結合:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に移す方法

ソース: アレクサンダー S. ゴールド¹, トーニャ M. コルピッツ^1
1ボストン大学医学部微生物学科、国立新興感染症研究所、ボストン、マサチューセッツ州

1946年にレダーバーグとテイタムによって最初に発見された共役は、2つの細菌細胞間の直接的な物理的接触に依存する細菌間の水平遺伝子伝達の一形態である(1)。形質転換やトランスダクションなどの他の形態の遺伝子導入とは異なり、結合はDNAがドナー細胞からレシピエント細胞に一方向的に分泌される自然発生プロセスです。この方向性と細菌の遺伝的多様性を高めるこのプロセスの能力は、抗生物質耐性の最近の上昇に大きく貢献していると考えられている細菌「交配」の一形態としての評判を共役に与えました。バクテリア(2、3)。選択的圧力(例えば抗生物質の使用)を用いることで、実験室での使用のためにコンジュゲーションが操作され、細菌間の水平遺伝子移動、場合によっては細菌から酵母、植物、動物への強力なツールとなっています。セル (4)。実験室での応用とは別に、結合による細菌・ユーカリオテ遺伝子の伝達は、多くの可能なバイオテクノロジーアプリケーションと自然に起こる影響を持つDNA伝達のエキサイティングな手段です(5)。

コンジュゲーションは「2段階機構」(6)によって働くと考えられている。まず、DNAを移送する前に、ドナー細胞はレシピエントと直接細胞間接触を行わなければならない。このプロセスは、グラム陰性細菌で最もよく特徴付けられており、その中で最も研究されているのは大腸菌である。細胞間接触は、性ピラスとして知られているドナー上の細胞外フィラメントの複雑なネットワークの存在によって確立され、F(不妊)因子(7,8)として知られる転写可能な遺伝子によってコードされる共役元素である。ドナーとレシピエントとの接触を確立することに加えて、いくつかのタンパク質は、レシピエント細胞質に性ピラスを介して輸送され、2つの細胞間のIV分泌系(T4SS)導管を形成し、第2工程に必要な構造である。DNA伝達(6)。この性ピルスの機能とDNAの転がり円複製を組み合わせることにより、ドナー細胞は、プラスミドまたはトランスポゾンなどのトランスポーザブル要素の形でDNAを「シュートアンドポンプ」モデル(6)によってレシピエントに移すことができる。この場合、「シューティング」は、パイロットタンパク質の輸送であり、連結DNAを用いて、T4SSによってレシピエント細胞に送られ、「ポンピング」はレシピエントへのDNAの活性輸送であり、T4SSに依存し、結合タンパク質によって触媒されるプロセスである(6)。このプロセスで使用される機械は、リラクサーゼ、合体対形成複合体、およびIV型結合タンパク質をコードするシスおよびトランス遺伝子のDNAによって提供されなければならない転移配列(oriT)の起源から構成され、シスまたはトランス(9)に存在することができます。このリラクサーゼは、oriT配列内のnic部位を切断し、転移した鎖の5'末端に生有して、他の補助タンパク質との一本鎖DNAリラクサーゼ複合体であるリラクソームを産生する(9)。いったん形成されると、リラクソームは交配対形成複合体に接続し、IV型結合タンパク質を介して、SsDNA-relaxase複合体をT4SS(10)によってレシピエント細胞に移植することを可能にする。レシピエントの細胞質に入ると、DNAはレシピエントゲノムに統合することも、プラスミドの形で別々に存在することも、その遺伝子の発現を可能にする。

この実験では、広く使用されている共役ドナー株大腸菌WM3064を、レシピエント株大腸菌J53に対するアンピシリン耐性をコードする遺伝子コードを伝達するために用いられた。グラム陰性菌の両方の株はテトラサイクリンに耐性であったが、ドナー株WM3064のみがアンピシリン耐性の遺伝子を持ち、pWD2-oriTシャトルベクターでコードされ、ジアミノピメル酸(DAP)に対して下方栄養性であった(11-13)。この実験は、ドナーおよびレシピエント株の調製、続いてコンジュゲーションによるドナーからレシピエントへのアンピシリン耐性遺伝子の移植の2つの主要なステップからなる(図1)。

