O desenvolvimento de qFSM é financiado pelo NIH a concessão U01 GM06230.

Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha. Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a meta exposta resíduos de lisina sobre a superfície da actina. </li><li> Ao escolher o seu fluoróforo e seu comprimento de onda adequado, assegurar que sua configuração de microscópio tem os filtros adequados (excitação e emissão) e iluminadores (de vapor de mercúrio da lâmpada e / ou lasers) para acomodar sua etiqueta fluorescente. Recomendamos selecionar comprimentos de onda na laranja para comprimentos de onda vermelho (560-630 nm) para minimizar os efeitos da auto-fluorescência e foto danos e garantir a sua compatibilidade com GFP-conjugados. </li><li> Actina pura pode ser extraído de tecido muscular pertencente a Rat ou frango, mas requer um longo procedimento de extração do pó de acetona muscular. Pó de acetona muscular pode ser comprado de Invitrogen. O procedimento de rotulagem não é discutido neste protocolo, mas pode ser encontrada aqui [1] </li><li> Alternativamente, você pode comprar as proteínas actina marcada por vários fabricantes, incluindo Citoesqueleto Inc., e Invitrogen. Serviços de rotulagem personalizadas também estão disponíveis através Invitrogen. Purificada, não-rotulados de actina (actina músculo e nonmuscle) pode ser comprado de Citoesqueleto Inc. </li><li> Se você decidir comprar ou preparar o seu próprio rótulo de actina, que pretende assegurar que o rácio de rotulagem é algo em torno de 0,3-0,7 por corantes monômero de actina. Muito alto índice de rotulagem podem afetar a cinética de volume de negócios (e ligação às proteínas associadas) do filamento de actina, enquanto uma proporção muito baixa rotulagem vai levar a manchas pobres procurando (baixo sinal de ruído) e pode causar problemas microinjeção (veja abaixo). Este é um fator crítico para conseguir boas imagens speckle. </li><li> Antes do armazenamento a longo prazo, a solução de actina rotulados devem ser esclarecidas por girando a 75.000 - 80.000 xg por 20 minutos a 4 graus Celsius. Actina rotulado deve ser armazenado em G-buffer solução e mantidos -80 graus Celsius. Preparando-se alíquotas de 2 uL é altamente recomendado para reduzir os efeitos prejudiciais de congelamentos e descongelamentos repetidos (leva a agregados insolúveis). Abster-se de expor a solução actina marcados à luz direta (será fotobranqueamento de fluoróforos). Recomendamos a utilização de tubos de microcentrífuga opaco para armazenamento a longo prazo. </li></ol> Seção 2: Preparação de Células e microinjeção de actina rotulados Materiais necessários: agulhas microinjeção, micro, microloaders, a mídia celular pré-aquecida, buffer de injeção, balde de gelo, microscópio (anel fase, o objetivo de contraste de fase 40X, transjector, agulha extrator, micromanipulador) <ol><li> Muitos tipos de células são passíveis de FSM, mas ficando bom speckle imagens é diretamente dependente do sucesso do procedimento microinjeção. Ao selecionar células para FSM, as células devem ser grandes (&gt; 50 um de diâmetro), deve se espalhar quando banhado, e ser naturalmente aderente sobre substratos (ou placas de cultura de tecido de plástico). Também ajuda se citosol da célula ocupa uma área maior do que o seu núcleo. Os critérios acima referidos assegurar que as células são passíveis de microinjeção. Linhagens de células bem sucedidos candidatos incluem (mas não limitado a) PtK1 [2,3], as células do pulmão newt [4], neurônios e Aplysia [3]. </li><li> As células devem ser semeadas em lamínulas quadrados (22 x 22 mm;. 