AOB 23-25. Neurônios sensoriais localizadas nas V2Rs expressas camada mais basal ou FPR-rs1 ao lado G αo e enviam seus axônios para a região posterior da AOB 26-28. Vomeronasal neurónios são activados por provavelmente bastante pequenas (29-33 semioquímicos V1Rs) ou compostos proteicos (34-38 V2Rs) que são secretadas em vários fluidos corporais, tais como urina, saliva e fluido lacrimal 37,39-41 </sup&gt;. Em experiências in situ demonstraram que VSNs também são activadas por péptidos formilados e vários compostos antimicrobianos / ligada à inflamação 25,42. Além disso, de forma heteróloga expressa proteínas FPR-R partilham espectros de agonistas com FPRs expressas no sistema imunitário, indicando um potencial papel como detectores de doença em animais da mesma espécie ou de fontes de alimentos deteriorados 25 (ver referência 43). Fundamental para a compreensão das relações receptor-ligando e cascatas de sinalização a jusante em populações específicas VSN é uma avaliação detalhada de suas características biofísicas básicas em um ambiente nativo. No passado, a análise de sinalização celular grandemente beneficiado a partir de animais geneticamente modificados que marcam uma população definida de neurónios por co-expressam uma proteína marcador fluorescente 30,44-49. Neste protocolo, uma linha de ratinhos transgénicos que expressa FPR-RS3 em conjunto com um marcador fluorescente (FPR-RS3-i-Vénus) é usado.Esta abordagem exemplifica como empregar tal estirpe de ratinhos geneticamente modificados para desempenhar análise eletrofisiológica de uma população de células opticamente identificáveis ​​utilizando único neurônio gravações de patch-clamp em coronais fatias aguda do tecido VNO. Uma pressão-driven de ar do sistema de perfusão multi-barril para estímulos sensoriais e agentes farmacológicos permite a estimulação neuronal rápida, reversível e focal ou inibição durante as gravações. gravações de célula inteira em preparações fatia permitir uma análise detalhada das propriedades intrínsecas, conductances activado tensão, bem como padrões de descarga potencial de ação no ambiente nativo da célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Chemicals</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agarose (low-gelling temperature)</td>
			<td style="width:133px;">PeqLab</td>
			<td style="width:116px;">35-2030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ATP (Mg-ATP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A9187</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B9879</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C1016</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">E3889</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G8270</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">GTP (Na-GTP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">51120</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">H3375</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">M8266</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">P9333</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">03564</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S7653</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S8045</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Surgical tools and consumables</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Large petri dish, 90 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, dissection of VNO capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small petri dish, 35 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp large surgical scissor</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, removal of lower jaw</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Strong bone scissors</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting incisors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Medium forceps, Dumont tweezers #2</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">removing skin and palate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting out VNO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small stainless steel spatula</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">handling agarose block and tissue slices</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting agarose block into pyramidal shape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Name</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:275px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Amplifier</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">EPC-10</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td>
			<td style="width:133px;">Science Products</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">CCD-camera</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">DFC360FX</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">I3</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">EL6000</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hot plate magnetic stirrer</td>
			<td style="width:133px;">Snijders</td>
			<td style="width:116px;">34532</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">MF-830</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator Device&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">SM-5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micropipette puller, vertical two-step</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">PC-10&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">CSM DM 6000 SP5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td>
			<td style="width:133px;">Quest Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">HCX APO L20x/1.00 W</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:133px;">Tektronik</td>
			<td style="width:116px;">TDS 1001B</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Osmometer&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Gonotec</td>
			<td style="width:116px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Perfusion system 8-in-1</td>
			<td style="width:133px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">pH Meter five easy</td>
			<td style="width:133px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Pipette storage jar</td>
			<td style="width:133px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:116px;">e212</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Razor blades</td>
			<td style="width:133px;">Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td style="width:116px;">Wilkinson Sword Classic</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td>
			<td style="width:133px;">custom-made</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">S4E</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trigger interface&#160;</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">TIB-14 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">VT 1000 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Memmert</td>
