We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

Nota: A Figura 1 apresenta o esquema do protocolo. 1. Preparação das agulhas para injeção e Transplante Nota: As agulhas podem ser preparados em qualquer momento e armazenado. Mantê-los em uma placa de Petri, em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme para proteger da poeira. <ol><li> Para agulhas de injeção, puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,58 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta (ver lista de materiais). Prefere agulhas curtas e finas (parte afunilada de cerca de 5 mm), como eles são mais eficientes para perfurar o córion. Nota: As agulhas de injecção são de uso único. </li><li> Agulhas para Transplante de Células <ol><li> Puxar um capilar de vidro (diâmetro externo 1,0 mm de diâmetro interno 0,78 milímetros, sem filamentos (ver lista de materiais)) com um extrator micropipeta. </li><li> vocêcantar uma microforge (ver lista de materiais), corte a ponta da agulha no ponto em que o diâmetro interno é de 35 uM (um pouco mais do que o diâmetro das células a serem transplantadas). </li><li> Bevel a extremidade cortada do capilar com um microgrinder (ver lista de materiais) com um ângulo de 45 °. </li><li> Opcionalmente, puxar uma barbela sobre a extremidade da agulha utilizando um microforge. Para isso, tocar o filamento quente com a ponta do bisel e rapidamente o puxar para fora, criando uma farpa que pode ajudar a penetração do embrião. </li><li> Montar a agulha num suporte de agulha ligada a uma seringa. Usando a seringa, lavar o interior da agulha três vezes com ácido fluorídrico a 2% para eliminar os resíduos de vidro, e em seguida enxaguar três vezes com acetona. Cuidado: o ácido fluorídrico é tóxico, manipular sob o capô, com luvas. Nota: As agulhas de transplantação de células pode ser utilizado várias vezes. </li></ol></li></ol> 2. Preparação daLoiça para injeção e Transplante de Células <ol><li> Calor 50 ml de embrião médio 11, que contém 0,5 g de agarose, num forno de microondas durante 1 minuto na potência máxima para obter 1% de agarose em forma de embriões. Arrefece-se a gel de agarose a cerca de 60 ° C e verter 50 ml em uma placa de Petri de 90 mm. Coloque na superfície do gel de um molde especialmente projetado (ver lista de materiais), ou com linhas para o prato de injecção ou com poços para o prato transplante de células. <ol><li> Observe o flutuador mofo no agarose, se a agarose não é muito quente. Depois o gel de agarose é definido, remover o molde com uma pinça (Figura 2A - B). Nota: os pratos podem ser armazenadas a 4 ° C, até algumas semanas. Mantê-los em uma caixa molhada fechada, para evitar a secagem. </li></ol></li><li> Colocar a cápsula num incubador de 28 ° C 30 min antes da utilização. </li></ol> 3. Recolha de embriões e Injection <ol><li> Injecção Preparação de Solução Nota: domínio de ligação à actinada levedura proteína 140 (SPA-140) tal como Lifeact obrigado a mCherry se liga à actina (referido como ABP140-mCherry) é usado para visualizar actina polimerizada no interior da célula, a fim de analisar a actividade protuberante. Adicione outro composto a testar a função de um gene candidato (por exemplo, ARNm de construção negativo dominante ou constitutivamente activa, ou oligonucleótidos morfolino). Para avaliar as funções de SIN1 como descrito nos resultados (Figura 3), foram utilizados oligonucleótidos morfolino. Como um controlo, foi utilizado um morfolino idêntico ao morfolino SIN1 mas durante 5 nucleótidos distribuídos ao longo da sequência de modo a que este morfolino controlo não coincidir com o ARN alvo. <ol><li> SIN1 Thaw e morpholinos de controlo de 5 de incompatibilidade (2 solução de ações mm) e ABP140-mCherry mRNAs no gelo. Adicionar 375 ng de mRNAs (75 ng / mL final) e 0,75 mL de quer morfolino controle SIN1 ou 5-incompatibilidade (0,3 mM final) em tampão Danieau (NaCl 58 mM, 0,7 mMKCl, 0,4 mM de MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO3) 2, 5,0 mM de HEPES pH 7,6), para alcançar um volume total de 5 mL. </li></ol></li><li> de colheita de embriões Nota: para esta montagem experimental ambos os embriões de dadores e de acolhimento são transgênicos, expressando a GFP sob o controle do Goosecoid (GSC) promotor, a fim de visualizar a placa precordial prospectivo 11. <ol><li> Recolha Tg (GSC: GFP) ovos. Colocar cerca de 80 ovos em um prato de 90 milímetros de Petri cheio com o meio de embrião e incubar a 28 ° C. </li></ol></li><li> Injetar embriões doadores <ol><li> Sob um microscópio estereoscópico, esprema delicadamente embriões coletadas com