1-1/2 não) que tenham sido lavada com ácido. Revestimento de substrato padrão pode ser aplicado para as lamelas e não afetará microinjeção. </li><li> A correta seleção de agulhas microinjeção é dependente do tamanho da abertura da ponta. Normalmente, o tamanho buraco pode muito em tamanho de 0,5 UM para tão grande como 3 um. No entanto, recomendamos que a injeção de actina requer um tamanho de abertura ideal entre 0,5-1 um. Se os problemas de entupimento são encontradas de forma consistente, tamanhos maiores podem acomodar buraco para a entrega de monomérica, bem como indesejados filamentos de actina polimerizada. Microinjeção agulhas podem ser adquiridos através de vários fornecedores, incluindo sistemas de Eppendorf que fazem agulhas microinjeção femtotip. Alternativamente, se um extrator de agulhas comercial está disponível, tubos de vidro pode microinjeção comprado de Sutter, e puxou a especificação. Para os iniciantes, é recomendável ter puxado 20/10 agulhas na mão antes de iniciar o procedimento de injeção. </li><li> &quot;Concentração de injecção&quot; ideal (concentração final de actina carregado em sua agulha) de actina é entre 0,5-1,0 ug / ul baseado em uma relação de rotulagem de 40% de corante para monômero de actina. Uma baixa relação de rotulagem de seu actina pode ser compensada pela injeção em concentrações mais elevadas (1-3 ug / ul). No entanto, a freqüência do seu entupimento da agulhaser aumentado. Isto pode ser parcialmente aliviado pelo uso de agulhas com aberturas maiores. Concentração de ações de actina pode ser diluído adicionando gelada buffer de injeção. Gelada ddH2O também pode ser usado para diluir para injectáveis ​​rápido. Neste ponto todas as soluções de trabalho devem ser mantidos em gelo. </li><li> Carga 0,5-1,0 uL da solução de actina, utilizando uma micro (de bitola estreita - Hamilton), ou, alternativamente, usando um microloader ponta da pipeta. </li><li> Cuidadosamente dispensar a solução de actina, liberando suavemente a solução. Bolhas devem ser evitadas, mas podem ser facilmente removidas, tomando-se o excesso de líquido ao redor da bolha. </li><li> Garantir que a solução de actina está descansando completamente na ponta da agulha. Excesso de solução em qualquer lugar ao longo do capilar da agulha pode interromper o fluxo de injeção. </li><li> Agora, coloque a agulha com cuidado, evitando contato com a ponta da agulha, ao titular do injetor. Posição do suporte, de modo que a agulha faz um ângulo de 35-50 para a base do palco microscópio. Ângulos inferiores são preferidas. </li><li> Abaixe a ponta da agulha até que mal rompe a superfície da mídia banhos suas células. </li><li> Agora posicione a ponta da agulha (sem baixar) para que ela repousa diretamente acima do centro do objetivo. Se a ponta da agulha está alinhada com o objetivo, você deve ver um halo luminoso através da ocular. Este é o fim da ponta da agulha. Se movendo lentamente para o lado da agulha para o lado (usando o manipulador) pode ajudar a localizar o melhor halo. </li><li> Ajustar o foco z-on do microscópio até as suas células estão em visão clara. Agora, abaixe lentamente a ponta até o halo constricts gradualmente até que finalmente convergindo para a ponta da agulha - você terá que controlar o foco (z-posição) simultaneamente. Uma característica adicional é a olhar para o eixo da agulha, que vai lançar sombras linear. Abaixando a agulha irá gradualmente define o eixo da agulha. Quando feito corretamente a ponta da agulha e suas células devem ser ambos na visão clara. Ligeiro ajuste do anel de fase pode ser necessária para melhorar o contraste. </li><li> Quando estiver navegando, certifique-se da ponta da agulha está bem acima de suas células para impedir a quebra da ponta da agulha. </li><li> Ao selecionar células para injetar, as células com bordas livres deve estar voltado para a ponta da agulha. Isso irá garantir inclinação declínio da célula (do ponto mais espesso, onde reside o núcleo, para o ponto mais fino da borda) se reunirá na ponta da agulha, ao invés de correr paralela a ele. </li><li> A pressão da agulha deve ser fixada em 0,3-0,8 psi. A constante pressão aplicada resultará em um fluxo constante de solução de actina. </li><li> Depois de decidir sobre uma célula para injetar, a posição de sua agulha para a ponta fica ao lado do núcleo (região perinuclear, parte mais grossa da célula