Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Anticorpos policlonais são definidos como uma coleção de anticorpos direcionados contra diferentes determinantes antigênicos de um antígeno ou vários antígenos (1). Embora os anticorpos policlonais sejam ferramentas poderosas para identificar moléculas biológicas, há uma limitação importante - eles são incapazes de distinguir entre antígenos que compartilham determinantes antigênicos. Por exemplo, quando a albumina de soro bovino é usada para imunizar um animal, células B com diferentes ig de superfície responderão a diferentes determinantes antigênicos na albumina de soro bovino. O resultado é uma mistura de anticorpos no antissoro. Como o álbum de soro bovino compartilha alguns epítopos com albumina de soro humano em regiões evolutivamente conservadas da proteína, este antissoro anti-bovino também reagirá com a albumina de soro humano. Portanto, este antissoro não será útil para distinguir entre albuminas bovinas e humanas.

Várias abordagens foram tomadas para superar a questão da especificidade da antisera policlonal. Uma delas é absorver os anticorpos indesejados passando o antiserum através de uma coluna de cromatografia de antígenos imobilizados (2). Este método é tedioso e frequentemente incapaz de remover completamente os anticorpos indesejados. Outra abordagem é isolar células B produtoras de anticorpos individuais e expandi-las na cultura. No entanto, como a maioria das células não transformadas normais, as células B não sobrevivem na cultura de longo prazo.

Para superar a incapacidade das células B de sobreviver na cultura, uma abordagem é preparar um híbridoma de células mieloma-B. Em 1847, Henry Bence-Jones descobriu que pacientes com mieloma múltiplo, um tumor linfoide, produziam uma grande quantidade de anticorpos (3). As células B nesses pacientes tornaram-se malignas e crescem incontrolavelmente. Uma vez que as células B malignas são derivadas de um único clone, elas são idênticas e produzem apenas um único tipo de anticorpo (ou seja,um anticorpo monoclonal, ou mAb). No entanto, a maioria dessas células de mieloma produz anticorpos de especificidades desconhecidas. Em 1975, ao fundir uma célula de mieloma a uma célula B, Cesar Milstein e Georges Kohler conseguiram produzir um hibridoma que pode ser cultivado indefinidamente in vitro e produz um número ilimitado de anticorpos monoclonais de especificidade antigênica conhecida (4). A lógica por trás de sua abordagem é combinar as propriedades imortais da célula de mieloma e as propriedades produtoras de anticorpos da célula B. Sua técnica revolucionou a produção de anticorpos e fornece um meio poderoso para identificação e purificação de moléculas biológicas usando anticorpos monoclonais.

Geralmente, preparar um anticorpo monoclonal requer vários meses. O procedimento geral inclui as seguintes etapas:

1. Imunização e triagem de titer de anticorpos
2. Fusão de células B produtoras de anticorpos e células de mieloma
3. Crescimento seletivo do hybridoma
4. Triagem dos híbridos para produzir o anticorpo monoclonal desejado
5. Clonagem limitando a diluição - um processo pelo qual as células são diluídas a uma concentração para permitir estatisticamente que menos de 1 célula seja adicionada aos poços de uma placa de 96 poços. Alguns poços acabarão com 0 células e outros terão 1 célula. Os poços com semeadas com 1 célula eventualmente crescerão em uma população monoclonal de células.
6. Crescimento do hibridoma e preparação de anticorpo monoclonal

Este protocolo se concentra na última etapa - crescimento do hibridoma e preparação do anticorpo monoclonal. O anticorpo é purificado da cultura supernascida pela precipitação de sulfato de amônio (muitas vezes referido como salgadinho) - um método comumente usado para remover proteínas de uma solução. Proteínas em solução formam ligações de hidrogênio, juntamente com outras interações hidrofílicas, com a água através de seus grupos polares e iônicos expostos. Quando são adicionadas concentrações de íons pequenos e altamente carregados (como amônio ou sulfato), esses grupos competem com as proteínas para a ligação à água. Isso remove as moléculas de água da proteína e diminui sua solubilidade, resultando na precipitação da proteína.

Nota: A técnica de cultura celular estéril deve ser mantida ao manusear as células hibridoma e a mídia de forma estéril (por exemplo, em um armário de biossegurança) até que a purificação de anticorpos se estéreo se estéreo.

