Saggio per la morte cellulare: saggio di rilascio di cromo della capacità citotossica

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Una delle funzioni principali delle cellule del sistema immunitario è quella di rimuovere le cellule bersaglio che sono state infettate da virus o hanno subito la trasformazione in una cellula tumorale. I saggi in vitro per misurare la capacità citotossica delle cellule immunitarie sono stati un punto fermo nei laboratori per molti anni. Questi saggi sono stati utilizzati per determinare la capacità delle cellule T, delle cellule NK o di qualsiasi altra cellula immunitaria di uccidere le cellule bersaglio in modo antigene-specifico o non specifico. I ligandi di morte (ad esempio, ligando fas o TRAIL), le citochine (ad esempio, IFNg o TNF) o i granuli citotossici (ad esempio, perforina / granzima B) espressi dalle cellule emotrici sono alcuni modi in cui la morte delle cellule bersaglio può essere indotta. Con l'esplosione della ricerca sull'immunoterapia tumorale negli ultimi anni, c'è un crescente interesse nella ricerca di agenti per aumentare l'attività citotossica delle cellule immunitarie per migliorare i risultati dei pazienti. Al contrario, alcune malattie sono caratterizzate dall'attività esuberante dell'attività citotossica delle cellule immunitarie, con conseguenti sforzi per identificare gli agenti per temperare queste risposte. Pertanto, avere un test in cui l'utente può facilmente integrare qualsiasi numero di diverse cellule emotrici, cellule bersaglio e / o modificatori di risposta nel progetto sperimentale può servire come mezzo prezioso per valutare rapidamente la capacità citotossica delle cellule emotrici e / o la reattività della cellula bersaglio.

Questi saggi in vitro comportano la miscelazione di diverse popolazioni cellulari, oltre a utilizzare un numero relativamente basso di cellule emotrici e bersaglio. Pertanto, una necessità del test è quella di etichettare le cellule bersaglio in un modo che possa essere facilmente rilevato e quantizzato, consentendo all'utente di determinare quindi la "lisi specifica percentuale" mediata dalle cellule emotrici. La radioattività - in particolare, il cromo 51 (⁵¹Cr) sotto forma di Na₂⁵¹CrO₄- è un modo economico per etichettare rapidamente e in modo non specifico le proteine cellulari all'interno delle cellule bersaglio (1). La breve etichettatura e i tempi totali del test riducono il potenziale di cambiamenti significativi nel numero e/o nel fenotipo delle cellule bersaglio, che potrebbero influenzare l'esito del test. Dopo la perdita dell'integrità della membrana delle cellule bersaglio a causa dell'attività citotossica delle cellule emotrici, le ⁵¹proteine cellulari marcate con Cr all'interno delle cellule bersaglio vengono rilasciate nel surnatante di coltura, diventando disponibili per la quantificazione. Come con qualsiasi test che esamina la funzione delle cellule immunitarie in vitro, ci sono una serie di considerazioni importanti da considerare per migliorare le prestazioni dell'esperimento. Una delle caratteristiche più critiche è quella di utilizzare cellule emocromatrici sane (per la massima attività citotossica) e target (per la massima reattività e la minima morte spontanea /^{rilascio di 51}Cr). È necessario il contatto tra effettore e cellula bersaglio (che porta all'uso comune di piastre a 96 pozzi a fondo tondo per incoraggiare il contatto cellula-cellula) (2). Infine, l'analisi dei dati dipende dall'inclusione di popolazioni di cellule bersaglio di controllo positive e negative.

Il seguente protocollo delineerà i passaggi per l'esecuzione di un test standard di rilascio ^{di 51}Cr per misurare la capacità citotossica di una popolazione di cellule emotrici, sebbene sia stata recentemente sviluppata una versione non radiativa che utilizza Europium. ^{51 anni} Cr è un potente emettitore di radiazioni γ. Di conseguenza, l'uso di questo test richiede un'adeguata formazione sulla sicurezza delle radiazioni, uno spazio di laboratorio dedicato, un contatore gamma e lo smaltimento di campioni radioattivi.