pinça na linhas de um prato de injeção preenchido com meio embrião. Utilizando uma pinça, orientar os embriões com as células em direção ao topo. Colocar o prato de injecção na incubadora a 28 ° C até os embriões terem atingido o estádio de 4 células (1 h após a fertilização). </li><li> Coloque uma agulha de injecção com 2 ul desolução de injecção. Inserir a agulha em um suporte de agulha (ver lista de materiais) que é colocado em um micro-manipulador (ver lista de materiais) e conectado com politetrafluoretileno (PTFE) tubo (ver lista de materiais) para um Transjector ar (ver lista de materiais ). </li><li> Abra o capilar tocando delicadamente a ponta com uma pinça fina. Se necessário, cortar o capilar aberto por beliscar sua extremidade. </li><li> Entre uma das quatro células, com a agulha e injectar a solução no interior da célula, a fim de preencher 70% do volume da célula (2 nl). Injectar 30 embriões. Nota: Obtendo a agulha na célula pode ser difícil, porque a membrana plasmática é macio. Visando a junção entre a célula ea gema facilita a penetração da agulha. </li><li> Coloque os embriões em 28 ° C incubadora até que tenham atingido a fase esfera (4 horas após a fertilização). </li></ol></li></ol> 4. Preparação dos embriões para o celular Transplantatíon <ol><li> Prepare 20 ml de meio de embrião com 200 mL de penicilina / estreptomicina (ver lista de materiais) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation dos embriões na fase esfera (4 h após a fertilização) Nota: embriões dechorionated são muito frágeis e vai explodir em caso de contacto com o ar ou plástico. Eles precisam, portanto, ser colocado em pratos revestidos com agarose, e transferido por meio de pipetas de Pasteur de vidro polido ao fogo. <ol><li> Usando uma pipeta de Pasteur de plástico, transferir embriões de acolhimento recolhidos no passo 3.2 e embriões de dadores injetados no passo 3.3 em duas 35 milímetros placas de Petri revestidas com agarose a 1% em meio embrião e preenchidos com Pen / Strep EM. Manter embriões de acolhimento e embriões de dadores em dois pratos separados. </li><li> extrair manualmente os embriões de seus córions com uma pinça fina (ver lista de materiais). </li><li> Coloque os embriões no C incubadora de 28 ° até que tenham atingido a fase escudo (6 horas após a fertilização). </li></ol></li></ol>Transplante 5. celular <ol><li> Organizar os embriões para o transplante de células. <ol><li> Sob um microscópio estereoscópico fluorescente, selecione embriões doadores expressar ABP140-mCherry (vermelho) dentro do escudo (verde). </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões nos poços do prato de transplante de células preenchido com Pen / Strep EM. Coloque os embriões de acolhimento em uma linha e os embriões de dadores na linha limítrofe. </li><li> Usando um cílio, orientar cuidadosamente os embriões com o escudo para cima. Nota: a posição da blindagem pode ser avaliado por expressão da GFP ou anatomicamente. </li></ol></li><li> Transplante System Set-up. Nota: O sistema de transplante é composto por um suporte de agulha (ver lista de materiais) ligado com um tubo de PTFE (veja lista de Materiais) e um conector do tubo (ver lista de materiais) a uma seringa Hamilton equipado com um micro-drive (ver lista de Materiais). O suporte de agulhaestá montado sobre um micromanipulador de 3 vias (ver lista de Materiais). <ol><li> Utilizando um suporte de agulha ligada a uma seringa, a agulha para lavar o transplante de células com 70% de etanol. Seca-se por sucção de ar para dentro da agulha. Não secar por sopro, pois isso pode resultar em pó ficar preso na parte afilada da agulha. </li><li> Inserir a agulha no suporte de agulha ligada à seringa Hamilton, com o bisel para cima. </li></ol></li><li> Shield-to-escudo Transplante de Células <ol><li> Digite o escudo de um embrião doador com a agulha transplante e elaborar cerca de 10-20 células marcadas com ABP140-mCherry. Cuidadosamente evitar o desenho gema. </li><li> Transplante as células para a blindagem do embrião hospedeiro. Repita até que todos os embriões de acolhimento foram transplantados. </li><li> Remova todos os embriões danificados com uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Colocar os embriões transplantados na incubadora a 28 ° C e deixá-los recuperar durante cerca de 30 min. </li><li> Usando uma agulhatitular ligada a uma seringa, lave a agulha transplante de células com água e colocá-lo de volta em uma placa de Petri em uma faixa de massa de modelar. Selar o prato com parafilme. </li></ol></li></ol> 6. (Opcional) Transplante de