Este trabalho foi financiado pelo NIH Grants 068.625, Subsídios NSF 1063188 e Centro de Física de células vivas 0822613. agradecimentos especiais vão para o Dr. Marina Marjanovic no Instituto Beckman para Ciência Avançada e Tecnologia para o dom de olhos de coelhos.

Declaração de Ética: O tecido da córnea de coelhos foi coletado de acordo com a Universidade de Illinois Institutional Animal Care e Uso diretrizes. Configuração 1 TIRFM NOTA: Utilizar óculos de laser de segurança o tempo todo. <ol><li> Certifique-se de que todos os componentes ópticos necessários listados na Lista de Materiais estão disponíveis e prontos para o alinhamento. Se necessário, usar substitutos com funções equivalentes de outras empresas. Certifique-se de que os espelhos e lentes devem ter (AR) revestimentos anti-reflexo que correspondem o laser em uso. </li><li> Definir as alturas de todos os elementos ópticos com a altura do centro do microscópio para trás da porta. </li><li> Monte a laser, obturador laser e filtro ND (s). Uso de filtros ND para atenuar a energia do laser para baixo tão baixo quanto possível, mantendo o feixe visível. Apertar os parafusos com chaves sextavadas apropriadas. </li><li> Planeje um caminho do feixe e marcá-lo com fita adesiva ou marcador na mesa óptica (dotted linhas azuis na Figura 1). Para simplificar, manter caminhos retos ao longo de linhas de furos na tabela óptica. </li><li> Local espelho M1 (Figura 1), na primeira vez em ângulo recto. Coloque as duas íris ao longo da segunda seção reta do caminho do feixe planejado. Ajuste a posição ea inclinação do M1 tal que o laser atravessa a íris. </li><li> Local espelho M2 (Figura 1) no segundo turno ângulo recto. Inserir o expansor de feixe de 10x (L1 e L2, a Figura 1) ao longo da terceira secção do percurso linear. Ajustar a inclinação tal que o expansor de feixe é paralelo tanto a tabela e o caminho óptico do feixe planeado. <ol><li> Ajustar M1 e M2 de forma iterativa de tal forma que o laser passa a direito através dos centros das duas lentes de o expansor de feixe. Repita este passo até que o perfil do feixe do feixe expandido não é cortada de Gauss. </li></ol></li><li> Ajuste M1 para centralizar o feixe em L1 (Fifigura 1) e M2 para centrar a viga na L2 (Figura 1) de forma iterativa. Um perfil de feixe mau geralmente significa que o laser é cortada; usar uma folha de papel branca para bloquear o feixe depois do expansor de feixe para verificar o perfil do feixe com os olhos. Para a análise de alta precisão, use um profiler feixe óptico. </li><li> Ajustar a distância entre L1 e L2 de tal modo que o feixe é colimado. Repita o passo 1.8 e 1.9, se necessário. NOTA: Quando o tamanho do feixe não muda com a distância, o feixe é colimado suficiente para uma instalação TIRFM. Para melhorar ainda mais a colimação do feixe, ferramentas como um interferômetro de corte poderia ser utilizado. Um tamanho típico feixe depois da expansão é de aproximadamente 20 mm. </li><li> Obturador do laser. Desenrosque a objetiva do microscópio e parafuso em um alvo alinhamento fluorescente. Colocar espelhos M3 e M4 (Figura 1) para direccionar o feixe expandido na porta microscópio e sobre o espelho dicróico dentro da torre. Certifique-se de que o feixe de laser rebate tele dicróicas e para o teto. </li><li> Ajuste M3 para centralizar a parte mais brilhante do feixe no alvo fluorescente, e M4 para ajustar a inclinação do feixe a ser vertical. </li><li> Obturador o laser e parafuso o objetivo novamente. Se o alinhamento na etapa anterior é bem feito deve haver um ponto simétrico de sair do objetivo. Ajuste as inclinações do M3 e M4 para otimizar a potência do laser e perfil do feixe do objetivo. </li><li> Montar uma câmera EMCCD ao microscópio e conectar a câmera a um computador. Inicie o software para a câmera. </li><li> Montar uma amostra fluorescente (solução de fluoróforos) sobre o microscópio. Olhe para a mancha fluorescente brilhante na câmara. Verifique se o local não se desloque na tela como o foco é alterado. </li><li> Coloque a lente TIR (L3, Figura 1) na fase de tradução XYZ, a uma distância a partir do plano focal posterior da objectiva, que é igual ao comprimento focal de L3 (~ 30 cm). Ajuste a posição da L3de tal forma que o laser passa através do centro da lente. </li><li> Traduzir L3 ao longo do percurso do feixe para ajustar a colimação de feixe. Certifique-se de que o feixe ainda está centrada no monitor e simétricos em forma. NOTA: A área de iluminação no plano da amostra aumenta com a diminuição da lente TIR comprimento focal. Em geral, use o comprimento focal menor que poderia caber no set-up. </li><li> Traduzir L3 perpendicular à trajetória do feixe de inclinar a trave do objectivo. Manter traduzindo a lente de modo a que TIR TIR é alcançado. Observar uma amostra de partículas fluorescentes através da câmera EMCCD, e afinar L3 para obter um bom SNR. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 configuração óptica para microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). 