Imunohistoquímica e imunocitoquímica: imageamento de tecidos via microscopia de luz

Fonte: Michael S. Lee¹ e Tonya J. Webb^1
1 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland e o Centro de Câncer Integral Marlene e Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

Imunohistoquímica (IHC) e imunocytoquímica (ICC) são técnicas utilizadas para visualizar a expressão e localização de antígenos específicos usando anticorpos. O primeiro uso publicado do IHC foi em 1941, quando Albert Coons usou a técnica para visualizar a presença de antígeno pneumocócico em seções de tecidos de camundongos infectados com Pneumococcus (1). O nome, imunohistoquímica, é derivado das raízes "imuno-", em referência a anticorpos, e "histo-", em referência às seções teciduais usadas no IHC. A raiz "cito-" na imunocitoquímica destaca a diferença fundamental entre ICC e IHC. Enquanto o IHC usa seções de tecido inteiro, o ICC usa células isoladas do tecido ou cultivadas na cultura. A diferença nas amostras utilizadas significa que a preparação da amostra difere tecnicamente entre iHC e ICC, mas caso contrário, os protocolos para ICC e IHC são idênticos e descobrirão que os termos são frequentemente usados de forma intercambiável.

Tanto no IHC quanto no ICC, anticorpos com etiquetas químicas ou fluorescentes, como peroxidase ou rhodamina, respectivamente, são usados para visualizar a distribuição de qualquer antígeno de interesse através de ligação específica do anticorpo marcado ao antígeno. No caso do IHC, finas fatias de tecido são imobilizadas em um slide para manter a estrutura do tecido antes de serem manchadas, permitindo a visualização de antígenos no contexto de tecidos inteiros (Figura 1). No caso do ICC, as células são distribuídas uniformemente em um slide antes de serem manchadas, permitindo a visualização da distribuição de antígenos dentro de células individuais, mas não dentro da estrutura de qualquer tecido específico. Devido às semelhanças entre os dois protocolos, este protocolo se concentrará no IHC para abordar as complexidades adicionais da preparação da amostra envolvida no IHC.

Figura 1: Esboço do Protocolo IHC. Esboço visual de um protocolo IHC para tecido embutido em parafina dissecado a partir de um rato. Este protocolo usa um anticorpo secundário biotinína e strepavidin-HRP para visualizar a localização da ligação de anticorpos. Outras opções, como anticorpos fluorescentes marcados, também são possíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A primeira grande decisão ao realizar o IHC é como preparar as seções teciduais para manter a estrutura do tecido durante todo o processo de coloração. As duas principais opções são seções fixadas de formalina de tecido embutido em parafina ou seções frescas de tecido congelado. Não há uma resposta simples sobre qual método usar, pois depende de qual análise a jusante será conduzida. A fixação de formalina de tecidos incorporados para a parafina é geralmente pensada para preservar melhor a morfologia tecidual para uma imagem ideal, enquanto o congelamento de tecido fresco pode preservar a função proteica para ensaios subsequentes fora do IHC. Além disso, seções de tecido congelado fresco têm se mostrado mais adequadas para a análise da expressão genética (2). Uma terceira consideração é se os anticorpos para o seu antígeno de interesse são adequados para seções de tecido fixo ou congelado, pois alguns anticorpos só foram otimizados para um tipo específico de seção e podem não funcionar para outros. Por fim, também é preciso determinar quanto tempo eles precisam para armazenar as seções de tecido, uma vez que amostras congeladas frescas devem ser mantidas a -80°C e podem não durar mais de um ano enquanto seções fixas podem ser armazenadas por muito mais tempo à temperatura ambiente. Estas são algumas das principais considerações para determinar se usar seções fixas de formalina de tecido embutido parafina ou seções frescas de tecido congelado. Em última análise, se alguém tem tecido suficiente, talvez seja melhor ter alguns dos dois.

Neste experimento, nos propusemos a determinar se a expressão cyclin D1 foi aumentada em baços ampliados a partir de um modelo espontâneo de desenvolvimento de linfoma. Amostras de tecido esplênico foram isoladas pela primeira vez de camundongos do tipo selvagem, camundongos transgênicos que não têm linfoma, ou camundongos transgênicos que desenvolveram linfoma espontaneamente. As amostras de tecido de baço foram fixadas em paraformaldeído, embutidas em parafina, seccionadas, manchadas usando um anticorpo primário anti-cíclin D1 seguido por um anticorpo secundário anti-rato de cavalo, e desenvolvidas usando 3,3 diaminobenzidina (DAB). As seções foram então contra-manchadas na Solução de Hematoxilina Harris e, em seguida, as seções foram imagens em ampliação de 20X.