Células Individual Nota: No embrião, as células aderem umas às outras, de modo que é difícil tirar apenas uma célula em que a agulha transplante. Nós desenvolvemos um protocolo modificado para transplantar facilmente células progenitoras placa precordial individuais. A ideia é a dissociar-se as células antes de transplante. Como as células progenitoras placa precordial isolados tendem a perder a sua identidade, nós geneticamente impor-lhes uma identidade placa precordial prospectivo, pela ativação da via de sinalização Nodal, na ausência do fator de transcrição Sox32. Verificamos que estas células induzidas se comportam como células progenitoras placa precordial endógenos 8. Abaixo estão os passos específicos para realizar transplantes de células individuais. dissocia celularção é conseguida pela colocação em embriões Ringer isenta de cálcio 11, dissecando um explante e mecanicamente agitando-o. <ol><li> No passo 2.1, preparar o prato transplante com 1% de agarose em Ringer livre de cálcio em vez de Embryo Médio. </li><li> No passo 3.1, em adição a ABP140-mCherry ARN e morfolino SIN1, adicionar 3 ng de ARN que codificam para a forma activa do receptor nodal taram-A (0,6 ng / mL final) e 1,25 ul de morfolino contra sox32 (solução mãe a 2 mM, 0,5 mM, consequentemente, final). </li><li> Após o passo 4, a transferência de três embriões doadores selecionados no prato para o transplante de células preenchido com Pen / Strep Ringer livre de cálcio usando uma pipeta de Pasteur polida-fogo. Com uma pinça fina, dissecar um explante contendo as células injetadas (ABP140-mCherry células marcadas). Eliminar rapidamente o resto dos embriões. </li><li> Com um cílio, agitar suavemente o explante até que as células se dissociam. </li><li> Elaborar uma única célula isolada na agulha transplantee transplantá-la para a blindagem de um embrião hospedeiro. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, transferir os embriões numa placa revestida de agarose-preenchido com Pen / Strep EM. Colocar os embriões na incubadora a 28 ° C durante 30 min. </li></ol> 7. Embrião de montagem <ol><li> imagiologia Câmara <ol><li> Método 1: usar uma câmara de imagem composta de uma lâmina de plástico (75 * 25 * 0.5 mm) perfurado com 4 furos (5,5 mm de diâmetro), com bordas de 3 mm em um lado (Figura 2C - D). Cole uma lamela de vidro na parte de trás, com cianoacrilato cola (super cola). Nota: No final do experimento, coloque a câmara na água por uma noite para remover a lamela e se livrar de resíduos de cola com papel de areia. </li><li> Método 2: Usar 35 mm Mattek vidro pratos inferiores (ver lista de materiais) com um buraco de 10 mm. </li></ol></li><li> montagem embrião <ol><li> Encher um frasco de vidro com 1 ml de agarose quente 0,2% em meio embrião.Mantê-la a 42 ° C num bloco de calor. </li><li> Sob o microscópio estereoscópico fluorescente, selecionar um embrião nas quais o Red células transplantadas são parte da placa precordial prospectivo marcados em verde (ou seja, células transplantadas vermelhas estão dentro da placa precordial prospectivo verde, e já começaram a migrar para o pólo animal). </li><li> Transferir um embrião seleccionado para a solução de agarose com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo. Descartar o excesso de meio de embrião a partir da pipeta. Desenhar o embrião na pipeta com agarose, e transferência do embrião na câmara de imagem, depositar uma gota de agarose. Antes de agarose é definido, orientar o embrião com um cílio. Colocar a placa pré-cordal potencial para cima para imagiologia com um microscópio vertical, ou na parte inferior de vidro para imagiologia com um microscópio invertido. Aguardar até que a agarose é definida (cerca de 1 min, dependendo da temperatura ambiente) antes de montar outra embrião no poço seguinte da câmara. Nota: um cha de imagemmber contendo 4 poços permite a montagem de até 4 embriões. </li><li> Quando a agarose é definido, encher a câmara com Pen / Strep EM para evitar a secagem. </li></ol></li></ol> 8. Imagens ao vivo <ol><li> Use um 40X de imersão em água da lente de longo alcance. Use filtros adequados para a imagem GFP e mCherry (para GFP: excitação BP 470/40, divisor de feixe FT 510, e emissão BP 540/50; para mCherry: excitação BP 578/21, divisor de feixe FT 596 e LP emissão de 641 / 75). Ajuste a duração da exposição, a fim de otimizar a dinâmica de imagem. </li><li> Para imagem todas as células na placa, adquirir z pilhas, começando alguns microns uma por cima da placa pré-cordal prospectivo (em ectoderme) e terminando uma alguns microns abaixo da placa