Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía óptica

Fuente: Michael S. Lee¹ y Tonya J. Webb^1
1 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas utilizadas para visualizar la expresión y localización de antígenos específicos utilizando anticuerpos. El primer uso publicado de IHC fue en 1941 cuando Albert Coons utilizó la técnica para visualizar la presencia de antígeno neumocócico en secciones de tejido de ratones infectados con Pneumococcus (1). El nombre, inmunohistoquímica, se deriva de las raíces "inmuno-", en referencia a los anticuerpos, y "histo-", en referencia a las secciones de tejido utilizadas en IHC. La raíz "cito-" en inmunocitoquímica destaca la diferencia clave entre ICC e IHC. Mientras que IHC utiliza secciones de tejido entero, ICC utiliza células que han sido aisladas de tejido o cultivadas en cultivo. La diferencia en las muestras utilizadas significa que la preparación de muestras difiere técnicamente entre iHC y la CPI, pero de lo contrario los protocolos para ICC e IHC son idénticos y uno encontrará que los términos se utilizan con frecuencia indistintamente.

Tanto en IHC como en ICC, los anticuerpos con etiquetas químicas o fluorescentes, como la peroxidasa o la rodamina, respectivamente, se utilizan para visualizar la distribución de cualquier antígeno de interés a través de la unión específica del anticuerpo etiquetado al antígeno. En el caso de IHC, las rodajas finas de tejido se inmovilizan en una diapositiva para mantener la estructura del tejido antes de ser manchado, permitiendo la visualización de antígenos en el contexto de tejidos enteros (Figura 1). En el caso de la CPI, las células se distribuyen uniformemente en una diapositiva antes de ser teñidas, permitiendo la visualización de la distribución de antígenos dentro de las células individuales, pero no dentro de la estructura de cualquier tejido específico. Debido a las similitudes entre los dos protocolos, este protocolo se centrará en iHC para abordar las complejidades adicionales de la preparación de muestras involucradas en el IHC.

Figura 1: Esquema del Protocolo IHC. Esquema visual de un protocolo IHC para tejido incrustado en parafina diseccionado desde un ratón. Este protocolo utiliza un anticuerpo secundario biotinilado y estrepavidina-HRP para visualizar la ubicación de la unión de anticuerpos. Otras opciones, como los anticuerpos etiquetados fluorescentemente, también son posibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La primera decisión importante al realizar IHC es cómo preparar las secciones de tejido con el fin de mantener la estructura del tejido durante todo el proceso de tinción. Las dos opciones principales son secciones fijas de formalina de tejido incrustado en parafina o secciones frescas de tejido congelado. No hay una respuesta simple sobre qué método utilizar, ya que depende de qué análisis posterior se llevará a cabo. La formalina-fijación de los tejidos incrustados de parafina generalmente se piensa para preservar mejor la morfología del tejido para obtener imágenes óptimas, mientras que la congelación de tejido fresco puede preservar la función proteica para ensayos posteriores fuera de IHC. Además, se ha demostrado que las secciones de tejido congelado fresco son más adecuadas para el análisis de la expresión génica (2). Una tercera consideración es si los anticuerpos para su antígeno de interés son adecuados para secciones de tejido fijo o congelado, ya que algunos anticuerpos solo se han optimizado para un tipo específico de sección y pueden no funcionar para otros. Por último, también hay que determinar cuánto tiempo necesitan para almacenar las secciones de tejido, ya que las muestras congeladas frescas deben mantenerse a -80 oC y no pueden durar más de un año, mientras que las secciones fijas se pueden almacenar durante mucho más tiempo a temperatura ambiente. Estas son algunas de las principales consideraciones para determinar si se deben utilizar secciones fijas de formalina de tejido incrustado en parafina o secciones frescas de tejido congelado. En última instancia, si uno tiene suficiente tejido, puede ser mejor sólo tener algunos de ambos.

En este experimento, nos propusimos determinar si la expresión de ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado a partir de un modelo espontáneo de ratón de desarrollo de linfoma. Las muestras de tejido esplénico se aislaron primero de ratones de tipo salvaje, ratones transgénicos que no tienen linfoma o ratones transgénicos que tienen linfoma desarrollado espontáneamente. Las muestras de tejido del bazo se fijaron en paraformaldehído, incrustadas en parafina, seccionadas, teñidas con un anticuerpo primario anticiclina D1 de ratón seguido de un anticuerpo secundario anti-ratón de caballo, y desarrolladas con 3,3-diaminobenzidina (DAB). Las secciones fueron contrarrestadas en Harris Hematoxylin Solution y luego las secciones fueron imágenes con aumento 20X.