Reagentes

Seções incorporadas à parafina

1. 4% paraformaldeído (PFA)
2. Etanol (anidro desnaturado, grau histológico 100%, 95%, 80%, 75% e 50%). Pode ser diluído de estoque 100% usando água dupla destilada (ddH₂O)
3. Xileno
4. Lâmina de vidro compatível com IHC para garantir que a seção tecidual permaneça presa durante todo o procedimento. Slides de vidro compatíveis com IHC têm um revestimento especializado e estão prontamente disponíveis em vários varejistas. Se estiver executando o ICC, use um slide com câmara. Os slides de câmara permitem que as células sejam semeadas nas câmaras e colocadas na incubadora até que as células se conectem ao slide e atinjam a confluência adequada, momento em que as câmaras podem ser removidas e a coloração pode proceder da mesma maneira que o IHC.
5. Parafina
6. 0,3% peróxido de hidrogênio (H₂O₂)/metanol: Para preparar, adicione 1 mL 30% H₂O₂ a 99 mL de metanol. Armazenar a -20°C
7. Tampão de recuperação de antígeno: PH 6.0 tampão de citrato IHC

Seções congeladas frescas

1. Composto de incorporação da temperatura de corte ideal (OCT)
2. Fixação ideal: 4% PFA ou acetona que foi resfriado a -20°C

Mancha

1. Tampão de bloqueio: Deve ser determinado pelo usuário. Um exemplo é o soro de cavalo diluído em 1X PBS
2. Anticorpo primário diluído: veja as especificações do fabricante
3. Anticorpo secundário biotinilado diluído: veja as especificações do fabricante
4. Visão diluído peroxidase (HRP): Somente para visualização peroxidase. Veja as especificações do fabricante.
5. DAB ou outro substrato compatível
6. Contra-mancha (opcional)
7. Etanol (anidro desnaturado, grau histológico 100% e 95%)
8. Xileno
9. Monte Organo/Limonene

1. Preparação de Células para Imunocytoquímica

1. Células de sementes de interesse em lâminas câmara ou tampas câmaras adicionando 0,5 mL de suspensão celular aos poços de uma placa de cultura de 24 poços.
   Nota: Algumas células podem exigir crescimento em tampas tratadas, como deslizamentos tratados com poli-lisina. As condições ideais de tratamento devem ser determinadas pelo usuário, dependendo do tipo celular que está sendo utilizado.
2. Coloque a placa em uma incubadora de CO₂ umidificada e permita que as células cresçam a 37°C até 50-70% confluentes.
3. Uma vez que as células atinjam a confluência ideal, remova a mídia cultural de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em 0,5 mL de 4% PFA (diluída em 1X PBS) e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.
4. Retire o fixador e lave os poços três vezes com 1 mL de PBS 1X.
5. Em seguida, permeabilize as células adicionando 0,5 mL de 0,1% Triton-X-100 em 1X PBS para cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
6. Aspire o tampão de permeabilização e lave os poços três vezes com 1 mL de 1X PBS.
7. As células em tampas são agora fixas e permeabilizadas. Proceda ao procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imunohistoquímica, com exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de poço 24, em vez de diretamente em um slide de seção de tecido.

2. Preparação de Seções Parafina-Fixadas para Coloração

1. Obter seções de tecido embutidas de formalina preparadas.

Desparafinação

2. Mergulhe os slides em 100% xileno 2 vezes por 5 minutos cada.

Reidratação

3. Mergulhe os slides em 100% etanol 2 vezes por 3 minutos cada.
4. Mergulhe os slides em 95% de etanol por 3 min.
5. Mergulhe os slides em 70% de etanol por 3 min.
6. Mergulhe os slides em 50% de etanol por 3 min.

Bloqueando atividade peroxidase endógena

7. Incubar os slides em 100 mL de 0,3% H₂O₂ por 30 min a temperatura ambiente.
8. Lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Recuperação de antígenos

9. Mergulhe os slides no tampão citrato IHC (pH 6) e ferva-os por 20 minutos.
10. As lâminas de tecido estão prontas para coloração.

3. Preparação de seções recém-congeladas e incorporadas oTC para coloração

1. Coloque 5 mm de tecido fresco isolado em um molde e adicione OCT até que a seção esteja completamente coberta.
2. Submergir lentamente o bloco tecidual em nitrogênio líquido até ficar completamente congelado. A amostra agora pode ser armazenada a -80°C por até 1 ano.
3. Uma vez pronto para a secção, transfira o bloco de tecido congelado para um criostat e permita que toda a configuração chegue a -20°C.
4. Corte seções de tecido de 5 a 10 μm de espessura usando um criostat e use pincel para colocar seções diretamente em lâminas de vidro compatíveis com IHC.
5. Deixe os slides secarem durante a noite à temperatura ambiente. Os slides também podem ser armazenados a -80°C.
6. Mergulhe os slides em 250 mL de 4% PFA por 15 minutos à temperatura ambiente para corrigir os slides antes da coloração. O método de fixação ideal deve ser determinado pelo usuário.
7. Mergulhe os slides em 250 mL de 1X PBS 2 vezes por 5 min cada.
8. Mergulhe os slides em 250 mL de 0,3% H₂O₂ por 30 min em temperatura ambiente, a fim de bloquear qualquer atividade peroxidase endógena.
9. Mergulhe os slides em 250 mL de 1X PBS 2 vezes por 5 min cada.
10. Os slides estão prontos para coloração.