2. fIONA em Cy3 ADN <ol><li> Clâminas de microscópio e magras lamelas: Lavar lâminas de microscópio e lamelas com DDH 2 O e isopropanol e seque-os com gás nitrogênio; coloque as lâminas e lamelas do limpador de plasma por 5 min sob plasma de argônio. </li><li> Construir câmaras de amostras (como esboçado na Figura 2). <ol><li> Coloque um tecido sobre o banco e, em seguida, colocado um pedaço de papel de lente na parte superior do tecido. Coloque o slide no papel lente. Certifique-se de que o lado limpo do slide é para cima. </li><li> Aplicar duas tiras de fita dupla face para o slide ao longo das bordas longas, deixando um espaço de 3-5 mm no centro. Coloque a lamela limpa em cima do slide. Certifique-se de que o lado limpo da lamela está voltada para o slide. </li><li> Use uma ponteira para pressionar para baixo sobre a fita dupla face. Use uma navalha para remover o excesso de fita a partir da corrediça de modo que a fita se mantém apenas sob a lamela. NOTA: As extremidades abertas da câmara são deixadas abertas e servem como entrada e para foradeixar. O volume da câmara é de vários microlitros. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Esboço de uma câmara de amostra típica (a) Vista superior.; (B) Vista lateral da direita; (C) Vista lateral da parte dianteira. <ol start="3"><li> Imobilizar Cy3 DNA em superfícies internas das câmaras de amostra. <ol><li> Preparar tampão de T-50 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de NaCl). Prepare a BSA-biotina em T-50 a uma concentração final de 1 mg / ml. Preparar tampão de T50-BSA por dissolução de BSA em T-50 a uma concentração final de 10 mg / ml. </li><li> Prepare a 0,5 mg / ml de neutravidina em tampão de BSA-T50. Prepare ADN biotinilado marcado com Cy3 (Cy3-ADN) para T50-BSA numa concentração final de 5-10 pM. </li><li> Pipetar 10 ul de BSA-biotina (1 mg / ml) para dentro da câmara da amostra. Espere por 5 min. </li><li&gt; Lava-se a câmara com 40 ul de BSA-T50. Pipeta neutravidina 10 ul (0,5 mg / ml) para dentro da câmara da amostra. Incubar durante 5 min. </li><li> Lava-se a câmara com 40 ul de BSA-T50. Pipetar 20 ul Cy3 ADN para dentro da câmara da amostra. Incubar durante 5 min e em seguida a câmara de lavagem com 80 ul de BSA-T50. </li></ol></li><li> Imagem Cy3-DNA moléculas individuais sob TIRFM. <ol><li> Preparar tampão de imagem (100 ul) por mistura de 1 mL Protocatecoate-3,4-dioxigenase (PCD, 5 mM), 4 uL de ácido protocatecuico (APC, 62,5 mM), 50 ul 6-hidroxi-2,5,7,8- ácido (Trolox, 2 mM em T-50) carboxílico tetramethylchromane-2-, e 45 ul de BSA-T50. </li><li> Pipeta em tampão de imagem de 30 mL e esperar por 8-10 min. </li><li> Montar a amostra para imagiologia numa TIRFM que é equipado com um laser verde (532 nm), um objectivo de imersão em óleo de 100X (NA 1,45), e uma câmara EMCCD. </li><li> Defina o tempo de exposição a 100 a 500 ms e ganho de EM de 25 a 100 Adquirir um filme da amostra para 1,000 quadros. </li></ol></li><li> Realizar análise de dados FIONA nas imagens gravadas de Cy3-DNA. <ol><li> Determine o tamanho efetivo de pixels (ou seja, fator de conversão de pixels para nanômetros), dividindo o tamanho do pixel físico (leia-se a partir da folha de especificações da câmera EMCCD) pela ampliação total (a ampliação da objetiva do microscópio multiplicado por quaisquer aumentos extras). </li><li> Determinar o fator de conversão de intensidades de pixel para fótons números dividindo sensibilidade CCD (ie, elétrons por contagem de A / D, lido a partir da folha de especificação da câmera CCD) pelo multiplicador de elétrons (EM) ganho utilizado na aquisição da imagem. </li><li> Compilar e executar FIONA.pro para análise FIONA. Utilize este programa IDL para importar a imagem adquirida, para introduzir o tamanho do pixel eficaz (a partir do Passo 2.5.1) e do fator de conversão de intensidade ao número de fótons (a partir do Passo 2.5.2), e escolher os pontos para análise de FIONA. NOTA: No final, o prograsaída m vontade os resultados de montagem, com funções 2D de Gauss, bem como o número total de fótons e precisão de localização. Um resultado típico é mostrado na seção de resultados representativos e Figuras 4c-4d. </li><li> Compilar e executar phcount.pro caracterizar contagem de fótons. Utilize este programa IDL para medir o número médio de fótons emitidos por um fluoróforo antes de fotodegradação, para importar a imagem adquirida e para introduzir o fator de conversão de intensidade ao número de fótons (a partir do Passo 2.5.2). NOTA: O programa irá então detectar pontos fluorescentes automaticamente (seleção manual é uma opção), calcular contagens de fótons em função do número de quadro e saída dos vestígios de contagens de fótons. <ol><li> Descarte traços ruins e especificar intervalos de quadros após a fotodegradação para correção de linha de base. No final, o programa irá exibir uma lista de números de fótons no total para todos os pontos não descartada. Em seguida, traçar a distribuição dos números de fótons e de ajustar a distrição com um decaimento exponencial para se obter o número médio de fotões. Um resultado típico é mostrado na seção de resultados representativos e Figuras 4e-4f. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. FIONA aplicada para quantificação de Motor (por exemplo, a miosina na actina) Dynamics em nanômetro Scale <ol><li> Polimerizar a actina (por exemplo, preparar a F-actina) um dia antes da experiência fIONA. <ol><li> Reconstituir G-actina (monómero) e biotina G-actina (monómero) para 10 mg / ml com tampão de actina geral. Mexa para certificar-se de ambos são completamente dissolvido, e mantenha-os no gelo. </li><li> Misturar 10 mL de G-actina (monómero) com 1,7 mL de biotina G-actina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 ul de tampão de polimerização de gelo frio de actina. </li><li> Deixar a mistura durante a noite a 4 ° C (F-actina formados) e, em seguida, adicionar ddH2O para um volume total de 1 ml. </li><li> Armazenar os filamentos de actina (actina F) a 4 ° C para posterior utilização em experiências. NOTA: Filamentos irá desintegrar e diminuir ao longo do tempo, mas pode ser utilizado para, pelo menos, duas semanas. </li></ol></li><li> Prepare a amostra para a imagiologia. <ol><li> Faça uma câmara de amostra (conforme descrito no protocolo 2.1 e 2.2). Pipeta de 20 ul de BSA biotinilado a 1 mg / ml em ddH 2 O. Incubar durante 10 min. Lavar com 30 mL DDH 2 O. NOTA: Isto bloqueia a superfície do vidro e estabelece biotina para a ligação dos filamentos de actina. Biotinilado poli-L-lisina - polietileno glicol (PEG-PLL) pode ter a mesma função. </li><li> Pipeta em 0,5 mg / ml neutravidina. Incuba-se durante 2 min e, em seguida, a câmara de lavagem com tampão 30 ul M5. </li><li> Pipeta no preparado de F-actina diluído 25 vezes em tampão de actina geral, a concentração final de ~ 0,004 mg / ml. Aguarde 10 minutos, lave a câmara com 30 ul de tampão. </li><li> Diluir miosina Va com etiquetas FLAG 30 vezes em tampão de M5 (20 mM de HEPES (pH 7,6), MgCl2 2 mM, KCl 25 mM, EGTA a 1 mM) a uma concentração final of 250 nM. Misture 1 ml miosina com 1 ml Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 PM, conjugado de anticorpos Anti-Flag e Qdot705 usando o Qdot705 Antibody Conjugação Kit de acordo com o manual de instruções do fabricante). Adicionar em 8 mL M5 para preencher a 10 ul. Pipeta cima e para baixo para misturar bem. Incubar durante 10 min em gelo. NOTA: Isso produz uma mistura de 1 motor a 4 pontos quânticos, em ~ 25 nM concentração miosina. </li></ol></li><li> Imagem da miosina andando em actina. <ol><li> Preparar tampão de imagem (100 ul) por mistura de 84 ul M5-BSA (tampão M5 com 1 mg / ml de BSA), 1 ul de ATP (50 uM em ddH2O), 2 ul de DTT (500 mM em ddH2O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul de PB (200 mM), 1 ul de PCD, 4 ul APC, 1 ul da miosina-Qdot depois diluído outra de 10 vezes a concentração de 2,5 nM de miosina, e 1 ul de BME. </li><li> Pipeta em tampão de imagem de 20 mL de amostra de câmara e incubar por 8-10 min. </li><li> Imagem da amostra em TIRF microscópio a 30 mseg exposição. Adquirir pelo menos 1.000 quadros. Ajuste o volume da miosina-Qdot no Passo 3.3.1, se necessário. </li></ol></li><li> Realizar análise de dados e encontrar o tamanho do passo de miosina andar. <ol><li> Abra o arquivo de vídeo no ImageJ 17 e recortar o vídeo em torno de um ponto em movimento. Cortar uma área grande o suficiente para que o local nunca fica dentro de 20 pixels da borda, e certificar-se de que não há outros pontos no vídeo. Certifique-se de que este local está se movendo em um caminho linear. </li><li> Acompanhe o local através do vídeo para gerar coordenadas X e Y ao longo do tempo, em pixels, através da aplicação de análise FIONA (Passo 2.5.3) para cada quadro do vídeo. </li><li> Converta pixels de nanômetros, como descrito na seção anterior. </li><li> Calcular deslocamento a partir da posição inicial, em função do tempo. </li><li> Executar o teste t sobre o deslocamento para obter os passos de miosina curta. NOTA: O programa previsto t-teste (step_t_test.zip) é codificado em IDL e consiste de 14 sub-rotinas na pasta. <ol><li> Abra todas as sub-rotinas em IDL e compilar tudo duas vezes. Em seguida, execute mtltyanalysis_ttest.pro e escolher um arquivo de texto contendo apenas os dados de distância em uma única coluna. Um arquivo de saída Excel serão gerados, contendo os dados brutos, o ajuste eo tamanho do passo. </li></ol></li><li> Exclua todos os valores nulos da coluna passo-size. Traça-se a distribuição dos tamanhos de passo utilizando Origem ou MATLAB. Coloque um Gaussian para o histograma. NOTA: Passo tamanhos de valores de zero precisa ser suprimida por um passo de zero significa que nenhum passo é feita a partir do quadro anterior. O encaixe apresenta um pico de cerca de 36 nm (como mostrado na Figura 5). </li></ol></li></ol> 4. Grosso Preparação de Amostras para FIONA <ol><li> Prepare quantum dots encapsulados em sol-gel. <ol><li> Misturar 4,5 ml de TMOS, 1 ml de ddH 2 O e 100 mL de HCl (120 mM). Sonicar a mistura em gelo durante 30 min no banho de