Reactivos

Secciones integradas en Parafina

1. 4% Paraformaldehyde (PFA)
2. Etanol (anhidro desnaturalizado, grado histológico 100%, 95%, 80%, 75% y 50%). Se puede diluir a partir de 100% de stock utilizando agua destilada doble (ddH₂O)
3. Xileno
4. Diapositiva de vidrio compatible con IHC para asegurar que la sección de tejido permanezca unida durante todo el procedimiento. Las guías de vidrio compatibles con IHC tienen un recubrimiento especializado y están disponibles en varios minoristas. Si realiza ICC, utilice una diapositiva con cámara. Las diapositivas acotadas permiten que las células se salpiquen en las cámaras y se coloquen en la incubadora hasta que las células se adhieran a la diapositiva y alcancen la confluencia adecuada, momento en el que las cámaras se pueden retirar y la tinción puede continuar de la misma manera que IHC.
5. Parafina
6. 0.3% Peróxido de hidrógeno (H₂O₂)/metanol: Para preparar, añadir 1 mL 30% H₂O 2 O₂ a 99 mL de metanol. Conservar a -20oC
7. Tampón de recuperación de antígenos: tampón de citrato IHC pH 6.0

Secciones Frescas Congeladas

1. Compuesto de incrustación de temperatura de corte óptima (OCT)
2. Fijador óptimo: 4% PFA o acetona que se ha enfriado a -20 oC

Tinción

1. Búfer de bloqueo: debe ser determinado por el usuario. Un ejemplo es el suero de caballo diluido en 1X PBS
2. Anticuerpo primario diluido: ver las especificaciones del fabricante
3. Anticuerpo secundario biotinylato diluido: ver las especificaciones del fabricante
4. Peroxidasa de ávidina-caballo diluida (HRP): Sólo para la visualización de peroxidasa. Consulte las especificaciones del fabricante.
5. DAB u otro sustrato compatible
6. Contramancha (opcional)
7. Etanol (anhidro desnaturalizado, grado histológico 100% y 95%)
8. Xileno
9. Montaje Organo/Limoneno

1. Preparación de células para la inmunocitoquímica

1. Células de semilla de interés sobre diapositivas con cámara o cubredes con cámara añadiendo 0,5 ml de suspensión celular a los pozos de una placa de cultivo de 24 pozos.
   Nota: Algunas células pueden requerir crecimiento en los labios de cubiertatratada, como los cubreobjetos tratados con polilisina. Las condiciones óptimas de tratamiento deben ser determinadas por el usuario dependiendo del tipo de célula que se esté utilizando.
2. Coloque la placa en una incubadora de CO₂ humidificada y permita que las células crezcan a 37oC hasta un 50-70% de confluente.
3. Una vez que las células alcancen una confluencia óptima, retire los medios de cultivo de cada poca y luego, fije las células incubando en 0,5 ml de 4% de PFA (diluido en 1X PBS) e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el fijador y lave los pozos tres veces con 1 ml de 1X PBS.
5. A continuación, permeabilizar las células agregando 0.5 mL de 0.1% Triton-X-100 en 1X PBS a cada pozo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
6. Aspirar fuera del tampón de permeabilización y lavar los pozos tres veces con 1 mL de 1X PBS.
7. Las células en los labios de cubierta ahora están fijas y permeabilizadas. Proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica, con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en un portaobjetos de sección de tejido.

2. Preparación de secciones de formalina fija, incrustadas en parafina para la tinción

1. Obtenga secciones de tejido sinua inadtemis preparadas y fijas en la formalina.

Desparaffinización

2. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.

Rehidratación

3. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 3 min cada una.
4. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% durante 3 min.
5. Sumerja las diapositivas en 70% de etanol durante 3 min.
6. Sumerja las diapositivas en 50% de etanol durante 3 min.

Bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa

7. Incubar los portaobjetos en 100 ml de 0,3% H₂O₂ durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.

Recuperación de antígenos

9. Sumerja las diapositivas en el tampón de citrato IHC (pH 6) y herértelas durante 20 minutos.
10. Las diapositivas de tejido ya están listas para la tinción.

3. Preparación de secciones de inmovilización fresca, OTC para la tinción

1. Coloque 5 mm de tejido aislado fresco en un molde y agregue OCT hasta que la sección esté completamente cubierta.
2. Sumerja lentamente el bloque de tejido en nitrógeno líquido hasta que se congele por completo. La muestra ahora se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 año.
3. Una vez listo para el seccionamiento, transfiera el bloque de tejido congelado a un criostato y permita que toda la configuración llegue a -20 oC.
4. Corte secciones de tejido grueso de 5-10 m con un criostato y use un cepillo para colocar secciones directamente en diapositivas de vidrio compatibles con IHC.
5. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Las diapositivas también se pueden almacenar a -80 oC.
6. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar los portaobjetos antes de la tinción. El método de fijación óptimo debe ser determinado por el usuario.
7. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
8. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 0,3% H₂O₂ para 30 min a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa.
9. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
10. Las diapositivas ya están listas para la tinción.

4. Tinción

1. Círculo del tejido con una barrera hidrófoba usando una pluma de barrera.

Bloqueo

2. Usando una pipeta, coloque 100 l de tampón de bloqueo (suero de caballo diluido en 1X PBS) - sobre la sección durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta.

