免疫组织化学和免疫细胞化学:通过光显微镜进行组织成像

Overview

资料来源:迈克尔·^李1和托尼娅·^韦伯1
¹马里兰大学医学院微生物学和免疫学系，马里兰州巴尔的摩的马琳和斯图尔特·格林鲍姆综合癌症中心 21201

免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）是使用抗体可视化特定抗原的表达和定位的技术。IHC的首次使用是在1941年，当时阿尔伯特·库因斯利用这项技术来可视化感染肺炎球菌（1）的小鼠在组织部分中存在肺炎球菌抗原。名称，免疫组织化学，是从根"免疫-"，指抗体，和"组织-"，参照IHC中使用的组织部分。免疫细胞化学中根的"细胞-"突出了ICC和IHC之间的关键区别。IHC使用整个组织的各个部分，而ICC使用从组织分离或培养的细胞。所用样品的差异意味着样品制备在技术上因IHC和ICC而异，但除此之外，ICC和IHC的协议是相同的，人们会发现这些术语是可互换使用的。

在IHC和ICC中，分别带有化学或荧光标记的抗体，如过氧化物酶或罗丹，通过标记的抗体与抗原的特异性结合，用于可视化任何感兴趣的抗原的分布。在IHC的情况下，薄薄的组织切片被固定在幻灯片上，在被染色之前保持组织的结构，从而允许在整个组织环境中显示抗原（图1）。在ICC的情况下，细胞在被染色之前均匀地分布在幻灯片上，允许在单个细胞内显示抗原分布，但不在任何特定组织的结构内。由于两个协议之间的相似性，该协议将侧重于IHC，以解决IHC中涉及样品制备的额外复杂性。

图1:IHC协议大纲。从小鼠解剖的石蜡嵌入组织的 IHC 协议的视觉轮廓。该协议使用生物回位抗体和链球菌-HRP来可视化抗体结合的位置。其他选项，如荧光标记抗体，也是可能的。请点击此处查看此图的较大版本。

执行 IHC 时的第一个重大决策是如何准备组织部分，以便在整个染色过程中保持组织的结构。两个主要选择是石蜡嵌入组织或冷冻组织的新鲜部分的正式固定部分。对于使用哪种方法，没有简单的答案，因为它取决于将进行的下游分析。石蜡嵌入组织的形式固定通常被认为可以更好地保存组织形态，以实现最佳成像，而冷冻新鲜组织可以保留蛋白质功能，用于 IHC 以外的后续检测。此外，新鲜冷冻组织部分已被证明更适合基因表达分析（2）。第三个考虑因素是，您感兴趣的抗原的抗体是否适合固定或冷冻组织部分，因为某些抗体仅针对特定类型的部分进行了优化，可能不适用于其他部分。最后，还需要确定它们需要多久来储存组织部分，因为新鲜冷冻样品必须保持在-80°C，并且不能持续超过一年，而固定切片可以在室温下储存更长时间。这些是确定是使用石蜡嵌入组织的形式固定部分还是冷冻组织的新鲜部分的一些主要考虑因素。最终，如果一个人有足够的组织，最好只是有一些两者。

在这个实验中，我们开始确定环素D1表达是否从淋巴瘤发育的自发小鼠模型增大了扩大的脾脏。首先从野生型小鼠、没有淋巴瘤的转基因小鼠或自发发展淋巴瘤的转基因小鼠中分离出脾组织样本。脾脏组织样本固定在甲醛中，嵌入石蜡中，分片，使用小鼠抗环素D1原抗体染色，然后使用马抗小鼠二次抗体，并使用3，3-二氨基苯甲酸（DAB）开发。然后，在哈里斯赫马图林溶液中对节进行反染色，然后以20倍放大倍率对各部分进行成像。

试剂

石蜡嵌入部分

4% 甲醛（PFA）
乙醇（无水变性，组织学等级100%，95%，80%，75%，和50%）。可使用双蒸馏水（ddH₂O）从100%库存中稀释
二甲苯
IHC 兼容玻璃滑动，以确保组织部分在整个过程中保持连接。IHC 兼容玻璃玻片具有专用涂层，可从多个零售商处随时获得。如果执行 ICC，请使用室幻灯片。室室幻灯片允许将细胞播种在腔室中并放置在培养箱中，直到细胞附着在幻灯片上并达到适当的汇合点，此时，室可以去除，染色方式可以像 IHC 一样进行。
石蜡
0.3% 过氧化氢（H₂O₂）/甲醇:要制备，添加 1 mL 30% H₂O₂至 99 mL 甲醇。储存在-20°C
抗原检索缓冲液:IHC酸酸缓冲液pH6.0