1. Descongelamento de células híbridas congeladas

1. Incubar o frasco contendo as células híbridas congeladas em um banho de água de 37°C até apenas descongelar (aproximadamente 2 minutos).
2. Adicione as células descongeladas a um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPMI completo (RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 u/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, piruvato de sódio 1mM, 1x aminoácidos não essenciais, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
3. Centrifugar por 5 min a 1200 RPM para lavar qualquer mídia congelante contaminante.
4. Após a centrifugação, descarte o supernanato líquido e resuspenque a pelota celular em RPMI completo de 5 mL. Em seguida, adicione as células a um frasco de cultura tecidual T75 contendo RPMI completo de 15 mL (o volume final de RPMI é de 20 mL).
5. Cultivar as células em uma incubadora padrão a 37°C com 5% de CO₂. As células não são aderentes enquanto estão na cultura.

2. Expansão hybridoma

1. Permita que as células se expandam por aproximadamente 3 dias até que o frasco seja ~80% confluente.
   Nota: Esse tempo pode variar de acordo com o número inicial de células, bem como diferenças inerentes nas taxas de crescimento de diferentes células. É importante que as células estejam em fase de crescimento exponencial.
2. Uma vez que o frasco inicial atinja ~80% de confluência, remova as células deste frasco inicial de T75, coloque em um tubo de centrífuga cônica e gire (1200 RPM por 5 minutos) para pelotar as células.
3. Resuspenque as células em 6 mL de RPMI completo e, em seguida, distribua a suspensão da célula em três novos frascos T75 (frasco de 2 mL/frasco contendo 18 mL RPMI). Incubar esses três frascos T75 a 37°C com 5% de CO₂ até que sejam ~80% confluentes (Isso deve levar aproximadamente 3 dias).

3. Produção de anticorpos em meio livre de soro

Nota: Neste ponto, as células estão prontas para continuar seu crescimento em um meio livre de soro projetado para o crescimento de linhas celulares hybridoma. Neste protocolo, utilizamos o meio HB Basal Liquid pronto e comercialmente disponível contendo o Produto Hb101 Suplemento HB101.

1. As células de cada um dos três frascos T75 (a ~80% de confluência) são coletadas e centrífugas (1200 RPM por 5 min).
2. A pelota celular de cada frasco T75 é resuspended em 10 mL complementado hb101 meio sem soro e, em seguida, adicionado a dois frascos T225 complementados HB101 sem soro médio (ou seja, suspensão de célula de 5 mL em cada um dos 6 frascos contendo ~220-240 mL HB101 em cada frasco).
3. Continue crescendo as células em frascos T225 e mídia HB101 a 37°C com 5% de CO₂ por três semanas, ou até que as células comecem a morrer. As células estão produzindo mAb durante essas 3 semanas e secretando-a no meio da cultura. Uma vez que as células estão começando a morrer, elas não estão mais produzindo qualquer mAb.

4. Purificação de Anticorpos - Dia 1

Nota: Neste ponto, a esterilidade não precisa ser mantida, portanto, lidar com a mídia de forma estéril (por exemplo, em um armário de biossegurança) não é necessário. Além disso, os híbridos não são considerados um agente de "nível BSL2".

1. Despeje a mídia dos frascos em tubos para um rotor de ângulo fixo. Gire os tubos em uma centrífuga com um rotor de ângulo fixo a 10.000 RPM por 8 minutos. Esta etapa foi projetada para remover os detritos celulares da cultura supernante.
   Nota: Os tamanhos do tubo podem variar dependendo do rotor utilizado. O importante a lembrar é ter o mesmo volume nos tubos para garantir que o rotor esteja devidamente equilibrado antes da centrifugação. É provável que todo o volume da mídia não se encaixe na centrífuga de uma só vez. As demais mídias serão centrifugadas mais tarde (passo 4.5) usando os mesmos tubos.
2. Prepare um béquer de plástico 2L com uma barra de agitação em um balde cercado de gelo. Coloque em um prato de agitação.
3. Conecte uma parte superior do filtro de 500 mL em uma garrafa 1L. Conecte a unidade do filtro superior da garrafa ao vácuo da casa através de tubos apropriados.
4. Despeje o supernatante da etapa 4.1 (que ainda contém o mAb produzido pelas células hibridoma) na parte superior do filtro.
5. Continue usando o mesmo conjunto de tubos para pelotas detritos celulares da mídia (a pelota continuará a ser construída). Aguarde para executar o vácuo até que a parte superior do filtro esteja cheia e outro lote de supernaspeso esteja pronto para entrar. Não deixe o filtro secar ou a filtragem ficará muito lenta.
6. Quando a garrafa 1L estiver perto do máximo, remova a parte superior do filtro e despeje o supernatante em béquer 2L preparado na etapa 4.2. Recoloque a parte superior do filtro. Acompanhe o volume.
7. Repita as etapas de centrifugação e filtragem até que toda a mídia seja processada.
8. Meça 295g de sulfato de amônio por 1L de supernanato filtrado coletado. Enquanto mexe, adicione lentamente o sulfato de amônio ao supernascente nas próximas duas horas (~25 g a cada 15 minutos) para evitar uma alta concentração localizada de sal de sulfato de amônio que pode causar a precipitação de proteínas indesejadas.
9. Uma vez que todo o sulfato de amônio tenha sido adicionado, cubra o béquer com papel alumínio e mova-se com a placa de agitação a 4°C (por exemplo, geladeira walk-in ou sala fria). Mexa durante a noite. A agitação constante da solução é necessária para solubilizar o sal, mas a agitação prolongada pode levar à desnaturação de proteínas na solução na interface superfície/ar.
10. Lave os tubos usando o rotor de ângulo fixo.