ultra-sons specified na Lista de Materiais (frequência = 40 kHz, aquecedor = off). Misture a solução cada 10 minutos. </li><li> Diluir 1,5 mL Qdot605 em 1,5 ml de HEPES (50 mM, pH 7,2). Misturar a solução com 1,5 ml de TMOS da etapa anterior. </li><li> Despeje a mistura em um prato fundo de vidro. Selar o prato fundo de vidro com Parafilm e armazenar a 4 ° C durante 1 5 horas. </li><li> Adicionar 2 ml de 1% de BME em PBS para o prato de amostra e incubar à temperatura ambiente durante 30 min antes da imagiologia. </li></ol></li><li> Prepare amostra córnea manchada com pontos quânticos. NOTA: Coelho-olhos foram presentes de Dr. Marina Marjanovic. <ol><li> Separe a córnea dos olhos e corte-o em 3 mm por 3 mm peças. </li><li> Dilui-se 1 ml de estreptavidina-Qdot 605 em 1 ml de PBS. Incubar o tecido da córnea com uma solução a 4 nM Qdots C durante 1 hora. Lavar o tecido com PBS. </li><li> Dê uma lâmina de vidro limpa e uma lamela # 1.5. Coloque 4 camadas de fita dupla face na lâmina ao longo do lado mais longo, umnd colocar mais de 4 camadas de fita de dupla face paralela à fita anterior e deixa um canal de cerca de 1 cm de entre. Colocar o tecido a partir da etapa anterior, no meio do canal, e cobri-lo com uma lamela. </li><li> Pressione suavemente sobre os lados da lamela para fazer colar as fitas. Molhe o canal com 50 mL PBS antes de imagem. </li></ol></li><li> Quantum dots imagem em sol-gel e na córnea. <ol><li> Para imagens FIONA em amostras espessas, use uma objectiva 60X de imersão em água com distância de trabalho de 0,27 mm, ou um objetivo 60X de imersão em água com distância de trabalho de 0,28 mm. </li><li> Monte a amostra no microscópio. Ajustar a lente TIRF tal que atinge o modo de epi-fluorescência (isto é, o feixe de laser de sai da objectiva com um ângulo contra a lamela). Coloque uma lente de ampliação adicional (3.3X ou 4.0X). </li><li> Mova o plano focal da objectiva para a posição z desejado (por exemplo,&gt; 200 mm). Grava imagens de imóvelpontos quânticos na amostra. </li></ol></li><li> Realizar análise FIONA como descrito na seção 2.5 do presente protocolo. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Fiona é uma técnica para localizar a posição de um emissor fluorescente (fluoróforo orgânico ou quantum dot) com precisão nanométrica e resolução temporal de até 1 ms 4 a 8. Quando os fótons suficientes são coletados, esta técnica permite determinar a posição de um emissor fluorescente com muito mais precisão do que o limite de difração (~ 200 nm) e, portanto, esta técnica abre uma maneira de observar o que não tem sido visto com microscopia óptica convencional / tradicional 4 - 8. Desde sua invenção, Fiona tem sido aplicado com sucesso para observar caminhada de muitos motores moleculares, como myosins e kinesins. Mais recentemente, ele, juntamente com outros trabalhos 3,19, contribuiu para o processo de localização de certas técnicas emergentes super-resolução, tais como tempestades e PALM 13 e 16. O passo fundamental para alcançar FIONA reside no número de fótons coletados, que é afetada por vários fatores. Por exemplo, a configuração de TIRFM utilizada para experiências de FIONA deve ser bem alinhados de tal modo que uma boa PSF (isto é, não esticada, não-estigma, etc) é conseguida e uma razão sinal-ruído para-razoável é obtido. Além disso, um objetivo com um alto valor de NA devem ser usados ​​a fim de recolher o maior número possível de fótons. Para coletar mais fótons e, portanto, para aumentar a precisão de localização, diferentes métodos de catadores de oxigênio e reagentes têm sido exploradas para suprimir a fotodegradação e piscando 20 a 22. Dois métodos diferentes de remoção de oxigénio foram usados ​​no nosso laboratório. Um deles é &quot;gloxy&quot; solução (glicose oxidase e catalase) 20. O outro é o PCA / PCD descrito acima de 22. Os trabalhos anteriores imediatamente após a mistura, mas o pH da solução muda ao longo do tempo. Esta última continua a solução quimicamente inalterada, mas é necessário um tempo de incubação de 8 a 10 min. As mostradas aqui, é também possível alargar fIONA para amostras de espessura, utilizando uma objectiva de imersão em água 60X com NA = 1.2. Este objectivo tem uma distância de trabalho mais longo (0,27 mm) do que o usado anteriormente objetiva de imersão em óleo de 100X (0,17 mm). Para trabalhar em amostras de espessura, microscopia de epi-fluorescência precisa ser usado. Embora a vantagem de baixo fundo de TIRFM é sacrificado, precisão nanométrica localização ainda é alcançável durante a utilização brilhantes pontos quânticos. Esta extensão irá ser útil na geração de imagens de tecido grosso e aplicações médicas. A aplicação de fIONA é limitada em alguns aspectos. Em primeiro lugar, como a localização de precisão depende do número total de fotões recolhidos, a resolução temporal de fIONA é comprometido. Em segundo lugar, sozinho fIONA só pode ser aplicado a amostras escassamente rotulados. Em outras palavras, FIONA falhará se vários fluoróforos estão perto o suficiente como os PSFs sobrepõem. Além disso, o espalhamento de luz de emissão limita o application de FIONA em espessura do tecido-imaging.

