Ensaio para Morte Celular: Ensaio de Liberação de Cromo para Avaliar a Capacidade Citotóxica

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Uma das principais funções das células do sistema imunológico é remover células-alvo que foram infectadas com vírus ou passaram por transformação em células tumorais. Ensaios in vitro para medir a capacidade citotóxica das células imunes têm sido um grampo em laboratórios por muitos anos. Esses ensaios têm sido usados para determinar a capacidade de células T, células NK ou qualquer outra célula imune para matar células-alvo de forma específica de antígeno ou -inespecífica. Ligantes de morte (por exemplo, ligante fas ou TRAIL), citocinas (por exemplo, IFNg ou TNF), ou grânulos citotóxicos (ou seja, perforina/granzyme B) expressos por células effectoras são algumas maneiras pelas quais a morte celular alvo pode ser induzida. Com a explosão na pesquisa de imunoterapia tumoral nos últimos anos, há um crescente interesse em encontrar agentes para aumentar a atividade citotóxica das células imunes para melhorar os resultados dos pacientes. Por outro lado, algumas doenças são marcadas pela atividade excessivamente exuberante da atividade citotóxica das células imunes, resultando em esforços para identificar agentes para temperar essas respostas. Assim, ter um ensaio no qual o usuário pode facilmente integrar qualquer número de células efeitos, células-alvo e/ou modificadores de resposta no design experimental pode servir como um meio valioso de avaliar rapidamente a capacidade citotóxica das células effectoras e/ou a capacidade de resposta da célula alvo.

Esses ensaios in vitro envolvem a mistura de diferentes populações celulares, bem como o uso de um número relativamente baixo de células-alvo e efeitos. Assim, uma necessidade do ensaio é rotular as células-alvo de uma maneira que possa ser facilmente detectada e quantitada, permitindo ao usuário determinar então a "por cento de lise específica" mediada pelas células effectoras. A radioatividade - especialmente, o cromo 51 (⁵¹Cr) na forma de Na₂⁵¹CrO₄- é uma maneira barata de rotular rapidamente e sem especificação proteínas celulares dentro das células-alvo (1). Os tempos de rotulagem curta e ensaio total reduzem o potencial de mudanças significativas no número e/ou fenótipo das células-alvo, o que poderia influenciar o resultado do ensaio. Após a perda da integridade da membrana das células-alvo como resultado da atividade citotóxica das células effectoras, as proteínas celulares rotuladas por Cr ^{de 51}Cr dentro das células-alvo são liberadas na cultura sobrenante, tornando-se disponíveis para quantitação. Como em qualquer ensaio que examine a função das células imunes in vitro,há uma série de considerações importantes para considerar melhorar o desempenho do experimento. Uma das características mais críticas é usar células de efeito saudável (para atividade citotóxica máxima) e alvo (para resposta máxima e morte espontânea mínima/ liberação de⁵¹Cr). É necessário contato com o efeito e a célula alvo (levando ao uso comum de placas de fundo redondo de 96 poços para incentivar o contato celular) (2). Por fim, a análise dos dados depende da inclusão de populações celulares alvo de controle positivo e negativo.

O protocolo a seguir delineará as etapas para a realização de um ensaio de liberação padrão ^{de 51}Cr para medir a capacidade citotóxica de uma população de células efeitos, embora uma versão nãoradioativa usando europium tenha sido recentemente desenvolvida. ⁵¹ Cr é um poderoso emissor de radiação γ. Consequentemente, o uso deste ensaio requer treinamento adequado de segurança de radiação, espaço de laboratório dedicado, um contador gama e descarte de amostras radioativas.

A sequência geral de eventos neste ensaio são: 1) preparar ⁵¹alvos rotulados por Cr; 2) preparar células de efeitos e adicionar à placa enquanto as células-alvo estiverem rotulando; 3) adicionar alvos rotulados à placa; 4) placa incubadora; 5) supernastas de colheita; e 6) analisar dados após a execução de amostras no balcão. As amostras são comumente preparadas em triplicado, e então mediadas para explicar quaisquer diferenças sutis de pipetação.

O EPI adequado é importante para este ensaio. Especificamente, o usuário deve usar um jaleco e luvas. Os óculos de segurança podem ser necessários com base no laboratório ou instituição. Deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do ⁵¹Cr durante todas as etapas. Por fim, deve haver espaço de laboratório dedicado e equipamentos reservados para o uso de ⁵¹Cr, incluindo toda a sinalização adequada para indicar onde as amostras com ⁵¹Cr estão sendo mantidas e um contador Geiger equipado com sonda gama para examinar o espaço para possível contaminação.

Neste exercício de laboratório, determinaremos a capacidade das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs), (CpG estimuladas vs. não estimuladas) para matar células de melanoma, usando a linha celular de melanoma humano WM793 como modelo e o ensaio de liberação de cromo.