La sequenza generale degli eventi in questo test sono: 1) preparare ⁵¹bersagli etichettati con Cr; 2) preparare le cellule emotrici e aggiungerle alla piastra mentre le cellule bersaglio sono etichettate; 3) aggiungere bersagli etichettati alla piastra; 4) piastra di incubazione; 5) raccogliere supernatanti; e 6) analizzare i dati dopo aver eseguito i campioni sul contatore. I campioni sono comunemente preparati in triplice copia e quindi mediati per tenere conto di eventuali sottili differenze di pipettaggio.

Un DPI adeguato è importante per questo test. In particolare, l'utente deve indossare un camice da laboratorio e guanti. Gli occhiali di sicurezza possono essere richiesti in base al laboratorio o all'istituzione. Ci dovrebbe essere un'ampia schermatura al piombo per la conservazione sicura e l'uso del ⁵¹Cr durante tutte le fasi. Infine, ci dovrebbero essere spazi di laboratorio dedicati e attrezzature riservate all'utilizzo di ⁵¹Cr, compresa tutta la segnaletica appropriata per indicare dove vengono conservati i campioni con ⁵¹Cr e un contatore Geiger dotato di sonda gamma per esaminare lo spazio per possibili contaminazioni.

In questo esercizio di laboratorio, determineremo la capacità delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) (CpG stimolate vs. non stimolate) di uccidere le cellule di melanoma, utilizzando la linea cellulare del melanoma umano WM793 come modello e il test di rilascio del cromo.

Panoramica della procedura

Il tipico test ⁵¹Cr-release per misurare la morte cellulare prevede i seguenti passaggi:

1. Innanzitutto, le cellule bersaglio sono etichettate con Na₂[⁵¹Cr]O₄. Questo li distingue dalle cellule emotrici nel test.
2. Mentre le cellule bersaglio vengono etichettate, le cellule emotrici vengono raccolte e, utilizzando la tecnica di diluizione seriale, viene generata una titolazione decrescente delle cellule emotrici in una piastra di saggio a fondo rotondo da 96 pozzetti.
3. Alla fine dell'etichettatura della cellula bersaglio, le cellule vengono prima lavate e quindi un numero fisso di cellule viene aggiunto alla piastra di dosaggio che contiene già una serie di diluizioni di cellule emotrici.
4. Successivamente, la miscela cellulare bersaglio-effettore viene incubata per un periodo di tempo definito per consentire una sufficiente interazione cellulare con le cellule bersaglio, per mediare la lisi cellulare.
5. Infine, i supernatanti di coltura vengono raccolti e raccolti in tubi. La quantità di ⁵¹Cr viene quantificata utilizzando un contatore gamma.
6. Alla fine, i dati vengono raccolti e utilizzati per calcolare la "percentuale specifica di lisi cellulare" delle cellule bersaglio.

1. Etichettatura delle cellule target con ⁵¹Cr

1. Per iniziare, preparare le cellule bersaglio, (qui- linea cellulare di melanoma umano WM793), in una sospensione a singola cellula.
2. Per fare ciò, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura del tessuto.
3. Quindi, lavare le cellule con 5 ml di 1X PBS.
4. Tripsinizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tripsina alla piastra per ~ 2 min.
5. Picchiettare delicatamente il matraccio per allentare le celle dalla superficie del pallone.
6. Aggiungere 5 mL di supporti RPMI al pallone e pipettare il supporto su e giù per staccare le celle.
7. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 1200 giri/min. Decantare il surnatante.
8. Aggiungere 10 ml di media al pellet e pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le celle in sospensione.
9. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
10. Trasferire 1x10⁶ celle in un nuovo tubo conico da 15 mL.
11. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1200 giri/min e decantare il surnatante.
12. Vortice brevemente il tubo per risusciere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato indietro.
13. Aggiungere 100 μCi di ⁵¹Cr direttamente alla sospensione della cella target WM793.
    Nota: Ci dovrebbe essere uno spazio di laboratorio dedicato allestito per la particolare radioattività. Inoltre, ci dovrebbe essere un'ampia schermatura al piombo per la conservazione e l'uso sicuri del ⁵¹Cr durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con ⁵¹Cr. È inoltre necessario un contatore Geiger dotato di una sonda per pancake, per sorvegliare lo spazio per possibili contaminazioni.
14. Aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il tubo è ora radioattivo.
15. Posizionare il tubo in un incubatore a 37°C con uno scudo di piombo e incubare per 1 ora. Far scorrere il tubo ogni 15-20 minuti per aumentare l'assorbimento del cromo da parte delle cellule bersaglio.
16. Dopo il periodo di incubazione, lavare le cellule bersaglio con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
17. Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min. Decantare FBS radioattivo lavare in un contenitore di rifiuti appropriato.
18. Risuspenare il pellet e lavare una seconda volta con FBS. Controllare la radioattività incorporata nel pellet utilizzando un contatore Geiger.
19. Ripresa del pellet in 10 mL di terreno completo, ottenendo una concentrazione cellulare di 10⁵ celle/mL.
    Nota: La fase di conteggio delle celle dopo l'etichettatura ⁵¹Cr viene omessa qui in gran parte per motivi di sicurezza. Si può presumere che la concentrazione cellulare WM793 sia la stessa che era prima dell'etichettatura ⁵¹Cr.