Por volta de 1882, Ernst Abbe descobriu que a resolução de um microscópio de luz visível é ~ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (onde λ é o comprimento de onda e NA é a abertura numérica) 1,2. Por conseguinte, qualquer objecto mais pequeno do que esta dimensão que aparecem como uma mancha de difracção limitada, no microscópio óptico. No entanto, é possível determinar o centro do ponto, isto é, a localização do objecto, com uma precisão muito superior 3. Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy 4. A precisão da localização, σ μ (ou seja, o erro padrão da média), depende do número total de fotões recolhidos, <img alt="Equação 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , Onde N é o número de fotões, s é o desvio padrão da mancha fluorescente, um éo tamanho do pixel do detector de imagens, e b é o desvio padrão do fundo de 3,4. Para um fluoróforo que emite fótons ~ 10.000, FIONA pode alcançar ~ 1 nm precisão 4. FIONA pode ser utilizada para determinar com precisão a posição de um emissor estacionário, ou um movimento (assumindo que as imagens podem ser feita suficientemente rápida). FIONA pode ser aplicado, sequencialmente, para os quadros do filme e, assim, controlar o movimento da única molécula 4 a 8. Reagentes foto-proteção pode ser necessário garantir que a amostra não photodegrade. Além disso, o próprio objecto fluorescente pode ser de qualquer tamanho, menor ou maior do que a difracção LIMIT- por exemplo, pode consistir de um organelo (~ 1 mm) com muitas proteínas fluorescentes dispersas sobre a sua membrana. Usando FIONA ainda pode render um (nanômetros) média muito precisos de sua média de centro de massa. A grande melhoria na precisão de localização por Fiona permite resolver nanometer movimentos escala ao longo do tempo. Isso levou microscopia na escala de comprimento molecular 4 a 8. Desde a sua invenção, as variantes do fIONA têm sido desenvolvidos. Por exemplo, a imagem de campo claro com uma precisão de um nanômetro (bFIONA) 9, uma ligeira variante da FIONA, imagens e localiza objetos densos como melanossomas in vivo (objetos escuros contendo o pigmento melanina) com luz transmitida. Além disso, fIONA tem sido empregue para resolver vários corantes. Por exemplo, uma única molécula de alta resolução de imagem com fotodegradação (camarão) 10,11 ou uma única molécula de alta resolução co-localização (SHREC) 12 foram desenvolvidos para resolver dois corantes dentro de cerca de 10 nm. (Note-se que esta é a resolução, ou seja, a precisão com que se pode contar corantes idênticos separados.) Mais recentemente, a análise FIONA tem contribuído para o processo de localização de certos microscopia de super-resolução, como reco óptica estocásticamicroscopia nstruction (STORM) 13 e 15 e microscopia de localização ativados por foto (PALM) 16, em que fluorophores escuras temporárias está animado, e, em seguida, a fluorescência é localizada. Por várias vezes bastante interessante uma baixa densidade de corantes (menos do que um por difracção limitada local), e, em seguida, recolhendo a fluorescência, a análise de cada um deles por fIONA, pode-se construir um mapa de alta resolução. A resolução é, então, apenas limitado pelo número de fotões cada corante coloca fora, bem como coisas como manter a amostra estacionária (incluindo, por exemplo, a fase de microscópio), durante a aquisição. Neste trabalho, um resumo da técnica FIONA e descrever brevemente exemplos de pesquisas que têm sido realizadas utilizando FIONA é relatado. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Então, comorealizar uma experiência simples FIONA em localizar moléculas imobilizadas Cy3-DNA único meio de protocolos apropriados, é ilustrado. Depois disso, o uso de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot é apresentado. Miosina Va é uma proteína motora processive essencial que transporta carga celular enquanto translocação ao longo dos filamentos de actina. Aqui uma miosina Va construir truncada é utilizado para remover os domínios irrelevantes para o tamanho do passo, e com um marcador FLAG adicionado ao terminal C para permitir a facilidade de marcação com quantum dots funcionalizados com anticorpos anti-FLAG. Esta experiência é realizada em condições de baixa ATP para abrandar a miosina e permitir a utilização de longos tempos de exposição suficiente para obter uma boa contagem de fotões em cada quadro. Qualquer marcador fluorescente suficientemente brilhante pode ser substituído no seguinte protocolo. Por fim, é relatado recente esforço de estender a aplicação da FIONA a amostras de espessura. Como princípio de prova de, pontos quânticos foram embebidosem sol-gel e córneas do olho de coelho e, em seguida, analisados ​​e localizado com Fiona. Para imagem, uma objectiva de imersão em água 60X com NA = 1.2 foi usado porque este objectivo tem uma distância maior do que trabalhar utilizado anteriormente objetiva de imersão em