pré-cordal prospectivo (na gema). Usar um passo de Z-2 uM. Para otimizar a velocidade de aquisição, mudar as cores entre Z-stacks, em vez de entre os quadros. Nota: Isto pode levar a pequenas diferenças entre as imagens vermelhas e verdes, mas não é um problema, já que nenhum co preciso-localization entre os sinais de verde e vermelho é necessária. Para reduzir ainda mais o tempo de imagem e exposição à luz, verde pode ser adquirida apenas uma vez a cada 5 pontos no tempo, o que é suficiente para identificar as células progenitoras placa precordial. </li><li> Usando essas configurações, a imagem até 4 embriões dentro do intervalo de tempo de dois minutos que é necessário analisar a frequência protrusão e orientação. Para a análise do ciclo de vida protrusão, reduzir o intervalo de tempo para 30 segundos para obter maior resolução de tempo. Imagem de 60% a 80% epiboly epiboly. </li></ol> Análise 9. Dynamics celular <ol><li> Carregar imagens 4D em ImageJ Nota: Dependendo do software utilizado para a aquisição, as imagens são armazenadas em formatos diferentes (um arquivo por imagem, um arquivo por z-stack, um arquivo para todo o experimento). Alguns Plugins ImageJ estão disponíveis on-line para abrir pilhas 4D. Nossos dados são armazenados como um arquivo por z-stack. Uma vez que o conjunto de dados pode ser grande, pode ser conveniente para abrir apenas uma parte dele (cerca de time pontos, ou uma sub do z-stack, ou 8-bit convertido imagens ...). Nós usamos uma custom-made ImageJ plugin para fazê-lo, o que nós ficaríamos felizes para distribuir a pedido. </li><li> Análise da Orientação e Freqüência de saliências celulares <ol><li> Use imagens GFP para determinar a direção principal da migração placa precordial prospectivo. Leve isso como uma referência para as medições angulares saliências celulares. Girar a pilha, de modo que este sentido de referência é paralelo a um dos lados da imagem. </li><li> Siga uma célula. Ferramenta Selecionar ângulo. Para cada quadro e cada protuberância, utilizar a ferramenta ângulo para medir o ângulo entre a saliência e a direcção de referência (Figura 3A). Use o comando Analisar / Medir para armazenar o valor (ou pressione M no teclado). Salvar os resultados como um arquivo txt. Repita com a próxima célula. </li><li> Importe os dados para distribuição ângulo trama R e como histogramas. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov (ks.test em R) para comparar diferentes condições. Nota: A ferramenta ângulo fornece valores compreendidos entre 0 ° e 180 °, permitindo a utilização de testes estatísticos clássicos e os testes não circulares. </li><li> Com este conjunto de dados, calcular a frequência de emissão, conforme o número de protuberâncias por célula por minuto. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições. </li></ol></li><li> Análise do celular Saliências Lifetime <ol><li> Para cada célula e cada saliência, medida duração saliência (número de quadros durante o qual a saliência está presente X intervalo de tempo entre os quadros). </li><li> Importe os dados para R. Use Student t-test (t.test em R) para comparar diferentes condições. Nota: Outras características de migração pode ser interessante analisar, a fim de caracterizar a migração celular. Estes incluem faixas de células, para velocidade, direção e medidas de persistência, ou morfologia celular. Alguns aplicativos de software comerciais estão disponíveis para medir estas características, mas um grande número de apli software open-sourcecátions e plugins ImageJ também estão disponíveis, como, por exemplo, adaptar-se a analisar morfodinâmica 12, diper olhar para trajetórias celulares e persistência direcional 13, CellTrack para rastrear limites da célula durante a migração 14. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo apresenta uma forma fácil para estudar o papel de um gene candidato na migração de células in vivo, através da combinação da criação de embriões quiméricos que utilizam o transplante de células com imagens ao vivo. Criação de embriões mosaico O estudo da dinâmica de uma célula requer a visualização do seu contorno para analisar extensões citoplasmáticas. Isto pode ser conseguido por marcação das células isoladas numa outra forma não marcado - ou diferentemente rotulados - ambiente, oferecendo, assim, um bom contraste visual. Uma maneira fácil de rotular estocasticamente uma porção de células em que o embrião é para injectar o DNA plasmídico na fase 1-célula 16. Os plasmídeos injectados formar agregados que são de forma aleatória e desigual segregadas em células durante a divisão