Conjugação: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora

Fonte: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Departamento de Microbiologia, Escola de Medicina da Universidade de Boston, Laboratórios Nacionais de Doenças de Infecções Emergentes, Boston, MA

Descoberta pela primeira vez por Lederberg e Tatum em 1946, a conjugação é uma forma de transferência genética horizontal entre bactérias que depende do contato físico direto entre duas células bacterianas (1). Ao contrário de outras formas de transferência genética, como transformação ou transdução, a conjugação é um processo natural em que o DNA é secretado de uma célula doadora para uma célula receptora de forma unidirecional. Essa direcionalidade e a capacidade desse processo de aumentar a diversidade genética das bactérias deram à conjugação a reputação como uma forma de "acasalamento" bacteriano, que acredita-se ter contribuído muito para o recente aumento de bactérias resistentes a antibióticos (2, 3). Ao utilizar pressões seletivas, por exemplo, o uso de antibióticos, a conjugação tem sido manipulada para uso em ambiente de laboratório, tornando-se uma ferramenta poderosa para a transferência horizontal de genes entre bactérias e, em alguns casos, de bactérias para leveduras, plantas e células animais (4). Além das aplicações em laboratório, a transferência de genes bacterium-eucayote por conjugação é uma avenida emocionante de transferência de DNA com uma infinidade de possíveis aplicações biotécnicas e implicações naturais (5).

Acredita-se que a conjugação funcione por um "mecanismo de duas etapas" (6). Primeiro, antes que qualquer DNA possa ser transferido, a célula doadora deve fazer contato direto entre células com o receptor. Esse processo tem sido caracterizado melhor em bactérias gram-negativas, sendo a mais estudada Escherichia coli. O contato celular-célula é estabelecido pela presença de uma complexa rede de filamentos extracelulares no doador conhecido como pilus sexual, um elemento conjugado codificado pelo gene transferível conhecido como fator F (fertilidade) (7, 8). Além de estabelecer contato entre doador e receptor, diversas proteínas são transportadas através do pilus sexual para o citoplasma receptor, formando um conduíte tipo IV (T4SS) entre as duas células, estrutura necessária para a segunda etapa de conjugação, transferência de DNA (6). Combinando essa função do pilus sexual com a replicação do DNA, a célula doadora é capaz de transferir DNA na forma de um elemento transposável, como um plasmídeo ou transposon, para o receptor por um modelo de "atirar e bombear" (6). Neste caso, o "tiro" é o transporte da proteína piloto, com DNA vinculado, pelo T4SS para a célula receptora, e o "bombeamento" é o transporte ativo de DNA para o receptor, um processo dependente do T4SS e catalisado por proteínas de acoplamento (6). O maquinário utilizado neste processo é composto por uma origem da sequência de transferência(oriT),que deve ser fornecida pelo DNA em genes cis e trans, que codificam um complexo de relaxase, formação de par de mate e proteína de acoplamento tipo IV, e pode estar presente em cis ou trans (9). Esta relaxase corta o local de nic dentro da sequência oriT e se prende covalentemente ao final da cadeia transferida para produzir o relaxosome, um complexo de relaxamento de DNA de uma única cadeia com outras proteínas auxiliares (9). Uma vez formado, o relaxosome conecta-se ao complexo de formação de par de acasalamento, através da proteína de acoplamento tipo IV, que permite a transferência do complexo ssDNA-relaxase para células receptoras pelo T4SS (10). Uma vez no citoplasma do receptor, o DNA pode se integrar ao genoma receptor ou existir separadamente na forma de um plasmídeo, qualquer um dos quais permite a expressão de seus genes.

Neste experimento, a cepa de doadores de conjugação amplamente utilizada E. coli WM3064 foi usada para transferir a codificação genética para resistência à ampicilina à cepa receptora E. coli J53. Enquanto ambas as cepas das bactérias gram-negativas eram resistentes à tetraciclina, apenas a cepa doadora WM3064 tinha o gene para resistência à ampicilina, codificada no vetor pWD2-oriT, e era auxotrófica ao ácido diaminopimelic (DAP) (11-13). Este experimento consistiu em duas etapas principais, a preparação de cepas de doadores e receptores, seguidas pela transferência do gene de resistência à ampicilina de doador para receptor por conjugação (Figura 1).