新鲜冷冻部分

最佳切削温度（OCT）嵌入化合物
最佳固定性:4% PFA 或丙酮已冷却至 -20°C

染色

阻塞缓冲区:应由用户确定。一个例子是马血清在1XPBS中稀释
稀释原抗体:参见制造商规格
稀释的生物防化二级抗体:参见制造商规格
稀释的红萝卜过氧化物酶（HRP）:仅适用于过氧化物酶可视化。请参阅制造商规格。
DAB 或其他兼容基板
反污（可选）
乙醇（无水变性，组织学等级100%和95%）
二甲苯
奥诺/利莫内山

Procedure

1. 免疫细胞化学细胞的制备

通过在24孔培养板的孔中加入0.5 mL的细胞悬浮液，将感兴趣的种子细胞添加到室片或室盖上。
注意:有些细胞可能需要在经过处理的盖玻片上生长，例如用多莱塞处理的盖玻片。最佳治疗条件应由用户根据所使用的细胞类型确定。
将板放入加_湿CO2培养箱中，让细胞在37°C生长，直到50-70%汇合。
一旦细胞达到最佳汇合，从每个孔中取出培养培养物，然后，通过在0.5 mL的4%PFA（在1X PBS中稀释）孵育细胞，并在室温下孵育20分钟，从而修复细胞。
用 1 mL 1X PBS 去除固定剂并清洗水井三次。
接下来，通过在1X PBS中加入0.5 mL 0.1%的Triton-X-100到每个井中，并在室温下孵育15分钟，从而渗透细胞。
吸气缓冲液，用 1x PBS 的 1 mL 洗井三次。
盖玻上的细胞现在被固定和渗透。继续为以下免疫组织化学示例演示的染色程序 - 除了孵育应在 24 孔板的孔内进行，而不是直接在组织部分幻灯片上进行。

2. 为染色准备形式固定、石蜡嵌入部分

获得准备好的正式固定，石蜡嵌入式组织部分。

脱蜡化

将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。

补液

将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 3 分钟。
将幻灯片浸入 95% 乙醇中 3 分钟。
将幻灯片浸入 70% 乙醇中 3 分钟。
将幻灯片浸入 50% 乙醇中 3 分钟。

阻断内源性过氧化物酶活性

在室温下，在 100 mL 的 0.3% H₂O₂中孵育幻灯片 30 分钟。
用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

抗原检索

将幻灯片浸入 IHC 水酸盐缓冲液（pH 6）中，煮 20 分钟。
组织幻灯片现已准备好进行染色。

3. 制备用于染色的新鲜冷冻、OTC 内嵌部分

将 5 mm 的新鲜分离组织放入模具中，并加入 OCT，直到完全覆盖该部分。
慢慢地将组织块浸入液氮中，直到完全冻结。样品现在可以在-80°C下储存长达1年。
一旦准备切片，将冷冻组织块转移到冷冻，并允许整个设置达到-20°C。
使用低温切割 5-10 μm 厚的组织部分，并使用刷子将截面直接放置在 IHC 兼容玻璃玻片上。
让滑梯在室温下过夜干燥。幻灯片也可以存储在-80°C。
在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 4% PFA 中 15 分钟，在染色前固定幻灯片。最佳固定方法应由用户确定。
将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 0.3% H₂O₂中 30 分钟，以阻止任何内源性过氧化物酶活动。
将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
幻灯片现已准备好进行染色。

4. 染色

使用阻隔笔用疏水屏障圈组织。

阻塞

使用移液器，放置100 μL的阻塞缓冲液（马血清在1X PBS中稀释） - 在室温下在部分上放置1小时。
使用移液器清除阻塞缓冲区。

初级抗体孵育

在室温下用100μL稀释原抗体溶液（小鼠抗人环素D1在阻断缓冲液中稀释1:100）孵育被包围的组织30分钟。
从每张幻灯片上排出原抗体，用 1X PBS 洗涤幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

二次抗体孵育

在室温下用100μL稀释的生物浸化二次抗体（生物浸化马抗小鼠IgG稀释1:200）孵育样品30分钟。
去除二级抗体，从部分中排出，用1X PBS洗涤2次，每次5分钟。