Visão geral do procedimento

O típico ensaio de liberação de ⁵¹CR para medir a morte celular envolve as seguintes etapas:

1. Primeiro, as células-alvo são rotuladas com Na₂[⁵¹Cr]O₄. Isso as distingue das células efeitos no ensaio.
2. Enquanto as células-alvo estão rotulando, as células effectoras são coletadas e, usando a técnica de diluição serial, uma titulação decrescente das células de efeito é gerada em uma placa de ensaio fundo redondo de 96 bem.
3. No final da rotulagem da célula alvo, as células são primeiro lavadas e, em seguida, um número fixo de células são adicionadas à placa de ensaio que já contém uma série de diluições de células de efeito.
4. Em seguida, a mistura celular com efeito-alvo é incubada por um período de tempo definido para permitir interação celular suficiente com as células-alvo, para mediar a lise celular.
5. Finalmente, os supernacantes da cultura são colhidos e coletados em tubos. A quantidade ^{de 51}Cr é quantitatada usando um contador gama.
6. Ao final, os dados são coletados e utilizados para calcular a "porcentagem específica de lise celular" das células-alvo.

1. Rotulagem de células-alvo com ⁵¹Cr

1. Para começar, prepare as células-alvo,(aqui- linha celular de melanoma humano WM793), em uma única suspensão celular.
2. Para fazer isso, primeiro remova a mídia do frasco de cultura tecidual.
3. Em seguida, lave as células com 5 mL de 1X PBS.
4. Trypsinize as células adicionando 1 mL de trippsina na placa por ~2 min.
5. Bata suavemente o frasco para soltar as células da superfície do frasco.
6. Adicione 5 mL de mídia RPMI ao frasco e enconha a mídia para cima e para baixo para desprender as células.
7. Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm. Decantar o supernatante.
8. Adicione 10 mL de mídia à pelota e cano suavemente a mídia para cima e para baixo para colocar as células em suspensão.
9. Determine a concentração celular usando um hemócito.
10. Transfira 1x10⁶ células para um novo tubo cônico de 15 mL.
11. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm e decantar o supernante.
12. Brevemente o vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular no pequeno volume de médio deixado para trás.
13. Adicione 100 μCi de ⁵¹Cr diretamente à suspensão da célula alvo WM793.
    Nota: Deve haver um espaço de laboratório dedicado para a radioatividade particular. Além disso, deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do ⁵¹Cr durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com ⁵¹Cr estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário, para levantamento do espaço para possível contaminação.
14. Adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que o tubo agora é radioativo.
15. Coloque o tubo em uma incubadora de 37°C com um escudo de chumbo e incubar por 1h. Flick o tubo a cada 15-20 minutos para aumentar a absorção celular alvo do cromo.
16. Após o período de incubação, lave as células-alvo com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
17. Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min. Decanta radioativa FBS lavar em recipiente de resíduos apropriado.
18. Resuspenda a pelota e lave uma segunda vez com fbs. Verifique a pelota para obter radioatividade incorporada usando um contador Geiger.
19. Resuspenda a pelota em 10 mL meio completo, alcançando uma concentração celular de 10⁵ células/mL.
    Nota: A etapa de contagem de células após a rotulagem ^{de 51}Cr é omitida aqui em grande parte pelas razões de segurança. Pode-se supor que a concentração celular WM793 é a mesma anterior à rotulagem de ⁵¹Cr.

2. Preparando células do efeito

1. Uma variedade de células efeitos podem ser usadas, como células T humanas ou de camundongos e células NK. Neste exemplo, foram utilizados PBMCs, isolados do sangue inteiro por centrifugação gradiente de densidade padrão (para uma concentração de 5x10⁶), foram utilizados.
2. Para começar, adicione 100 μL de cultura tecidual a cada poço de uma das linhas (aqui linha A, Ver Tabela 1) de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Aqui, não são adicionadas células de efeitos, e servirão como "em branco" para determinar a "liberação mínima/espontânea de ⁵¹Cr" das células-alvo.

Tabela 1: ⁵¹Layout do ensaio de liberação de CR: Células alvo da linha A (10⁴ células/ 100 μL) incubadas apenas com mídia (gera 'branco' para determinar a "liberação mínima/espontânea ^{de 51}Cr"). Linhas B a C-poços contendo diferentes efeitos: razãos de células-alvo (E:T), variando de 50:1 a 1,5:1. Células-alvo da linha H (10⁴ células/100 μL) incubadas com 1% de NP-40 (NP-40 lyses as células-alvo, gerando "liberação máxima ou total ^{de 51}Cr"). Cada razão de E:T é testada em triplicado para cada condição experimental. Coluna 1-3- PBMCs não estimulados e PBMCs estimulados por CPG.

3. Em seguida, gerar uma diluição de células seriais 2X dos PBMCs (em triplicado para cada condição experimental), para obter uma concentração celular effectora variando de 5x10⁵ a 15.625 células/100 μL de mídia (aqui linhas B a G).
   Nota: Neste exemplo, a razão do efeito inicial: célula alvo (E: T) é de 50:1. No entanto, essa razão pode ser ajustada dependendo das especificidades experimentais.
4. Deixe a última linha vazia (aqui linha H) não adicionando nenhuma célula de efeito a esses poços. (Esta linha será usada para gerar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a "liberação máxima ^{de 51}Cr").
5. Coloque a placa na incubadora de 37°C até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.