celular. Isto conduz à expressão do plasmídeo em um subconjunto aleatório de células e, assim, representa um método muito rápido, fácil e não-invasiva para a geração de MOembriões SAIC. No entanto, as células que expressam o plasmídeo injetados tendem a formar aglomerados, e a probabilidade de encontrar embriões que contêm poucas células que expressam isoladas na placa precordial prospectivo é bastante baixa. Além disso, a utilização de ADN plasmídico oferece um controlo muito limitada do nível do construto de expressão injectado. A criação de embriões quiméricos por transplante de células, embora tecnicamente mais difícil do que a injecção de ADN plasmídico, oferece um número de vantagens: o controle do número de células transplantadas, o controlo do nível de uma das construções (injecção de ARN) expressão, e por último, mas não menos importante , transplantes de células para permitir testar os efeitos de células-autónoma, através da criação de embriões de mosaico em que as células transplantadas conter perda ou ganho de construções de função. Por outro lado, transplantes também pode ser utilizado para avaliar o papel não autónomo do meio ambiente através do transplante de células do tipo selvagem em embriões que foram modificados. Isto pode ser de particular interesse para o testepor exemplo, a função de componentes da matriz extracelular que são particularmente relevantes para a análise de migração celular. Um protocolo detalhado para o transplante de células já foi descrito 10. Em comparação com este protocolo, que gostaria de discutir duas principais diferenças em nosso procedimento. A primeira diferença é relacionada com a fase de injecção embriões de dadores. De acordo com a nossa experiência, os embriões injectados no estádio de uma célula com-RNAs de uma proteína fluorescente que não expressam a proteína fluorescente homogeneamente em todas as células, devido a uma difusão incompleta dos ARN na célula. A injecção de embriões de dadores no estádio de 4 células em uma das quatro células permite a obtenção de um clone de células homogénea, o que é de particular interesse quando o ARN da proteína fluorescente são co-injectados com outros RNAs que não são rastreáveis. A segunda diferença principal é a utilização de ar em vez de óleo na transplantatseringa de iões. A principal desvantagem de um sistema cheio de ar é a inércia resultante da elasticidade do ar. Oil, pelo contrário, sendo incompressível, oferece bom controle de sucção e pressão. No entanto, com uma pequena formação, e através da manutenção da interface entre o ar e meio de embriões na parte fina, afilada da agulha, o controlo de aspiração e de pressão com um sistema cheio de ar é suficiente para o transplante de células na fase de escudo. Para fases posteriores, as células tornam-se menores e mais coesa, a sucção requer uma alta pressão que tem de ser muito precisamente controlado, que não pode ser alcançado com uma configuração cheia de ar. Utilizando ar em vez de óleo facilita a configuração, como preencher o sistema com óleo sem qualquer bolha de ar é complicado. Além disso, evita-se o enchimento da agulha com o transplante de óleo. Isso permite que as agulhas transplante para ser reutilizado e, portanto, de ser cuidadosamente preparada. Nós sentimos que uma agulha, sem arestas cortantes e do diâmetro correto é a chave para succetransplante ssful. Esta etapa transplante é claramente uma das etapas críticas do protocolo, que requer prática antes de ser facilmente realizado. Também propuseram um procedimento específico para o transplante de células individuais, que consiste em células antes do transplante de dissociação, a fim de chamar uma célula única em que a agulha transplante. Isto implica que a dissociação de células transientes não irá modificar a sua identidade e / ou comportamento. Para as células progenitoras placa precordial, nós geneticamente impor identidade da célula, e verificou cuidadosamente que estas células se comportam como os não-dissociada. No entanto, não podemos excluir formalmente que a dissociação e / ou indução genética induzir modificações despercebidos nas células. Transplante de células individuais sem dissociar-los é viável. As células devem ser elaborados cuidadosamente na agulha transplante. No entanto, pelo menos em nossas mãos, a taxa de sucesso é muito baixa, porque mais de uma célula entra no needle, ou porque as tesouras celulares quando elaborados e morre na agulha ou uma vez transplantados. Epifluorescência contra imagem confocal rápido O uso do transplante de células para criar embriões mosaico permite