図 1: コンジュゲーション回路図。この回路図は、プラスミドの正常な転移を示し、転移可能なDNA要素の一例に過ぎず、共役を用いてドナー細胞からレシピエント細胞へ送り込む。性ピラスを介してドナー細胞によってレシピエント細胞と接触すると、プラスミドは転がり円複製によって複製し、2つの細胞を結合する多タンパク質複合体を通って移動し、レシピエント細胞に新しい全長プラスミドを形成する。

ドナー細胞とレシピエント細胞の混合物をインキュベートすることにより、テトラサイクリンおよびDAPの存在下でこれらの細胞を連続的にめっきし、これはアンピシリン耐性遺伝子の正常な転写を可能にした。テトラサイクリンとアンピシリンの存在下でこの混合物から増殖した細胞を連続的にめっきし、DAPの欠如とアンピシリン耐性遺伝子を得ていない可能性のある任意のレシピエント細胞の欠如のためにすべてのドナー細胞を除去し、厳密にレシピエントJ53株を得たアンピシリン耐性を獲得した細菌(図2)。一旦行われると、アンピシリン耐性遺伝子の正常な転写がPCRによって確認された。大腸菌のJ53株はpWD2-oriTを含み、アンピシリンに対して耐性があり、この耐性をコードする遺伝子はPCRによって検出可能であった。しかし、もし失敗した場合、アンピシリン耐性遺伝子の検出はなく、アンピシリンはJ53株に対する有効な抗生物質として依然として機能するだろう。

図 2: プロトコルの回路図。この回路図は、提示されたプロトコルの概要を示しています。

図3A:PCRによるコンジュゲーションの成功の確認A)共役および陰性対照試料の冷凍庫ストックを寒天プレート上にストリークアウトし、DNA分離のためにコロニー(赤色)を選択した。

1. セットアップ

1. ルリア・ベルタニ培地(LB)のオートクレーブ約1L。この無菌LBは、0.3mMジアミノピメル酸(DAP)を含むLBの約5mLを作るために使用されます。
2. 次のプレートを収集する:1Xテトと0.3 mM DAPのLB寒天プレート、1XテトのみのLB寒天プレート、および1Xアンプ/テットのみのLB寒天プレート。
3. いくつかのグリセロールと殺菌前のプラスチックピペットの先端の箱が手元に近いであることを確認してください。
4. 微生物を含む任意の作業を開始する前に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌します。ラボコートや手袋など、必要な個人用保護具は必ず着用してください。
5. 終了後、70%のエタノールですべての表面と手袋を殺菌し、手を洗います。

2. ドナーおよびレシピエント株の調製

1. ドナーおよびレシピエント株の5mL細菌培養物を調作し、通気と220rpmで振盪して37°Cで一晩成長させる。ドナー株は0.3 mM DAPでLBで成長する必要があります。
2. 両方の培養物の1 mL(5分間〜3000 rpm)をスピンダウンし、PBSで細胞を洗浄します。
3. リン酸緩衝生理食生の500 μLで細胞を再中断する(PBS)。

3. コンジュゲーション

1. 50 μLのレシピエント細胞と50μLのドナー細胞をマイクロ遠心管に組み合わせ、ピペッティングで混合します。
2. 細胞混合物を37°Cで1時間インキュベートします。これは次のめっきステップの前および間に共役の効率を高める。
3. セル混合物のピペット100 μLを1X Tetおよび0.3 mM DAPの寒天板上に置いた。皿の上に広がらないで下さい。
4. 1X Tetおよび0.3 mM DAPを用いて寒天プレート上にレシピエント細胞培養のピペット100 μL。皿の上に広がらないで下さい。
5. 両方のプレートを37°Cで一晩インキュベートします。
6. 生殖細胞スクレーパーで共役細胞混合物とレシピエント細胞培養を掻き取る。無菌マイクロ遠心チューブに細胞を移し、PBSの1 mLで細胞を再懸濁する。
7. 細胞を渦にし、穏やかにスピンダウンします(~3000 rpm 5分間)。
8. PBSの1 mLで細胞を再中断する。
9. 1Xアンプ/テットのみでLB寒天プレート上のコンジュゲーション反応細胞混合物をプレートします。このプレートでは、結合によってアンプ耐性遺伝子を獲得したレシピエント菌のみが増殖することが期待されます。
10. レシピエントセルをLB寒天プレートに1X Tetのみでプレートします。このプレートでは、アンプ耐性遺伝子を持たない未結合レシピエント細菌のみが増殖することが期待されます。
11. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
12. 両方のプレートから単一のコロニーを選択し、メディアの5 mL(220 rpmで通気で37°C)で一晩培養を成長させるためにそれらを使用します。