óleo de 100X. Para compensar a perda na ampliação da objetiva, uma lente extra-ampliação (3.3X ou 4.0X) foi inserido no caminho de emissões. Além disso, a epi-fluorescência (não TIR), microscopia precisa de ser utilizado para acesso a regiões profundas nas amostras grossas. Mostra-se que os pontos quânticos embebidos no fundo do sol-gel e em córneas do olho de coelho (Z&gt; 200 mM) podem ser localizados com precisão 2-3 nm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1083">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:211px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:443px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:211px;">3M</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>~ 75 um thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:211px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:211px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Branson</td>
			<td style="width:211px;">2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:211px;">Chroma</td>
			<td style="width:211px;">49016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Actin polymerization buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biotin G-actin</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">G-actin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AKL95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">General actin buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser shutter (with driver)</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Optical Products Corp.&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SH-10-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">IDL</td>
			<td style="width:211px;">Exelis Visual Information Solutions</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Neutravidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">PI-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Coverslip</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:211px;">22X30-1.5</td>
			<td>0.16-0.19 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:211px;">Gold Seal Microslides&#160;</td>
			<td style="width:211px;">30103X1</td>
			<td>0.93-1.05 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:211px;">PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass bottom dish&#160;</td>
			<td style="width:211px;">In Vitro Scientific</td>
			<td style="width:211px;">D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cy3-DNA oligos</td>
			<td style="width:211px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>5&#39;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#39;Bio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent beads&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">T-7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot 605-streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q10101MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot605&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q21301MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot705</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22021MP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Matlab</td>
			<td style="width:211px;">MathWorks</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical table</td>
			<td style="width:211px;">Newport Corp</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>RS4000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:211px;">Plan Apo VC 60x WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">100X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">PlanApo 100X/1.45 Oil &#8734;/0.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">UPlanApo 60X/1.20W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">IX71/IX70/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Origin</td>
			<td style="width:211px;">OriginLab</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Anti-FLAG antibody</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">F7425-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ATP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BME&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA-biotin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CK</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">C3755</td>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1937</td>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">DTT</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">43815</td>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EGTA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">E3889</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">KCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MgCl2</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">NaCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">03930590</td>
			<td>Protocatechuic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCD</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P8279</td>
			<td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">TMOS</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">341436-25G</td>