色彩开发

使用HRP进行可视化:加入100 μL的阿丁生物锡复合物（ABC）试剂，在室内温度下在暗中孵育30分钟
注意:荧光标记的抗体也可以使用适当的显微镜进行可视化。
用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。
通过在 DAB 的 100 μL 中孵育各部分，以长达 5 分钟进行开发幻灯片。
在室温下加入蒸馏水（dH₂O）5分钟，停止发育。

反染色（如果需要）

将幻灯片短暂浸入哈里斯血氧林溶液中（或0.5%甲基绿色，在0.1M醋酸钠（pH 4.2）中浸泡10分钟。
用 dH₂O 洗涤幻灯片，每次洗涤 2 分钟，冲洗掉污渍。每次 5 分钟。

脱水

将幻灯片浸入 95% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。
用纸巾把幻灯片擦干。

安装和盖玻片应用

在幻灯片中添加一滴安装介质（如有机体-柠檬安装），并在各部分上放置一个盖玻片。

微观分析

在适当的显微镜下观察染色部分进行分析。这里使用标准光学显微镜进行观察，安装数码相机进行成像。

Results

IHC 和 ICC 具有广泛的应用。例如，IHC的一个用途是检查肿瘤发育的自发小鼠模型中肿瘤基因的表达。在图2中，我们着手确定在淋巴瘤发育的自发小鼠模型中，在扩大的脾脏中是否增加了环素D1表达。脾脏组织样本固定在副甲醛中，嵌入石蜡中，分片，使用抗环素D1抗体染色（在阻断缓冲液中稀释1:200），然后以20倍放大倍率对各部分进行成像。Cyclin D1 表达细胞在蓝色组织背景上由红褐色表示。这些结果表明，在扩大的脾脏中循环D1表达增加，表明该模型中癌症发育与环素D1表达的相关性。

图2:淋巴瘤自发双转基因（DTG）小鼠模型中的斯普莱辛环素D1表达。用抗Cyclin D1原抗体染色的脾脏组织图像，用甲基绿色反染，并使用生物素化二级抗体和用DAB基质激活的ABC试剂进行可视化。红褐色表示抗体结合的位置，指示在已反染为蓝色的脾组织结构内表达肿瘤细胞的Cyclin D1的存在。请点击此处查看此图的较大版本。

Application and Summary

免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）是使用抗体可视化特定抗原的表达和定位的技术。组织首先被切成薄部分，保持组织形态，并放置在幻灯片上。然后添加抗体，将感兴趣的抗原结合，并配备一个特定的标记，允许它们在显微镜下可视化。因此，通过这个基本概念，可以可视化和研究抗原在组织结构背景下的分布。然而，虽然总体概念是基本的，但已经发展了多种不同的方法和变体，增加了这些技术的复杂性和实用性。本文涵盖了IHC和ICC的基本概念、使用这些技术时需要考虑的主要决定以及详细的分步协议。IHC 和 ICC 生成的图像通常是最终产品，可以作为强调不同条件下染色量或分布的明显差异而发布。

References

Coons, A. H. Creech, H. J., Jones, N. and Berliner, E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 45 (3), 159-170 (1942).
Ripoli, F. L., Mohr, A., Hammer, S. C., Willenbrock, S., Hewicker-Trautwein, M., Hennecke, S., Escobar, H. M. and Nolte, I. A comparison of fresh frozen vs. Formalin-fixed, paraffin-embedded specimens of canine mammary tumors via branched-DNA assay. International Journal of Molecular Sciences, 17 (5) (2016).

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1. 免疫细胞化学细胞的制备

通过在24孔培养板的孔中加入0.5 mL的细胞悬浮液，将感兴趣的种子细胞添加到室片或室盖上。
注意:有些细胞可能需要在经过处理的盖玻片上生长，例如用多莱塞处理的盖玻片。最佳治疗条件应由用户根据所使用的细胞类型确定。
将板放入加_湿CO2培养箱中，让细胞在37°C生长，直到50-70%汇合。
一旦细胞达到最佳汇合，从每个孔中取出培养培养物，然后，通过在0.5 mL的4%PFA（在1X PBS中稀释）孵育细胞，并在室温下孵育20分钟，从而修复细胞。
用 1 mL 1X PBS 去除固定剂并清洗水井三次。
接下来，通过在1X PBS中加入0.5 mL 0.1%的Triton-X-100到每个井中，并在室温下孵育15分钟，从而渗透细胞。
吸气缓冲液，用 1x PBS 的 1 mL 洗井三次。
盖玻上的细胞现在被固定和渗透。继续为以下免疫组织化学示例演示的染色程序 - 除了孵育应在 24 孔板的孔内进行，而不是直接在组织部分幻灯片上进行。