			<td style="width:116px;">WNB 45</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Para obter insights sobre as propriedades biofísicas e fisiológicas de populações de células definidas, realizamos fatias de tecido coronal agudas do rato VNO (Figura 1-2). Após a dissecção, as fatias podem ser mantidos em solução extracelular oxigenado gelado (S 2) por várias horas. Na configuração de gravação, uma troca constante com solução oxigenada fresca (Figura 2D) garante a viabilidade do tecido durante todo o experimento. Nós aqui empregar um modelo de rato transgénico (FPR-RS3-i-Vênus). VSNs nesta estirpe de co-expressar uma proteína marcador fluorescente com FPR-RS3, um membro prototípico do FPR-RS família de genes (Figura 3) que permite a identificação óptica de uma população definida de neurónios sensoriais. registros eletrofisiológicos fornecer os meios para análise em profundidade no nível de uma única célula. Por exemplo, a análise de correntes dependentes da voltagem é realizada na tensão-grampomodo (Figura 4A - B). Para isolar tipos específicos de correntes iónicas, as fatias são superfundidas com agentes farmacológicos tais como TTX para inibir as correntes dependentes da voltagem de Na + (Figura 4A) ou nifedipina para bloquear dependentes da voltagem tipo-L de Ca2 + correntes (Figura 4B). Além disso, nós rotineiramente gravações de células inteiras na configuração de fixação de corrente para analisar os padrões de descarga de potencial de acção (Figura 4C). Além de gravações de célula inteira, gravações ligado à célula &#39;solta-seal &quot;fornecer um método menos invasivo que impede a diálise de componentes intracelulares (Figura 5A). A gravação da acção potencial orientado correntes capacitivas a pedido curta estímulo oferece uma maneira sensível e eficiente para triagem de ligantes sensoriais (por exemplo, principais proteínas urinárias; MUPS) que ativam populações de células 51 (Figura 5B) definidos. = &quot;Jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig1.jpg" /> Figura 1: Dissecção do VNO. (A) Vista lateral na cabeça de rato para ilustrar a posição e ângulo em que os incisivos são cortadas. (B) vista ventral que descreve o melhor ponto para agarrar e descascar o palato superior (UP). (C) vista ventral na cartilagem cápsula (CC), que abriga o VNO e o osso vômer (VB) após a remoção das inferior da mandíbula, incisivos e paladar. View (D) dorsal da cápsula VNO dissecados que descreve a localização bilateral de ambos VNOs (D i). A vista lateral, ilustra o aro de cartilagem no lado dorsal, onde ambos VNOs precisa ser separada (D II). Barra de escala = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparação do tecido, e a gravação câmara de platina do microscópio vista lateral esquemática sobre um VNO para ilustrar o curso e a posição do vaso sanguíneo (BV) em parte não-sensorial do epitélio (A i). A linha tracejada representa a camada de corte coronal. Vista lateral em um VNO descascados fora do CC mostra o vaso sanguíneo (A ii). (B) de agarose-embedded coronal fatia de tecido VNO fixado ao fundo da câmara de gravação cheio de solução usando uma âncora de fio de aço inoxidável com 0,1 mm de espessura de fibra sintética tópicos (SF). A área de box descreve a agarose em torno da fatia de tecido. (C) Representação esquemática ilustrando a posição e orientação de um agarose (Ag) -embedded coronal fatia VNO posicionada entre duas fibras. (D) Relação da câmara de gravação colocado sobre a platina do microscópio. A câmara é equipada com aplicação no banho (BA) para superfusão constante com oxigenado S 2, o lápis de perfusão (PP) para aplicar estímulos sensoriais ou agentes farmacológicos, a pipeta de gravação (RP) ligado à fase cabeça amplificador, o eléctrodo de referência (ER ) e a sucção capilar (SC) para manter uma troca constante de solução na câmara. Barra de escala = 1 mm (A ii). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig3.jpg" /> Figura 3: TISS VNO coronaisfatia ue. (A) imagem confocal (projeção máxima) de uma fatia de tecido 150 um aguda coronal VNO mostrando a distribuição dos FPR-RS3 tau-Venus + neurônios fluorescentes (verde) no epitélio sensorial vomeronasal. vaso sanguíneo (BV), lúmen (L), epitélio sensorial (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + neurônios exibem um único dendrito apical terminando em uma estrutura de botão-like na fronteira luminal. De célula inteira gravações de patch-clamp foram realizadas a partir da soma VSN, remendo pipeta (PP). (C) Morfologia de uma única VSN com o botão dendrítica (K) na ponta do longo e estreito dendrítico (D), a soma celular (S) e o axónio (A) deixando a soma do lado basal. As barras de escala, 50 uM (A), 10 uM (B), 5 uM (C). Este valor foi modificado a partir de 52. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig4.jpg" /> Figura 4: Isolado Na + e Ca2 + correntes dependentes de voltagem, bem como descarga de pico (A) traços representativos de-célula inteira gravações de patch-clamp de um jejum de ativação corrente de Na + sensíveis a TTX na FPR-RS3 + VSNs.. (A i) a gravação etapa de tensão em condições de controle (solução extracelular S 1; intracelular solução S 4) revela uma dependente de voltagem transiente rápido e interior atual. (A II) tratamento TTX (1? M) diminui fortemente a corrente. Traço subtraído digitalmente (control-TTX (A iii)) reveals da voltagem-corrente de Na + TTX-sensível. Relações corrente-tensão das correntes TTX sensíveis Na + isoladas de controlo e FPR-RS3 + neurônios (A iv). (B) Representante Ca2 + traços atuais isolado farmacologicamente (10 mM de nifedipina). (C) representativos vestígios de aperto atual mostrando de- / hiperpolarização e trens de potenciais (rebote) ação gerados mediante positiva passo a passo (C i) e negativo (C iii) injecção de corrente. Observe a atividade espontânea medida a 0 pA injeção de corrente (C ii). (Iv C) frequência de disparo de controle e FPR-RS3 + neurônios como uma função da corrente injetada (I injetar). O aumento gradual na taxa de disparo é semelhante para o controlee FPR-RS3 + VSNs. Note-se que VSNs são extremamente sensíveis às injeções atuais, mesmo nos picoamperes gama baixa 53-56. Note-se que as curvas -I f foram &quot;background-corrigido&quot;, usando a frequência spiking espontânea em 0 pA injecção de corrente. Os dados são médias ± SEM. Este valor foi modificado a partir de 52. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig5.jpg" /> Figura 5: gravações extracelulares &#39;remendo&#39; solta de VSNs basais (A) imagem IR-DIC de uma fatia de tecido VNO aguda que descreve a pipeta de gravação na camada basal do epitélio sensorial.. (B) representativas gravação original de um VSN basal na configuração ligado à célula (&amp;# 39; solta-seal &quot;) respondendo com rajadas transitórios curtos de picos para breve estímulos (3 seg) com expressos de forma recombinante principais proteínas urinárias em pool (rMUPs) e uma concentração de potássio elevado (50 mM, 1 seg), respectivamente (B i) . Maior ampliação das gravações mostrados em (B) ilustra i explosões de picos em resposta a estímulos (B II). As barras vermelhas indicam tempo de estimulação, intervalo inter-estímulos = 30 segundos, a gravação contínua, interrupções &lt;1 seg (marcas de corte //). Barra de escala = 5 | iM (A). Painel (A) tenha sido modificado a partir da referência 38. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.5K visualizações.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

Vídeo: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Neurociência

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...