onde o núcleo não está diretamente abaixo). </li><li> Abaixe lentamente, e reajustar a posição da agulha até que a ponta é deprimente a membrana, agora um pouco mais baixa até a ponta da agulha perfurou a membrana. Se a agulha estiver completamente perfurado a membrana, a célula irá aparecer mais brilhante, assim como você vê essa diferença levantar a agulha até que não é mais tocar no celular. O piercing reais e processo de injeção terá 0,5-2 segundos. </li><li> Quando feito corretamente, a forma da célula aparecerá inalterado, ao passo que injeções muito vai resultar em retração rápida da borda da célula e, em alguns casos, você vai realmente ver o celular explodir. </li><li> Se você não vê mudanças na célula quando microinjecting (não fica mais brilhante), a ponta da agulha pode ser fechado. Você pode testar isso pressionando o botão &#39;clean&#39; se disponível no seu transjector. Se abrir, isso irá aumentar significativamente o fluxo constante pressão que pode ser visto através da ocular - ele irá aparecer como ondulações e detritos nas proximidades pode ser visto dispersar. </li><li> Se a ponta da agulha está fechado, você pode optar por inserir uma agulha microinjeção novo ou tentar quebrar a ponta da agulha delicadamente abaixar a agulha até que a ponta da agulha pressiona contra a lamela de vidro, causando assim o fim da ponta para quebrar. A área de quebra não deve ser mais do que um dia 05/01 da área da ponta da agulha (a parte da agulha que começa a convergir para um ponto). </li><li> Continue com a injeção, não gastar mais de 20-45 minutos para cada sessão de microinjeção (vai depender do tipo de célula). Como regra geral, as sessões mais curtas são recomendadas para minimizar o estresse nas células. </li><li> Depois de terminar a microinjeção, alterar a mídia celular no prato, adicionando novas mídias pré-aquecido. Em seguida, permitem que as células para recuperar por 30 minutos em uma incubadora antes de imagem. Isso também irá permitir a actina para se integrar na rede de citoesqueleto existente. </li></ol> Seção 3: Montagem da Câmara de imagem Materiais necessários: lamela, fita dupla face, q-dicas, fórceps, valap, kim wipe, oxyrase, mídia de imagem, lâmina de barbear, p200 piPette, etanol puro <ol><li> Comece por pré-aquecimento a mídia de imagens e descongelamento de uma alíquota de 15 uL de Oxyrase. Certifique-se de proteger o oxyrase fotossensíveis da luz. A adição de oxyrase vai reduzir muito os efeitos da fotodegradação. </li><li> Pré-aquecer o valap, definindo a temperatura da placa quente para baixo. Não sobreaquecer / queimar o valap para ela perderá sua eficácia como um selante. </li><li> Limpe uma lamela com uma kimwipe encharcados com etanol puro para limpar e remover detritos de pequeno porte. </li><li> Empilhar duas iguais comprimentos de tamanho (2,5 cm de comprimento) de fita dupla face em cima uns dos outros, usando uma superfície limpa e plana como uma plataforma. Pressione para fora todas as bolhas de ar aprisionadas para criar um avião completamente plana. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar duas tiras retas ao longo do eixo, de modo que cada tira medidas 0,5 cm de largura. </li><li> Utilizando uma pinça, coloque cada tira contra a borda longa de sua lamela para que as duas tiras de fita cria uma lacuna no centro de sua lamela. Pressione suavemente a fita para fazer um selo agradável com o vidro. As tiras de fita irá atuar como espaçadores entre a lamínula ea lamela. </li><li> Verifique se o valap completamente liquefeito antes de começar o próximo passo. </li><li> Recuperar sua mídia de imagens pré-aquecida, adicionar 15 ul de oxyrase a cada 500 uL de mídia. </li><li> Kimwipes vezes em triângulos para criar três arestas duras. Isso será usado para criar uma superfície seca para a fita de pau-a. </li><li> Recuperar as células da incubadora. Utilizando uma pinça, pegue um canto da lamela. Rapidamente colocar a lamela numa kimwipe (lado da pilha é virada para