2. Preparazione delle cellule emotrici

1. È possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici, come le cellule T umane o di topo e le cellule NK. In questo esempio, sono stati utilizzati PBMC, isolati dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità standard (fino a una concentrazione di 5x10^6).
2. Per iniziare, aggiungere 100 μL di terreno di coltura tissutale a ciascun pozzetti di una delle file (qui riga A, vedi Tabella 1) di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. Qui, non vengono aggiunte cellule emotrici e serviranno come "vuoto" per determinare il "rilascio minimo / spontaneo ^{di 51}Cr" dalle cellule bersaglio.

Tabella 1: ⁵¹Layout del saggio di rilascio Cr: riga A- Cellule bersaglio (10⁴ celle / 100 μL) incubate solo con supporti (genera "vuoto" per determinare il "rilascio minimo/spontaneo ^{di 51}Cr"). Righe da B a C- pozzi contenenti diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E:T), che vanno da 50:1 a 1,5:1. Riga H- cellule bersaglio (10⁴ cellule/100 μL) incubate con l'1% np-40 (NP-40 lisi le cellule bersaglio, generando "rilascio massimo o totale ^{di 51}Cr"). Ogni rapporto E:T viene testato in triplice copia per ogni condizione sperimentale. Colonna 1-3- PBMC non stimolati e COLONNA 4-6- PBMC stimolati da CpG.

3. Successivamente, generare una diluizione seriale di cellule 2X dei PBMC (in triplice copia per ogni condizione sperimentale), per ottenere una concentrazione di cellule emotrici che va da 5x10⁵ a 15.625 celle / 100 μL di media (qui righe da B a G).
   Nota: In questo esempio, il rapporto effettore iniziale: cella target (E: T) è 50:1. Tuttavia, questo rapporto può essere regolato in base alle specifiche sperimentali.
4. Lasciare vuota l'ultima riga (qui riga H) non aggiungendo alcuna celle effettore a questi pozzi. (Questa riga verrà utilizzata per generare il "conteggio totale/min, o (c. p.m)" o il "massimo ⁵¹Cr release").
5. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37°C fino a quando le cellule bersaglio non sono pronte per essere aggiunte.

3. Aggiunta di ⁵¹cellule bersaglio WM793 etichettate Cr al test

1. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall'incubatrice e lavare con 5 ml di FBS per rimuovere eventuali ⁵¹Cr in eccesso.
2. Centrifugare le celle a 1200 giri/min per 5 min, utilizzando una centrifuga designata.
3. Rimuovere il lavaggio FBS (surnatante radioattivo) in un contenitore di rifiuti appropriato.
4. Ripetere la fase di lavaggio risussoso il pellet in un fresco 5 ml di FBS.
5. Centrifugare nuovamente le celle a 1200 giri/min per 5 min.
6. Infine, risusedipere il pellet in 10 ml di mezzo completo.
7. Versare la sospensione di celle WM793 marcata ⁵¹Cr (10⁵ celle/ml) in un serbatoio di reagente monouso.
8. Quindi, aggiungere 100 μL di queste cellule bersaglio etichettate, a ciascun pozzetti della piastra cellulare effettore a 96 pozzetti, usando una pipetta multicanale.
9. Quindi, aggiungere 100 μL di NP-40 all'1% (in acqua) alla fila di pozzi privi di cellule emotrici (qui riga H). L'1% np-40 solcherà le cellule bersaglio, e quindi questi pozzi serviranno come controlli per determinare il "conteggio totale / min, o (c. p.m)" o il rilascio massimo di ⁵¹Cr.
10. Fissare il coperchio alla piastra aggiungendo un piccolo pezzo di nastro permeabile al gas su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene ⁵¹Cr.
11. In breve, centrifugare la piastra a 1200 giri / min. Se viene utilizzata una sola piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga.
    Nota: È importante utilizzare una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi.
12. Rimuovere la piastra dalla centrifuga.
13. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 ° C con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sulla piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire la lisi delle cellule bersaglio.
    Nota: Il periodo di incubazione può variare da 4 a 18 ore a seconda delle cellule emotrici utilizzate e del potenziale meccanismo di uccisione impiegato.