4. DNA分離

1. DNAミニプレップにより総培養量の4.5mLを用いて、以前に調製した培養物からDNAを分離する。
2. これを行うには、ヌクレアーゼフリー水の35 μLを使用してDNAを溶出します。
3. 純DNAは約1.8の吸光度比(A_260/280)を生成します。
4. 各培養の残りの0.5 mLを使用して、細菌培養と100%グリセロールの1:1混合物を作ることによってグリセロールストックを調製します。
5. 冷凍庫の在庫は-80 °C.

5. PCRによるプラスミド転写の確認

1. 2つのPCRマスターミックスを準備し、それぞれが異なる前方プライマーとリバースプライマーのセットを持ち、1つはアンピシリン耐性遺伝子内の500塩基セグメントを標的とし、もう1つはハウスキーピング遺伝子内のセグメントを標的とする。
   1. ハウスキーピング遺伝子プライマーは、DNAジャイラゼB(14)をコードする細菌遺伝子内のDNAのセグメントを増幅するように設計された。
   2. 以下の試薬量を使用して、各マスターミックスの90 μLを調作しました。
      10 μM 前方プライマーの 7.5 μL
      10 μM 逆プライマーの 7.5 μL
      2X PCRマスターミックスの75 μL
2. 15 μLマスターミックス、10ngのテンプレートDNA、および25 μLの最終容積までのヌクレアーゼフリー水を使用して、以下の6つのPCR反応を調製します。
   共役反応DNAとアンピシリンプライマー
   コンジュゲーション反応DNAとハウスキーピングプライマー
   陰性制御DNAとアンピシリンプライマー
   陰性制御DNAとハウスキーピングプライマー
   DNAとアンピシリンプライマーなし
   DNAとハウスキーピングプライマーなし
3. ブロックを98°Cに予熱したPCRマシンにこれらの反応を転送し、次の条件下でサーモサイクリングを開始します。
   98 °C 30 秒
   98 °C の 25 ~ 35 サイクル(5~10 秒)、10 ~ 30 秒の 45 ~72 °C、および 1 kb あたり 15 ~ 30 秒の 72 °C
   72 °C 5-10分
   4 °Cでホールド
4. 6つのPCR反応をすべて1%のアガロースゲルにロードし、約20分間〜150Vで実行します。
5. UVイルミレータを使用してPC製品を視覚化します。

コンジュゲーションが成功した場合、PCR反応1がロードされたウェルで500塩基対サイズのバンドPCR産物が観察され(図3Bではウェル#2)、PCR反応3がロードされたウェルにはバンドは観察されない(図3B#4)。このバンドの存在は、アンピシリン耐性遺伝子の正常な転移を確認し、それによって大腸菌のJ53株に対するアンピシリン耐性を付与する。

図3B:PCRによるコンジュゲーションの成功の確認B)選択コロニーから単離したDNAを用いてPCR分析を行った。各ウェルの内容は以下の通りです:1)DNAはしご、2)コンジュゲーションDNAとアンピシリンプライマー、3)コンジュゲーションDNAとハウスキーピングプライマー、4)陰性制御DNAとアンピシリンプライマー、5)陰性制御DNAとハウスキーピングプライマー、6)DNAなしアンピシリンプライマー、および7)DNAおよび陰性制御プライマーなし。PCR反応1(ウェル2)から約500塩基対バンドPCR産物の存在、およびPCR反応3(ウェル4)からの本産物の欠如は、正常な結合を確認する。

結合は、ドナー細胞とレシピエント細胞の直接細胞間接触に依存する水平遺伝子導入の自然発生過程である。このプロセスは、細菌のすべての種類の間で共有され、細菌の進化、最も顕著な抗生物質耐性に役立ってきました。研究室では、他の技術と比較してはるかに破壊的ではない遺伝子導入の効果的な方法として活用できます。研究室の外では、共役を介して細菌から真核生物にDNAを伝達する能力は、遺伝子治療のエキサイティングな新しい道を提供し、これらの自然に存在する遺伝子移植の意味を理解する、例えば、間の関係細菌感染症と癌は、研究の急速に新興分野です。

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