cima, sem tocar no tecido), e usar o kimwipe dobrado para limpar dois lados opostos da lamela para criar uma superfície semi-seca (na superfície onde seu descanso células). </li><li> Utilizando uma pinça, pegue um canto a lamela e colocá-lo em seu lamínula de forma que as superfícies secas são alinhados com as duas tiras de fita. Observe agora você tem dois lados fechados e duas fendas abertas. Lentamente pipeta 200 uL de sua solução de imagem-media-oxyrase perto de uma abertura. Importante, sem bolhas de ar deve ser introduzido. A solução deve ser sugado para dentro da câmara recém-montado por forças capilares, mergulhando assim por completo as suas células em solução. </li><li> Usando um dab Q-Tip os quatro cantos da sua lamela com valap derreteu rapidamente apor e estabilizar as lamelas. Você notará que a seca valap instantaneamente (dentro de segundos à temperatura ambiente). </li><li> Começando agora com as laterais abertas (fita não-lateral), coloque uma tira fina de valap usando um Q-Tip e imitando um derrame escovação. Repita o procedimento para as laterais fechadas. Lentamente construir o brasão de valap, reforçando assim o selo repetindo as etapas de revestimento. O valap deve ser confinada às bordas, deixando o centro da lamela claro. </li><li> Limpar delicadamente a parte central da lamela usando um Q-ponta com ddH2O de remover qualquer mídia residual, estar atento para não esmagar as células. Repita o passo de limpeza com etanol puro. </li><li> Você agora terá uma câmara de imagem completamente fechado otimizado para speckle imagem. Ter um gabinete totalmente fechado irá impedir o seu fluoróforos de forma rápida fotodegradação. </li></ol> Seção 4: células de imagem Materiais necessários: microscópio invertido campo amplo, lâmpada Mecury, filtros apropriados, resfriado CCD da câmera com 6,7 micron pixels, abertura numérica de alta, o óleo de imersão plano Apocromático objectivos (60X a 100X fase ou DIC). Mesa de vibração. Software de imagem. <ol><li> Pré-aquecer o palco microscópio para 37 graus. Coloque a sua câmara de imagem recém-concluído, e esperar 10-15 minutos para a temperatura se estabilize antes de imagem. </li><li> Comece por focar suas células no campo-Bright, e depois encontrar o seu células injetadas, alternando as configurações corretas de fluorescência. Tentar minimizar o tempo de exposição de fluorescência para reduzir a fotodegradação. </li><li> Procure por células injetadas que têm curvas saudáveis ​​bordos de ataque. Over-injetaram células (células explodiu) será caracterizado por bordas irregulares e retraído, assemelhando-se filopodia numerosos - evitar imagens dessas células. </li><li> Configurações aquisição vai depender do tipo de célula, a qualidade da actina rotulados, e os componentes do microscópio. No entanto, as configurações de exposição não deve ser superior a 2 segundos, e intervalo de tempo entre os quadros devem ser fixados entre 5 e 10 segundos. Comprimentos típico para uma série de tempo (por célula imaged) pode variar entre 10 a 30 minutos, e está limitada por efeitos de fotodegradação. Ajustes de ganho na câmera pode ser girado para cima para aumentar o sinal ao ruído. </li><li> Ideal speckle características deve ter cada speckle espaçadas por ~ 2 speckle diâmetros para a vizinha próxima speckle. Isto garante amostragem espacial e temporal ideal da estrutura de actina. Para células epiteliais, a rede de actina salpicado aparecerá homogênea, com manchas uniformemente separados. Linhagens de células que apresentam fibras de stress densa ou lamellipodiaserão distinguíveis, mas terá uma aparência pontilhada / salpicada. As configurações de exposição deve ser ajustado para obter as melhores imagens salpicada. </li><li> Over-microinjeção células terão manchas densamente que não parecem ser discretos. Fibras de stress e as lamellipodia perderá sua aparência pontilhada. </li><li> Sub-microinjeção células aparecerá muito fraca através da ocular, contendo manchas que estão