3. Adicionando ⁵¹cr rotulados WM793 células-alvo ao ensaio

1. Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
2. Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min, usando uma centrífuga designada.
3. Remova a lavagem FBS (supernanato radioativo) em um recipiente de resíduos apropriado.
4. Repita o passo de lavagem resutilização da pelota em um fresco 5 mL de FBS.
5. Centrifugar as células novamente a 1200 rpm por 5 min.
6. Por fim, resuspense a pelota em 10 mL de meio completo.
7. Despeje a suspensão celular WM793 com rótulo ^{de CR (105} células/mL) em um reservatório de reagente descartável.
8. Em seguida, adicione 100 μL dessas células-alvo rotuladas, a cada poço da placa celular de efeito de 96 poços, usando uma pipeta multicanal.
9. Em seguida, adicione 100 μL de 1% NP-40 (na água) à linha de poços que são desprovidos de qualquer célula de efeito (aqui linha H). 1% NP-40 irá lise as células-alvo, e assim esses poços servirão como controles para determinar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a liberação máxima de ⁵¹Cr.
10. Fixar a tampa na placa adicionando um pequeno pedaço de fita permeável a gás em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém ⁵¹Cr.
11. Resumidamente, centrifugar a placa a 1200 rpm. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga.
    Nota: É importante usar uma centrífuga marcada para manusear amostras radioativas.
12. Retire a placa da centrífuga.
13. Coloque a placa em uma incubadora de 37°C com um pequeno pedaço de chumbo protegendo sobre a placa para maior segurança. Incubar por 16 horas para permitir a lise celular alvo.
    Nota: O período de incubação pode variar de 4 a 18 h, dependendo das células efetivas utilizadas e do mecanismo potencial de morte empregado.

4. Colhendo os Supernantes

1. No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa.
2. Em seguida, coloque o quadro de colheita na placa, certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Isso garantirá a coleta de um supernatante livre de células.
3. Agora, devagar e gentilmente pressione os plugues de algodão nos poços.
4. Após aproximadamente 10 segundos, solte a pressão sobre os plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para as tiras do tubo.
5. Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário.
6. Finalmente, carregue os tubos FACS no balcão gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de ⁵¹Cr liberada em cada condição. As amostras são tipicamente medidas por 1 minuto, permitindo uma fácil determinação das "contagens/minutos".
7. Com cuidado, regise a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.

5. Análise de dados

1. Aqui, pbmcs não estimulados foram adicionados às três primeiras colunas, e PBMCs estimulados pelo CpG (CpG ODN, (1 μg/mL) por 24 h) foram adicionados às colunas 4-6. Veja a Tabela 2.

Tabela 2: ⁵¹Dados de ensaio de liberação de cr: Valores de dados 'Contagens por minuto' / 'c. p.m', valores médios de c. p.m e valores de lise por cento.

2. Os dados coletados (contagens por minuto, ou seja.c.p.m) foram inseridos nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram dispostas na placa original.
3. Primeiro, foram calculadas as médias dos triplicados. Tabela 2 - células I3 a P3, para PBMCs não estimulados e células I6 a P6, para PBMCs estimulados pelo CpG.
4. Uma vez determinadas as médias, o percentual de lise específica para cada condição foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula.
   
   
5. A porcentagem de lise específica foi calculada para cada condição (Tabela 2 - células J4 a O4, para PBMCs não estimulados e J7 a O7, para PBMCs não estimulados).

Neste exemplo, células efeitosas estimuladas com CpG (Figura 1, círculos negros) mataram as células-alvo de forma mais eficaz, à medida que a proporção de células efeitos ou células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados (círculos brancos),indicando que a estimulação do CPG é necessária para o aumento observado da lise celular-alvo.

Figura 1: ⁵¹Plano de dispersão de ensaios de cr: Atividade tumoricida por PBMCs humanos, não estimulada(círculos brancos) e após estimulação com CpG(círculos negros),testada em diferentes efeitos: razões celulares alvo (E: T) (variando de 50:1 a 1,5:1).

O ensaio descrito aqui tem uma flexibilidade considerável, pois uma variedade de células-alvo e efeitos podem ser usadas dependendo da pergunta que está sendo feita. Por exemplo, a especificidade celular efeito ou celular pode ser determinada usando diferentes células-alvo ou o mecanismo de matança celular efeitoor pode ser determinado usando células deficientes em proteínas específicas ou usando inibidores específicos de proteínas. Um grande problema com o ensaio de liberação de ⁵¹Cr é o potencial para altas taxas de liberação espontânea pelas células-alvo. Quando cultivada sozinha (sem células efetivas), a liberação espontânea de ⁵¹Cr pelas células-alvo deve, idealmente, não mais do que 30% do total ("máximo") liberado pelas células-alvo imediatamente lise. Taxas mais altas de liberação espontânea podem ser devido ao uso de células-alvo insalubres, seja devido à saúde ruim (por exemplo, cultura estendida de uma linha celular) ou a um período de rotulagem excessivamente longo.

1. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
2. Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).