2. 为染色准备形式固定、石蜡嵌入部分

获得准备好的正式固定，石蜡嵌入式组织部分。

脱蜡化

将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。

补液

将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 3 分钟。
将幻灯片浸入 95% 乙醇中 3 分钟。
将幻灯片浸入 70% 乙醇中 3 分钟。
将幻灯片浸入 50% 乙醇中 3 分钟。

阻断内源性过氧化物酶活性

在室温下，在 100 mL 的 0.3% H₂O₂中孵育幻灯片 30 分钟。
用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

抗原检索

将幻灯片浸入 IHC 水酸盐缓冲液（pH 6）中，煮 20 分钟。
组织幻灯片现已准备好进行染色。

3. 制备用于染色的新鲜冷冻、OTC 内嵌部分

将 5 mm 的新鲜分离组织放入模具中，并加入 OCT，直到完全覆盖该部分。
慢慢地将组织块浸入液氮中，直到完全冻结。样品现在可以在-80°C下储存长达1年。
一旦准备切片，将冷冻组织块转移到冷冻，并允许整个设置达到-20°C。
使用低温切割 5-10 μm 厚的组织部分，并使用刷子将截面直接放置在 IHC 兼容玻璃玻片上。
让滑梯在室温下过夜干燥。幻灯片也可以存储在-80°C。
在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 4% PFA 中 15 分钟，在染色前固定幻灯片。最佳固定方法应由用户确定。
将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
在室温下将幻灯片浸入 250 mL 的 0.3% H₂O₂中 30 分钟，以阻止任何内源性过氧化物酶活动。
将幻灯片浸入 250 mL 的 1X PBS 2 次，每次 5 分钟。
幻灯片现已准备好进行染色。

4. 染色

使用阻隔笔用疏水屏障圈组织。

阻塞

使用移液器，放置100 μL的阻塞缓冲液（马血清在1X PBS中稀释） - 在室温下在部分上放置1小时。
使用移液器清除阻塞缓冲区。

初级抗体孵育

在室温下用100μL稀释原抗体溶液（小鼠抗人环素D1在阻断缓冲液中稀释1:100）孵育被包围的组织30分钟。
从每张幻灯片上排出原抗体，用 1X PBS 洗涤幻灯片 2 次，每次 5 分钟。

二次抗体孵育

在室温下用100μL稀释的生物浸化二次抗体（生物浸化马抗小鼠IgG稀释1:200）孵育样品30分钟。
去除二级抗体，从部分中排出，用1X PBS洗涤2次，每次5分钟。

色彩开发

使用HRP进行可视化:加入100 μL的阿丁生物锡复合物（ABC）试剂，在室内温度下在暗中孵育30分钟
注意:荧光标记的抗体也可以使用适当的显微镜进行可视化。
用 1X PBS 清洗幻灯片 2 次，每次 5 分钟。
通过在 DAB 的 100 μL 中孵育各部分，以长达 5 分钟进行开发幻灯片。
在室温下加入蒸馏水（dH₂O）5分钟，停止发育。

反染色（如果需要）

将幻灯片短暂浸入哈里斯血氧林溶液中（或0.5%甲基绿色，在0.1M醋酸钠（pH 4.2）中浸泡10分钟。
用 dH₂O 洗涤幻灯片，每次洗涤 2 分钟，冲洗掉污渍。每次 5 分钟。

脱水

将幻灯片浸入 95% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
将幻灯片浸入 100% 乙醇中 2 次，每次 5 分钟。
将幻灯片浸入 100% 二甲苯中 2 次，每次 5 分钟。
用纸巾把幻灯片擦干。

安装和盖玻片应用

在幻灯片中添加一滴安装介质（如有机体-柠檬安装），并在各部分上放置一个盖玻片。

微观分析

在适当的显微镜下观察染色部分进行分析。这里使用标准光学显微镜进行观察，安装数码相机进行成像。

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0:01

Concepts

3:39

Preparation of Cells for Immunocytochemistry

6:20

Preparation of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Sections for Staining

8:11

Staining

12:11

Results

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