a marcação de células isoladas, separadas de outras células marcadas. Neste contexto, uma boa imagem da morfologia celular e dinâmica pode ser obtida com microscopia de epifluorescência padrão, tal como proposto no protocolo. Isto tem a vantagem óbvia de ser um equipamento relativamente generalizada e uma alternativa de baixo custo para sistemas de imagem confocal mais caros. Para localizações subcelulares precisos, imagem confocal pode ser usado para melhorar a resolução, em especial a resolução axial. Para ainda obter resolução temporal suficiente, imagens rápidas confocal deve ser usado. Pela nossa experiência, microscópios-disco giratório oferecer um bom compromisso entre a resolução, velocidade e foto-toxicidade. Digitalização rápida mic confocalroscopes (como microscópios de varredura de ressonância) são boas opções também, mas menos frequentes e mais caro. rotulagem citoesqueleto Bom rotulagem dos filamentos de actina e a sua dinâmica é crucial para estudar os mecanismos de migração de células à base de actina. Embora marcadores fluorescentes ligadas à membrana são mais eficientes para analisar os contornos celulares, rotulagem actina permite uma muito melhor visualização das protuberâncias celulares. Em particular, se três células marcadas entrar em contacto, é muito difícil de identificar uma extensão citoplasmática localizado entre duas células vizinhas como o contorno da extensão e a membrana das células vizinhas podem se misturam. Rotular filamentos de actina permite a detecção inequívoca de saliências celulares à base de actina, em que nos concentramos. Se a morfologia das células foi quantificada a ser, uma marcação da membrana seria preferível. Outra opção é usar tanto de rotulagem, quer utilizando imagiologia de 3 cores (uma para o Li transgénicoNE, uma para a actina e para uma membrana), ou por GFP rotulagem da membrana. Na linha transgénica, a GFP é citoplasmática, e as células positivas para GFP-Goosecoid pode assim ser identificado, mesmo que a membrana é GFP marcado. Nos últimos anos, um número de sondas têm sido utilizados para marcar a actina em amostras vivas. Os primeiros eram fusões diretos monómeros de actina. Estes apresentaram dois grandes inconvenientes. Em primeiro lugar, eles todos rotulados actina e actina polimerizada não especificamente. Em segundo lugar, eles eram frequentemente tóxicos. As sondas atualmente em uso são domínios de ligação de actina filamentosos fundidos a repórteres fluorescentes. Neste protocolo, usamos ABP140 (domínio de ligação de actina da levedura de ligação proteína actina 140) 17, que atualmente é o marcador mais utilizado para a actina filamentosa, e as etiquetas toda a actina filamentosa. Utrophin 18 (domínio de homologia calponina) também rótulos actina filamentosa, mas parece rotular filamentos única estáveis. Esta diferença foi usado para identificar os filamentos de actina dinâmica, como aqueles marcados por ABP140 e não utrophin 19. Recentemente, foi relatado que na mosca ABP140 e utrophin poderia ter efeitos tóxicos, em particular durante longos expressão 20. Mesmo que não tenha notado quaisquer defeitos de migração em células ABP140-rotulados, não podemos excluir que a expressão ABP140 pode perturbar a dinâmica de actina endógenos. Uma terceira sonda para a actina filamentosa Recentemente, foi relatado 21. F-tractin (domínio de ligação da actina a partir de trifosfato de inositol de rato 3-cinase) foi descrito como um repórter fiel de actina filamentosa, que não apresentam efeitos tóxicos 20,22. Para nosso conhecimento, a utilização de F-tractin não foi reportado no peixe-zebra ainda. Além de actina, muitos outros constituintes celulares podiam ser rotulados de modo a melhorar a nossa compreensão da migração celular. Isto inclui outros componentes do citoesqueleto tais como miosina, microtúbulos, centrossomas, bem como kNreguladores próprios de migração celular (formas activadas da pequena GTPases Rho, Rac e Cdc42, sondas fluorescentes para PIP3 ...) ou de proteínas envolvidas na adesão celular (integrinas, as caderinas ...). No geral, este protocolo reúne uma série de ferramentas e técnicas descritas anteriormente para propor um sistema rápido e fácil de testar o envolvimento de um gene candidato no controle da migração de células in vivo. Usamos a migração placa precordial prospectivo, pois é um modelo interessante de migração coletiva dirigida, e por causa da rotulagem linhagem transgênica disponível lo. No entanto, um protocolo semelhante poderia ser adaptado para analisar outros eventos de migração que ocorrem durante o desenvolvimento.