distantes (&gt; 10 manchas de intervalo) e aparecendo aleatoriamente dispersos. Fibras de stress e as lamellipodia nessas células serão indistinguíveis. </li><li> Chave para a obtenção de &quot;bom&quot; speckle filmes é manter o foco. Isto é particularmente importante para o pós-análise envolvendo speckle fluxo e medições de volume de negócios. Assim, a qualidade da análise quantitativa dependerá de bloqueio no foco para a duração do lapso de tempo. Isto pode ser particularmente difícil se o plano de imagem é bastante fino. Outros fatores dependerá da estabilidade do sistema microscópio, particularmente a carcaça de palco e da câmara de imagem. Baseado em contraste com foco pode ser usado se comprimentos intervalo de imagem são suficientes para acomodar esse recurso. Outras opções incluem a compra de um infravermelho próximo sistema baseado focando confiável que fornece ajustes em tempo real foco. Você pode encontrar essas ofertas da Nikon, Olympus e ASI. </li></ol> Seção 5: Análise qFSM Esta seção não é discutido em detalhe, mas a informação sobre o software de análise pode ser encontrada aqui [5]. Pedidos de download do software podem ser feitas em nosso site (lccb.scripps.edu). Tópicos abordados: <ul><li> Calibração do ruído </li><li> Speckle detecção </li><li> Rastreamento usando uma abordagem híbrida de monitoramento de imagem de correlação baseado do movimento grosseiros das áreas speckle e rastreamento única partícula do movimento detalhado de manchas individuais. </li><li> Computação da assembléia de polímero e as taxas de desmontagem das flutuações de intensidade durante speckle aparência e eventos desaparecimento. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e sobrevivência), as células precisam para ser injetado com uma pressão de baixa vazão, apresentando uma baixa concentração de proteína rotulados. Isto requer algum grau de conhecimento técnico / experiência com relação ao uso do sistema de microinjeção. Como regra geral, menor tempo de injeção (&lt;1s) têm preferência sobre tempos mais longos de injeção. O último componente crucial é o microscópio. Um microscópio invertido emparelhado com uma lâmpada de mercúrio, epi-iluminador, encontrado na maioria das instalações do núcleo, servirá como uma plataforma adequada para speckle imagem. Assumindo que os filtros adequados de fluorescência estão no lugar, a combinação de um objectivo NA alta e uma câmera CCD refrigerado irá produzir imagens de alta resolução de tonalidades claras. Recomendamos o uso de grande aumento (100X), alta NA (&gt; 1,3), plano de Apochromat-objectivos que irá proporcionar uma resolução superior e brilho. Em condições de injeção ideal, a ampliação pode ser reduzido para 60X, aumentando o brilho eo SNR por pixel. Baixo ruído, alta eficiência quântica, câmeras CCD refrigerado, com tamanhos de pixel de ~ 6,5 microns são detectores ideal, e em alguns casos, podem compensar as sondas fluorescentes de baixa qualidade. Além disso, as sondas proteína fluorescente etiquetado pode ser co-injetados com construções de cDNA (nucleoinjection) para expressar GFP / RFP proteínas conjugadas dentro da mesma célula. Isso requer o nucleoinjection de cDNA para o núcleo das células, seguido por uma segunda injecção no citoplasma circundante. Em resumo, FSM fornece insights sem precedentes na dinâmica do citoesqueleto. Obtenção de bons manchas requer as sondas adequadas, equipamentos e um pouco de paciência (treinamento).

Injeção de buffer (IB) 50 mM glutamato de potássio 0,5 M MgCl2 (ANEXO 2A) Armazenar até 2 anos a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Apêndice 2A) 0,2 mM CaCl2 (ANEXO 2A) Adicionar imediatamente antes da utilização: 0,2 mM ATP (ver receita para 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Armazenar até 1 dia a 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis ​​a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.9K visualizações.  Scripps Institute. Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...