			<td>Tetramethyl orthosilicate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Trolox</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">238813</td>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">1&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB1-E02, KM100</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">&#189;&#8221; diameter posts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TR4</td>
			<td>Quantity &#8805; 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">10x beam expander</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BE10M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB2-E02, KM200</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter f = 300 mm lens with mount</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LA1256-A, LMR2</td>
			<td>TIR lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent alignment target&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">VRC2SM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser safety goggles</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ND filter(s)</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical beam profiler</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP209-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Post-mounted iris diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">ID25</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">XYZ translation stage, &#189;&#8221; travel&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">T12XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser</td>
			<td style="width:211px;">World Star Technologies&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TECGL-30</td>
			<td>532 nm, 30 mW</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado e exemplos de pesquisas que têm sido realizados utilizando FIONA são descritas resumidamente. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Em seguida, como para realizar uma experiência simples fIONA em localizar moléculas imobilizadas com Cy3 de ADN individuais utilizando os protocolos apropriados, seguindo-se a utilização de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot, é ilustrado. Por fim, o esforço recente para estender a aplicação da FIONA para amostras espessas é relatado. Mostra-se que, utilizando uma objectiva de imersão em água e pontos quânticos embebido profundamente em sol-gel e córneas do olho de coelho (&gt;200 mm), a precisão da localização 2-3 nm pode ser atingida.

A configuração típica TIRFM tipo objetivo é mostrado na Figura 3. Primeiro, amostra Cy3-DNA imobilizado na superfície foi fotografada. Uma imagem típica é mostrada na Figura 4a. A imagem foi feita com tempo de exposição de 0,5 seg, com ganho EM = 50 e sensibilidade CCD = 12,13 para a câmera. A função de espalhamento-ponto (PSF) de uma única molécula de DNA com Cy3 é mostrado na Figura 4b (a partir do local indicado pela seta da Figura 4-A), onde a barra de cor mostra a escala de intensidade de pixel. As contagens de fótons reais podem ser calculadas multiplicando-se as intensidades de pixel por um fator de conversão, a sensibilidade α = CCD / ganho EM. Este local contém aproximadamente 14.000 fótons (após correção para o fundo). O PSF é então equipado com uma função bidimensional de Gauss, f (x, y) = z 0 + A · exp (- (x-x μ) 2 / (2s x 2) - (y - &amp; #181, y) 2 / (2s y 2)), como mostrado na Figura 4c (com resíduos de montagem mostrados na Figura 4d). A precisão da localização é então calculada pela <img alt="Equação 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51774/results_eqn.jpg" width="200" /> , Onde i = x ou y, s i é o desvio padrão da instalação, que N é o número total de fotões, um é o tamanho do pixel, e b é o desvio padrão do fundo. Neste exemplo específico, N = 14.528, a = 106,67 nm, s x = 115,5 nm, s y = 109,4 nm, b = 18,9, resultando em precisão de localização de σ x = 1,3 nm e σ y = 1,2 nm. A precisão de localização de um fluoróforo é aproximadamente proporcional a 1 / √n, ou seja, mais fótons são, a localização mais precisa é. No entanto, em aplicações reais de fIONA, duração de observação experimental é outra consideração. Portanto, umadeve, em geral, realizar a troca entre precisão a localização ea duração da observação e planejar com antecedência. Em tais situações, é geralmente útil para determinar o número de fotões no total um fluoróforo é capaz de emitir antes fotobranqueamento. Um traço típico de contagem de fotões versus estrutura é mostrado na Figura 4e. Um ajuste exponencial dá que o número médio de fotões ~ 1,4 x 10 6 (Figura 4f). O processo de análise de dados de medição de miosina tamanho do passo é mostrado na Figura 5. Em primeiro lugar, um ficheiro de vídeo com uma boa relação sinal-ruído de um único miosina enquanto anda ao longo de um filamento de actina é capturado. Figura 5a mostra três quadros de um vídeo feita a 100 mseg de exposição com objectiva de imersão em óleo de 100X. O PSF em movimento é, então, acompanhados por meio do