Figura 1: Esquema de conjugação. Este esquema mostra a transferência bem sucedida de um plasmídeo, apenas um exemplo de um elemento de DNA transposável, de uma célula doadora para uma célula receptora usando conjugação. Após o contato com a célula receptora pela célula doadora através do pilus sexual, o plasmid replica-se pela replicação do círculo de rolamento, move-se através do complexo multiproteína que une as duas células, e forma um novo plasmídeo de comprimento completo na célula receptora.

Ao incubar uma mistura de células doadoras e receptoras, em seguida, sucessivamente emplacando essas células na presença de tetraciclina e DAP, isso permitiu a transferência bem sucedida do gene de resistência à ampicilina. Sucessivamente, as células de revestimento cultivadas a partir dessa mistura na presença de tetraciclina e ampicilina, removeram todas as células doadoras devido à falta de DAP e de quaisquer células receptoras que possam não ter adquirido o gene de resistência à ampicilina, produzindo bactérias estritamente receptoras da cepa J53 que adquiriram resistência à ampicilina (Figura 2). Uma vez realizada, a transferência bem sucedida do gene de resistência à ampicilina foi confirmada pelo PCR. Desde que a conjugação foi bem sucedida, a cepa J53 de E. coli continha pWD2-oriT e era resistente à ampicilina, e a codificação genética para essa resistência é detectável pelo PCR. No entanto, se não tivesse havido nenhuma detecção do gene de resistência à ampicilina e a ampicilina ainda funcionaria como um antibiótico eficaz contra a cepa J53.

Figura 2: Esquema de protocolo. Este esquema mostra uma visão geral do protocolo apresentado.

Figura 3A: A confirmação da conjugação bem sucedida pela PCR. A) Os estoques congeladores das amostras de controle conjugadas e negativas foram listrados em placas de ágar e uma colônia foi selecionada (vermelha) para isolamento de DNA.

1. Configuração

1. Autoclave aproximadamente 1L de médium Luria-Bertani (LB). Este LB estéril será usado para fazer aproximadamente 5 mL de LB contendo ácido diaminopimelic de 0,3 mM (DAP).
2. Recolher as seguintes placas: placas de ágar LB com 1X Tet e 0,3 mM DAP, placas de ágar LB apenas com 1X Tet e placas de ágar LB apenas com 1X Amp/Tet.
3. Certifique-se de que um pouco de glicerol e uma caixa de pontas de pipeta de plástico pré-esterilizadas estejam próximas.
4. Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, esterilize o espaço de trabalho com 70% de etanol. Use sempre os equipamentos de proteção pessoal necessários, incluindo um jaleco e luvas.
5. Uma vez terminado, esterilize todas as superfícies e luvas com 70% de etanol e lave as mãos.

2. Preparação da cepa de doadores e receptores

1. Prepare 5 mL culturas bacterianas das cepas de doadores e receptores e cultivá-las durante a noite a 37 °C com aeração e agitação a 220 rpm. A cepa de doadores deve ser cultivada em LB com 0,3 mM DAP.
2. Gire 1 mL de ambas as culturas (~3000 rpm por 5 minutos) e lave as células com PBS.
3. Resuspend as células em 500 μL de salina tamponada de fosfato (PBS).

3. Conjugação

1. Combine 50 μL de células receptoras com 50 μL de células doadoras em um tubo de microcentrifuus e misture por pipetação.
2. Incubar a mistura celular por 1 hora a 37 °C. Isso aumentará a eficiência da conjugação antes e durante a próxima etapa de chapeamento.
3. Pipet 100 μL da mistura celular em uma placa de ágar com 1X Tet e 0,3 mM DAP. Não se espalhe na placa.
4. Pipet 100 μL de cultura celular receptora em uma placa de ágar com 1X Tet e 0,3 mM DAP. Não se espalhe na placa.
5. Incubar ambas as placas durante a noite a 37 °C.
6. Raspe a mistura de células de conjugação e a cultura celular receptora com um raspador de células estéril. Transfira as células para o tubo de microcentrifusagem estéril e resuspenque as células em 1 mL de PBS.
7. Vórtice das células e gire-as suavemente para baixo (~3000 rpm por 5 minutos).
8. Resuspense as células em 1 mL de PBS.
9. Aplaque a mistura da célula de reação de conjugação em uma placa de ágar LB apenas com 1X Amp/Tet. Nesta placa, espera-se que apenas as bactérias receptoras que obtiveram sucesso do gene de resistência amp através da conjugação cresçam.
10. Coloque as células receptoras em uma placa de ágar LB apenas com 1X Tet. Nesta placa, espera-se que apenas bactérias receptoras não julgadas, que não possuem o gene de resistência amp, cresçam.
11. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
12. Escolha colônias únicas de ambas as placas e use-as para cultivar culturas durante a noite em 5 mL de mídia (37 °C com aeração a 220 rpm).