4. Mancha

1. Circule o tecido com uma barreira hidrofóbica usando uma caneta de barreira.

Bloqueio

2. Usando uma pipeta, coloque 100 μL de tampão de bloqueio (soro de cavalo diluído em 1X PBS) - sobre a seção durante 1 hora em temperatura ambiente.
3. Remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.

Incubação primária de anticorpos

4. Incubar o tecido cercado com solução de anticorpos primários diluídos de 100 μL (cilina anti-humana do rato D1 diluída 1:100 no buffer de bloqueio) por 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Escorra o anticorpo primário de cada slide e lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Incubação secundária de anticorpos

6. Incubar a amostra com 100 μL de anticorpo secundário biotinilado diluído (cavalo antinacinado anti-rato IgG diluído 1:200) por 30 minutos à temperatura ambiente.
7. Remova o anticorpo secundário drenando as seções e lave com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Desenvolvimento de cores

8. Visualização usando HRP: Adicione 100 μL de reagente do complexo avidin-biotina (ABC) e incuba as seções no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente
   Nota: Anticorpos fluorescentes também podem ser usados e visualizados usando um microscópio apropriado.
9. Lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
10. Desenvolva os slides incubando as seções em 100 μL de DAB por até 5 min.
11. Pare o desenvolvimento adicionando água destilada (dH₂O) por 5 min a temperatura ambiente.

Contra-retenção (se desejar)

12. Mergulhe os slides brevemente na Solução de Hematoxilina Harris (ou 0,5% verde metil em acetato de sódio de 0,1M (pH 4,2)) por 10 minutos.
13. Enxágüe a contra-mancha lavando slides em dH 2 O duas_vezespor 5 min cada.

Desidratação

14. Mergulhe os slides em 95% de etanol 2 vezes por 5 min cada.
15. Mergulhe os slides em 100% etanol 2 vezes por 5 minutos cada.
16. Mergulhe os slides em 100% xileno 2 vezes por 5 minutos cada.
17. Borrida os slides com uma toalha de papel.

Aplicativo de montagem e coberturas

18. Adicione uma gota de mídia de montagem, como Organo-Limonene Mount, aos slides e coloque um deslizamento sobre as seções.

Análise microscópica

19. Observe as seções manchadas sob um microscópio apropriado para análise. Aqui um microscópio de luz padrão foi usado para observação e uma câmera digital montada foi usada para imagem.

IHC e ICC têm uma vasta gama de aplicações. Por exemplo, um uso do IHC é examinar a expressão de oncogenes em modelos espontâneos de camundongos de desenvolvimento de tumores. Na Figura 2,nos propusemos a determinar se a expressão cyclin D1 foi aumentada em baços aumentados em um modelo de camundongo espontâneo de desenvolvimento de linfoma. As amostras de tecido esplênico foram fixadas em paraformaldeído, embutidas em parafina, seccionadas, manchadas usando um anticorpo anti-cíclin D1 (diluído 1:200 no buffer de bloqueio), e então as seções foram imagens em ampliação de 20X. As células expressas cyclin D1 são indicadas pela cor marrom-avermelhada contra o fundo do tecido azul. Esses resultados sugerem que a expressão cíclina D1 foi aumentada em baços aumentados, indicando uma correlação entre o desenvolvimento do câncer e a expressão cyclin D1 neste modelo.

Figura 2: Expressão de Cyclin D1 esplênica em um modelo de rato duplo transgênico espontâneo (DTG) de linfoma. Uma imagem de tecido esplênico manchado com um anticorpo primário anti-Cyclin D1, contra-manchado com verde metil, e visualizado usando um anticorpo secundário biotinína e reagente ABC ativado com substrato DAB. A cor marrom-avermelhada representa locais onde o anticorpo tem limite indicando a presença de Cyclin D1 expressando células tumorais dentro da estrutura do tecido esplênico que foi contra-manchado azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imunohistoquímica (IHC) e imunocytoquímica (ICC) são técnicas utilizadas para visualizar a expressão e localização de antígenos específicos usando anticorpos. Os tecidos são primeiro cortados em seções finas que mantêm a morfologia tecidual e colocados em um slide. Os anticorpos são então adicionados e ligarão o antígeno de interesse e são equipados com uma etiqueta específica que permite que eles sejam visualizados sob um microscópio. Assim, por meio desse conceito básico, a distribuição de antígenos no contexto da estrutura tecidual pode ser visualizada e estudada. No entanto, embora o conceito abrangente seja básico, existem múltiplas abordagens e variações diferentes que foram desenvolvidas que aumentam tanto a complexidade quanto a utilidade dessas técnicas. Este artigo abordou o conceito básico de IHC e ICC, as principais decisões que precisam ser consideradas ao utilizar essas técnicas, e um protocolo passo a passo detalhado. As imagens produzidas pelo IHC e pelo ICC são geralmente o produto final e podem ser publicadas como é para destacar diferenças óbvias em quantidades ou distribuição de manchas entre diferentes condições.