Em organismos multicelulares, a migração celular é essencial tanto para o desenvolvimento do embrião em que assegura a organização de células em tecidos e órgãos, e para a vida adulta, em que participa a homeostase do tecido (cicatrização de ferimentos) e imunidade. Em adição a estas funções fisiológicas, a migração de células, também está envolvido em diversas situações patológicas, incluindo, em particular, a metástase do cancro. A migração celular foi analisado in vitro ao longo de décadas, proporcionando uma compreensão global dos mecanismos moleculares que garantem movimentos celulares em superfícies planas. In vivo no entanto, as células são confrontados por um ambiente mais complexo. É claramente apareceu nos últimos anos que a migração dentro de um organismo pode ser influenciada por estímulos externos, tais como a matriz extracelular, as células ou quimioquinas segregadas orientadores migração vizinha, e que os mecanismos de condução migração de células pode variar do que foi descrito &lt;em&gt; in vitro 1,2. Os mecanismos que garantam na migração celular vivo têm recebido menos atenção até agora, principalmente por causa do aumento da dificuldade técnica, em comparação com estudos in vitro. In vivo análise da migração celular em particular requer acesso óptico direto para as células migram, técnicas para marcar células únicas em a fim de ver a sua dinâmica e morfologia, assim como o ganho ou a perda de função de abordagens para testar o papel dos genes candidatos. Até agora, apenas alguns sistemas modelo que albergam estas características têm sido utilizadas para dissecar na migração celular in vivo 3. Recentemente, utilizou a migração da placa pré-cordal prospectivo em embriões de peixe-zebra iniciais como um novo sistema modelo conveniente para avaliar a função de genes candidatos para controlar a migração celular in vivo em 4,5. placa pré-cordal prospectivo (também conhecido como mesendoderm anterior) é um grupo de formação de células no início de Gastrulation no lado dorsal do embrião. Durante a gastrulação este grupo migra em conjunto em direcção ao polo animal do embrião 6-8, para formar a placa pré-cordal, um espessamento mesendodermal, anterior ao da notocorda e da placa neural subjacente. A parte anterior da placa precordial dará origem à glândula incubação, enquanto a sua parte posterior provavelmente contribui para a cabeça mesoderme 9. Graças ao desenvolvimento externo e clareza óptica do embrião de peixe, a migração de células pode ser facilmente e directamente observado nesta estrutura. O transplante celular é uma técnica muito potente que permite a criação rápida e fácil de embriões de mosaico 10. Expressando marcadores fluorescentes do citoesqueleto em células transplantadas resultados na marcação de células isoladas, a morfologia e a dinâmica das quais pode ser facilmente observado. Combinando isso a perda ou ganho de função se aproxima permite a análise de funções das células-autônoma de uma latagene didata. O protocolo apresentado descreve como avaliamos a função do componente SIN1 TORC2 no controle da migração celular e actina dinâmica in vivo 5. Mas, como mencionado nos resultados discutidos e ainda mais, que poderia ser utilizado para analisar a implicação potencial de qualquer gene candidato para controlar a migração celular in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300085</td>
			<td style="width:167px;">standard thickness</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">300085</td>
			<td>thin-walled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10&#160;000&#160;units penicillin and 10&#160;mg streptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:71px;">Dumont Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>5F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Air transjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro-forge</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator (for injection)</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Micromanipulator (for cell transplantation)</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica Micromanipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hammilton Syringe</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:71px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Transplantation mold</td>
			<td style="width:71px;">Adapative Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">PT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Needle holder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">HI-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tube connector</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