4. Raccolta dei Supernatanti

1. Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio.
2. Quindi, posizionare il telaio di raccolta sul piatto, assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti siano in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ciò garantirà la raccolta di un surnatante privo di cellule.
3. Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzi.
4. Dopo circa 10 secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone e quindi trasferire i tappi di cotone su strisce di tubo.
5. Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario.
6. Infine, caricare i tubi FACS sul contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di ⁵¹Cr rilasciati in ciascuna condizione. I campioni vengono in genere misurati per 1 minuto, consentendo una facile determinazione dei "conteggi / minuto".
7. Registrare con attenzione l'ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.

5. Analisi dei dati

1. Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime tre colonne e i PBMC stimolati da CpG (CpG ODN, (1 μg / mL) per 24 h) sono stati aggiunti alle colonne 4-6. Cfr. tabella 2.

Tabella 2: ⁵¹Dati del saggio di rilascio cr: Valori dei dati 'Counts per minute' / 'c. p.m', valori medi c. p.m e valori di lisi specifici della percentuale calcolata.

2. I dati raccolti (conteggi al minuto, cioè .c.p.m) sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella piastra originale.
3. In primo luogo, sono state calcolate le medie dei triplicati. Tabella 2 - cellule da I3 a P3, per PBMC non stimolati e cellule da I6 a P6, per PBMC stimolati da CpG.
4. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
   
   
5. La percentuale di lisi specifica è stata calcolata per ogni condizione (Tabella 2 - cellule da J4 a O4, per PBMC non stimolati e da J7 a O7, per PBMC non stimolati).

In questo esempio, le cellule emotrici stimolate con CpG (Figura 1, cerchi neri)hanno ucciso le cellule bersaglio in modo più efficace, poiché il rapporto tra cellule emotrici e cellule bersaglio è aumentato. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate (cerchi bianchi), indicando che la stimolazione CpG è necessaria per l'aumento osservato della lisi delle cellule bersaglio.

Figura 1: Grafico a dispersione del saggio ^{Cr 51:} attività tumoricida da parte di PBMC umani, non stimolati(cerchi bianchi)e dopo stimolazione con CpG(cerchi neri),testata a diversi rapporti effettore:cellule bersaglio (E: T) (compresi tra 50:1 e 1,5:1).

Il test qui descritto ha una notevole flessibilità, in quanto è possibile utilizzare una varietà di cellule emotrici e bersaglio a seconda della domanda posta. Ad esempio, la specificità delle cellule emotrici può essere determinata utilizzando diverse cellule bersaglio o il meccanismo di uccisione delle cellule emotrici può essere determinato utilizzando cellule carenti di proteine specifiche o utilizzando inibitori specifici della proteina. Un problema importante con il test di rilascio ^{di 51}Cr è il potenziale per un alto numero di rilascio spontaneo da parte delle cellule bersaglio. Se coltivato da solo (senza cellule emotrici), il rilascio spontaneo di ⁵¹Cr da parte delle cellule bersaglio dovrebbe idealmente essere non superiore al 30% del rilascio totale ("massimo") da parte delle cellule bersaglio immediatamente lisi. Tassi di rilascio spontaneo più elevati possono essere dovuti all'uso di cellule bersaglio malsane, a causa di cattive condizioni di salute (ad esempio, coltura estesa di una linea cellulare) o di un periodo di etichettatura eccessivamente lungo.

1. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
2. Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).