arquivo de vídeo recortada usando um código personalizado escrito em IDL para extrair distância versus tempo de informação, que é colocado através de um teste tpor etapas. figura 5b shows com a distância em relação ao tempo (vermelho) e passo-finder saída (branco). Erros de localização em cada quadro obscurece a forma de escada de rastreio, de modo que é essencial para alcançar uma contagem de fotões, em cada armação que corresponde a um erro de localização inferior a metade do tamanho teórico passo que se deseja ver. Figura 5c mostra as etapas de várias traços combinados em um histograma que é Gaussian distribuída sobre o tamanho verdadeiro passo miosina. Um ajuste de Gauss para as barras do histograma produz uma medida de tamanho de etapa final de 35,8 ± 0,4 nm. Porque amostras sol-gel e córnea são transparentes, lasers de excitação podem penetrar profundamente as amostras sem ser espalhada demais. Além disso, a auto-fluorescência da amostra é minimizada. Quando marcado com baixa concentração de pontos quânticos, é possível coletar a fluorescência de Qdots profundo na amostra com alta relação sinal-ruído. Autilização de objectivo água dá-nos a distância de trabalho de 270 ou de 280 um, o que significa que é possível concentrar tanto quanto 280 uM longe da lamela. Isso nos permite realizar análises FIONA em pontos quânticos em amostras de espessura. Para os pontos quânticos em uma amostra de sol-gel, precisão de localização das 1-2 nm perto da lamela e 2-3 nm a 280 mM profundamente na amostra (Figuras 6a-6b) é alcançada. Para quantum dots em uma amostra biológica (parte de uma córnea de um olho de coelho, Figura 6e), precisão de localização de 1-2 nm perto da lamela e 2-3 nm a ~ 223 pM profundamente na amostra (Figuras 6c-6d) seja alcançado. Note-se que a precisão de localização é melhorada usando a lente de ampliação adicional, sem que uma precisão de localização de 6-7 nm foi obtido. Isto é consistente com estudos anteriores que mostraram que numéricos precisão de localização pode ser melhorado, alterando o tamanho efectivo de pixels a partir de 200 ~nm para ~ 50 nm, mesmo que o número total de fótons coletados pode ser menor devido às reflexões adicionais / refrações 18. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 configuração óptica. A configuração óptica da microscopia de fluorescência total de reflexão interna (TIRF) a.) É uma imagem quando a laser é em TIRF condição e b) é a forma do feixe de laser no teto quando a laser é na epi-iluminação. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 A localização de ADN imobilizada Cy3. Uma imagem) CCD (256 x 256 pixels) de Cy3-ADN. B) imagem CCD de uma única molécula de DNA com Cy3, indicados pelo yelbaixo seta em uma). c) Ajustar a função de ponto de difusão da molécula Cy3-DNA único com uma função gaussiana bidimensional. d) resíduos de montagem de c). e) contar Photon vs. número do quadro. f) Distribuição da número de fótons emitidos pela molécula Cy3 antes de fotodegradação. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51774/51774fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Myosin andar observado por Fiona. a) quadros de arquivo de dados de exemplo correspondente at = 0 segundos, 30 segundos e 60 segundos. A construção da miosina-Qdot está se movendo em um caminho reto e tem uma boa contagem de fótons (&gt; 5.000) em cada quadro. B) Aplicação de FIONA a cada yie quadrolds um traço distância em relação ao tempo que é representada em vermelho. Um algoritmo de busca passo baseado no t-teste é utilizada para, em seguida, extrair passos individuais, e a saída é sobreposta em branco. Tamanhos de passo são rotulados em branco em unidades de nanômetros. C) Passos de vários traços são combinados em um histograma. Os tamanhos dos passos medidos são Gaussian distribuídos cerca de 35,8 ± 0,4 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51774/51774fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 Análise em fIONA quantum dots profundas em amostras de espessura. Uma) imagem fluorescente de QD 605 em sol-gel para Z = 280 um, com 90X de ampliação. B) A função de contagem de pontos do QD marcado em a). σ x = 2.6 nm, σ y = 2,3 nm. Cada unidade no eixo X e Y representa 266,7 nm. C) imagem fluorescente de QD 655 no tecido da córnea de coelho no Z = 223 um, com ampliação de 360X. D) O PSF do QD marcado em c). σ x = 2,2 nm, σ y = 3,6 nm. Cada unidade no eixo X e Y representa 44,4 nm. E) Fotos do tecido da córnea montado em uma lamela. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51774/51774fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.6K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito. 

Vídeo: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis e Micromanipulação para imagens de fluorescência intravital da Microcirculação

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperação de fluorescência após p62 fotobranqueamento de amarelo fluorescente proteína marcados em Aggresome induzida por estruturas

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...