A técnica apresentada foi utilizado para analisar o papel da SIN1, um dos principais componentes do Tor complexa 2 (TORC2), no controle da migração celular vivo. O uso do transplante de células permite marcação de células isoladas e análise dos efeitos em células-autônoma. Filme S1 mostra a migração de células progenitoras da placa pré-cordal transplantados. rotulagem actina com ABP140 permite a visualização fácil de saliências citoplasmáticos ricas em actina. Nós medimos a sua frequência e orientação. As células do tipo selvagem produzir frequentemente grandes citoplasmáticos saliências orientadas na direcção do polo animal, isto é, a direcção da migração (Figura 3B). A perda da função de SIN1 conduz a uma redução drástica do número de saliências, e a randomização dos restantes, demonstrando a importância de controlar a formação de SIN1 em saliência ricos em actina. Curiosamente, este fenótipo pode ser resgatado por eXpression de uma forma constitutivamente activa de 15 Rac1, sugerindo fortemente que controla TORC2 dinâmica de actina e formação de protrusão célula através Rac1 (Figura 3B). A técnica apresentada também foi utilizado para caracterizar o papel da Arpin, um inibidor recentemente identificado do complexo Arp2 / 3, 4 sobre a dinâmica de células. A perda da função Arpin leva a um aumento da frequência saliência (taxa média de células albergando uma saliência num dado momento). Isto pode ser devido quer à formação de saliência mais frequente ou a um aumento na estabilidade da saliência. Medição de tempo de vida saliência revelou que, na ausência de Arpin, protrusão persistência temporal é duplicado (Figura 3C). Isto é consistente com o papel de Arpin como um inibidor Arp2 / 3, o que facilitaria a saliência de retracção, e sugere que afecta Arpin frequência saliência modulando estabilidade saliência, em vez deiniciação protrusão. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig1.jpg" /> Figura 1:. Delinear o processo de Tg (GSC: GFP) embriões são injetados na fase de 4 células (1 h após a fertilização). Depois de 5 h a 28 ° C, mostrando embriões ABP140-mCherry células positivas dentro da blindagem (GFP +) são seleccionados como embriões de dadores. células de blindagem são elaboradas dentro da agulha transplante e transferido para o escudo de um embrião hospedeiro. Após 0,5 horas de recuperação, embriões de acolhimento são montados e fotografada com um microscópio de epifluorescência (objetiva de 40X). HPF:. horas após a fertilização <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig2.jpg" /> Figura 2: Transplantatisobre Dish and Imaging Câmara. (A) prato Transplantação com poços individuais. (B) O molde para o prato transplante de células. Câmara de imagem (C) feito em casa. (D) Desenho esquemático da câmara de imagem feito em casa. Barra de escala = 1 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53792/53792fig3.jpg" /> Figura 3:. Os resultados de celular Dynamics Analysis (A) Esquema de medição do ângulo de protrusão. (B) Análise da orientação protrusão célula e frequência. Na ausência de SIN1 (Mo-SIN1), células emitem menos saliências e as saliências restantes são orientados aleatoriamente. Este fenótipo pode ser resgatado por expressão de uma forma constitutivamente activa da GTPase Rac1 (Mo-Sin1 + CA-Rac1). Modificado de Dumortier e David de 2015 5. (C) Análise de vida protrusão. Na ausência de Arpin (Mo-Arpin), a frequência é aumentada saliência. Isto é devido a um aumento no tempo de vida saliência. Reintrodução de um RNA Arpin insensível à morfolino restaura este fenótipo hiper protrusive. Modificado de Dang et ai., 2013 4. A barra de escala = 10 uM. A: Anterior; P: Posterior, L: esquerda, R: Sim. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/53792fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/53792/53792movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53792/Movie_1.mp4">Filme 1: controles SIN1 formação de saliências celulares, por meio de Rac1 (clique com o botão direito para baixar).</a> Células progenitoras placa precordial transplantado, injetados comABP140-mCherrry ARN e um controlo morfolino, ou o morfolino SIN1, ou o morfolino e SIN1 ARN para a forma constitutiva da Rac1. frequência protrusão e orientação foram medidos nas imagens.

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.6K visualizações.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

Vídeo: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...