4. Isolamento do DNA

1. Isole o DNA das culturas previamente preparadas usando 4,5 mL do volume total de cultura por miniprep de DNA.
2. Para isso, elute o DNA usando 35 μL de água sem nuclease.
3. O DNA puro gerará uma razão de absorção (A_260/280) de aproximadamente 1,8.
4. Use os 0,5 mL restantes de cada cultura para preparar os estoques de glicerol, fazendo uma mistura de cultura bacteriana 1:1 e 100% glicerol.
5. Armazene os estoques do congelador a -80 °C.

5. Confirmação da Conjugação de Transferência Plasmid pela PCR

1. Prepare duas misturas mestres pcr, cada uma com um conjunto diferente de primers para frente e para trás, uma visando um segmento de 500 pares de base dentro do gene de resistência à ampicilina e a outra visando um segmento dentro de um gene de limpeza.
   1. Os primers genéticos de limpeza foram projetados para amplificar um segmento de DNA dentro da codificação genética bacteriana para o DNA gyrase B (14).
   2. Os seguintes volumes de reagente foram utilizados para preparar 90 μL de cada mix mestre:
      7,5 μL de 10 μM primer para frente
      7,5 μL de primer reverso de 10 μM
      75 μL de 2X PCR Master Mix
2. Prepare as seguintes seis reações de PCR usando 15 μL master mix, 10 ng de DNA de modelo e água sem nuclease até um volume final de 25 μL.
   DNA de reação conjugal e primers de ampicilina
   DNA de reação conjugal e primers de limpeza
   Dna de controle negativo e primers de ampicillina
   DNA de controle negativo e primers de limpeza
   Sem primers de DNA e ampicillina
   Sem dna e primers de limpeza
3. Transfira essas reações para uma máquina PCR com o bloco pré-aquecido para 98 C e comece a termociclamento sob as seguintes condições:
   98 °C por 30 segundos
   25-35 ciclos de 98 °C para 5-10 segundos, 45-72 °C por 10 a 30 segundos, e 72 °C para 15-30 segundos por kb
   72 °C por 5-10 minutos
   Mantenha a 4 °C
4. Carregue todas as seis reações do PCR em um gel de 1% de agarose e execute a ~150V por cerca de 20 minutos.
5. Visualize o produto do PC usando um iluminador UV.

Se a conjugação for bem sucedida, um produto PCR de banda de 500 pares base será observado no poço em que a reação pcr 1 foi carregada (Bem #2 na Figura 3B), enquanto nenhuma banda será observada no poço em que a reação pcr 3 foi carregada (Bem #4 na Figura 3B). A presença desta banda confirma a transferência bem sucedida do gene de resistência à ampicilina, conferindo assim resistência à ampicilina à cepa J53 de E. coli.

Figura 3B: A confirmação da conjugação bem sucedida por PCR. B) A análise da PCR foi feita utilizando-se DNA isolado da colônia selecionada. O conteúdo de cada poço é o seguinte: 1) escada de DNA, 2) DNA de conjugação e primers de ampicilina, 3) DNA de conjugação e primers de limpeza, 4) Dna de controle negativo e primers de ampicillina, 5) DNA de controle negativo e primers de limpeza, 6) Sem primers de DNA e ampicilina, e 7) Sem primers de DNA e controle negativos. A presença de um produto PCR de banda base de ~ 500 pares base da reação PCR 1 (bem 2), e a falta deste produto da reação PCR 3 (bem 4), confirma a conjugação bem sucedida.

A conjugação é um processo natural de transferência genética horizontal que depende do contato direto celular-célula de uma célula doadora e de uma célula receptora. Esse processo é compartilhado entre todos os tipos de bactérias e tem sido fundamental na evolução bacteriana, principalmente a resistência a antibióticos. Em laboratório, a conjugação pode ser usada como um método eficaz de transferência genética que é muito menos disruptivo quando comparado a outras técnicas. Fora do laboratório, a capacidade de transferir DNA de bactérias para eucariotes via conjugação oferece uma nova e excitante via de terapia genética e entender as implicações dessas transferências genéticas que ocorrem naturalmente, por exemplo, a relação entre infecção bacteriana e câncer, é uma área de pesquisa rapidamente emergente.

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