5. Purificação de Anticorpos - Dia 2

1. Despeje o sulfato de amônio contendo supernanato do béquer 2L em tubos para um rotor de ângulo fixo. Gire em centrífuga com rotor de ângulo fixo a 6500 RPM por 20 minutos sem freio.
2. Aspirar o aspirador, tomando cuidado para não sugar a pelota, pois ela será macia. Continue usando o mesmo conjunto de tubos para coletar pelotas do sulfato de amônio contendo supernanato.
3. Após a última aspiração, resuspenda cada pelota (que contém anticorpos) em ~1 ml PBS.
4. Remova o sulfato de amônio da solução mAb precipitada por diálise contra grandes volumes de PBS. Para isso, primeiro cortei aproximadamente 1 polegada de tubo de diálise (por exemplo, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Dalton corte de tubos de diálise de celulose) para cada mL de solução mAb. Molhe a tubulação com dH₂O. Amarre um nó em uma extremidade da tubulação e encha com dH₂O para verificar se o nó não vaza. DH_{vazio 2}O da tubulação.
5. Solução pipeta PBS/anticorpos na tubulação. Enxágüe os tubos com um PBS adicional de 0,25 ml e transfira para a tubulação.
6. Fixar a parte superior da tubulação o mais perto possível da solução com um clipe de diálise laranja.
7. Tape a parte superior da tubulação na parte externa de um béquer 4L. Deixe a parte cheia da tubulação pendurada no béquer. Encha o béquer com PBS e adicione uma barra de mexida.
8. Mexa durante a noite por ~8 horas a 4°C.
9. Substitua o PBS no béquer por PBS fresco e mexa por ~8 horas mais duas vezes.
10. Transfira o anticorpo da tubulação para tubos cônicos de 15 ou 50 ml. Centrifugar por 5 minutos a 1200 RPM para remover qualquer precipitado que possa ter se formado. Transfira o supernatante para um tubo fresco.
11. Diluir uma alíquota de anticorpo 1:20 com PBS (anticorpo de 5 μl + 95 μl PBS). Quantita a concentração de anticorpos com um espectotômetro (em branco com PBS) a 280 nm. Use um coeficiente de extinção (ε) de 1,43. A concentração é calculada como
    
    
12. Aliquotar o anticorpo em frascos de tampa de parafuso e armazenar a -80°C.

Utilizando este protocolo, obtivemos os seguintes resultados com vários híbridos diferentes:

Hybridoma: RB6-BC5 (rato anti-mouse Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15,42 mg/mL

Hybridoma: GK1.5 (rato anti-mouse CD4 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 0.485
(0.485/1.43) (20) = 6,78 mg/mL

Hybridoma: 2.43 (rato anti-mouse CD8 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ - 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2,92 mg/mL

Estes são todos resultados de exemplo, e é importante notar que cada produção executada com o mesmo hybridoma pode ser ligeiramente diferente na quantidade de mAb disponível no final.

O procedimento descrito acima é uma maneira simples e direta de purificar anticorpos monoclonais da supernata da cultura hibrida. É importante lembrar, porém, que o sulfato de amônio precipitará outras proteínas que podem estar na cultura supernascida. Consequentemente, as concentrações de anticorpos determinadas a partir das medidas de absorção são estimativas. O usuário pode querer avaliar a pureza da amostra dialisada executando uma pequena quantidade em um gel de poliacrilamida SDS. O mAb produzido por um híbrido, uma vez purificado usando essa metodologia, pode ser usado de várias maneiras. Os mais descritos RB6-BC5, GK1.5 e 2,43 mAb são comumente usados para esgotamento in vivo de células Nêufilas, CÉLULAS CD4 T e CD8 T, respectivamente, em camundongos. Outros mAb produzidos e purificados usando este protocolo podem ser usados para citometria de fluxo (quando conjugado a um fluorohore ou em conjunto com um Ab secundário), ELISA ou mancha ocidental.

1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).