Incubación de anticuerpos primarios

4. Incubar el tejido rodeado con una solución de anticuerpos primarios diluido de 100 l (ciclina antihumana de ratón D1 diluida 1:100 en tampón de bloqueo) durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Escurrir el anticuerpo primario de cada portaobjetos y lavar los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 minutos cada uno.

Incubación Secundaria de Anticuerpos

6. Incubar la muestra con 100 ml de anticuerpo secundario biotinilado diluido (IgG antiratón de caballo biotinilado diluido 1:200) durante 30 min a temperatura ambiente.
7. Retire el anticuerpo secundario drenando las secciones y lávelo con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.

Desarrollo del color

8. Visualización mediante HRP: Añadir 100 ml de reactivo complejo de avidina-biotina (ABC) e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente
   Nota: Los anticuerpos con etiquetas fluorescentes también se pueden utilizar y visualizar con un microscopio adecuado.
9. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
10. Desarrollar las diapositivas incubando las secciones en 100 s de DAB durante un máximo de 5 min.
11. Detenga el desarrollo añadiendo agua destilada (dH₂O) durante 5 min a temperatura ambiente.

Contramanchación (si se desea)

12. Sumerja las diapositivas brevemente en Harris Hematoxylin Solution (o 0.5% de verde metilo en 0.1M de acetato de sodio (pH 4.2)) durante 10 min.
13. Enjuague la contramancha lavando los portaobjetos en dH₂O dos veces durante 5 min cada uno.

Deshidratación

14. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% 2 veces durante 5 min cada una.
15. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 5 min cada una.
16. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.
17. Sopla reline las diapositivas con una toalla de papel.

Aplicación de montaje y cubreobjetos

18. Agregue una gota de soporte de montaje como Organo-Limoneene Mount a las diapositivas y coloque una tapa sobre las secciones.

Análisis microscópico

19. Observe las secciones manchadas bajo un microscopio apropiado para el análisis. Aquí se utilizó un microscopio de luz estándar para la observación y se utilizó una cámara digital montada para la toma de imágenes.

IHC e ICC tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, un uso de IHC es examinar la expresión de oncogenes en modelos espontáneos de ratón de desarrollo tumoral. En la Figura 2, nos propusimos determinar si la expresión de ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado en un modelo espontáneo de ratón de desarrollo de linfoma. Las muestras de tejido esplénico se fijaron en paraformaldehído, incrustadas en parafina, seccionadas, teñidas utilizando un anticuerpo anticiclina D1 (diluido 1:200 en tampón de bloqueo), y luego las secciones se crearon como imagen con un aumento de 20x. Las células expresións de la ciclina D1 están indicadas por el color marrón rojizo sobre el fondo del tejido azul. Estos resultados sugieren que la expresión de la ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado, lo que indica una correlación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de la ciclina D1 en este modelo.

Figura 2: Expresión de ciclina esplénica D1 en un modelo de ratón doble transgénico espontáneo (DTG) de linfoma. Una imagen de tejido esplénico manchado con un anticuerpo primario anti-Ciclina D1, contrarestado con verde metilo, y visualizado utilizando un anticuerpo secundario biotinilado y un reactivo ABC activado con sustrato DAB. El color marrón rojizo representa lugares donde el anticuerpo ha encualado indicando la presencia de Cyclin D1 expresando células tumorales dentro de la estructura del tejido esplénico que ha sido contramanchado azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas utilizadas para visualizar la expresión y localización de antígenos específicos utilizando anticuerpos. Los tejidos se cortan primero en secciones delgadas que mantienen la morfología del tejido y se colocan en una diapositiva. A continuación, se añaden los anticuerpos que unen el antígeno de interés y están equipados con una etiqueta específica que les permite visualizarse bajo un microscopio. Así, a través de este concepto básico, se puede visualizar y estudiar la distribución de antígenos en el contexto de la estructura tisular. Sin embargo, si bien el concepto general es básico, hay múltiples enfoques y variaciones diferentes que se han desarrollado que aumentan tanto la complejidad como la utilidad de estas técnicas. Este documento ha abarcado el concepto básico de IHC y icc, las principales decisiones que deben tenerse en cuenta al utilizar estas técnicas, y un protocolo detallado paso a paso. Las imágenes producidas por IHC e ICC son generalmente el producto final y pueden publicarse como lo es para resaltar diferencias obvias en cantidades o distribución de tinción entre diferentes condiciones.

1. Coons, A. H. Creech, H. J., Jones, N. and Berliner, E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 45 (3), 159-170 (1942).
2. Ripoli, F. L., Mohr, A., Hammer, S. C., Willenbrock, S., Hewicker-Trautwein, M., Hennecke, S., Escobar, H. M. and Nolte, I. A comparison of fresh frozen vs. Formalin-fixed, paraffin-embedded specimens of canine mammary tumors via branched-DNA assay. International Journal of Molecular Sciences, 17 (5) (2016).