Espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR)

Fonte: David C. Powers, Tamara M. Powers, Texas A&M

Neste vídeo, aprenderemos os princípios básicos por trás da Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR). Usaremos espectroscopia EPR para estudar como o tolueno dibutylhydroxy (BHT) se comporta como um antioxidante na autoxidação de aldeídos alifáticos.

Fundamentos da EPR:

EPR é uma técnica espectroscópica que se baseia em fenômenos físicos semelhantes como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Enquanto a RMN mede as transições de spin nuclear, a EPR mede as transições de spin de elétrons. O EPR é usado principalmente para estudar moléculas paramagnéticas, que são moléculas com elétrons não analisados. Lembre-se que um elétron tem um número quântico de spin, s = 1/2, que tem componentes magnéticos m_s = 1/2 e m_s = -1/2. Na ausência de um campo magnético, a energia dos dois estados_{m s} são equivalentes. No entanto, na presença de um campo magnético aplicado(B_0),o momento magnético do elétron se alinha com o campo magnético aplicado e, como resultado, os estados m_s tornam-se não-degenerados(Figura 1). A diferença de energia entre o estado _{m s} depende da força do campo magnético(Equação 1). Isso é chamado de efeito Zeeman.

E = m₂g_eμ_{BB 0}     (Equação 1)

onde g_e é o fator g,que é 2.0023 para um elétron livre e μ_B é o ímã bohr.

Em um determinado campo magnético, B₀, a diferença de energia entre os dois estados_{m s} é dada pela Equação 2.

ΔE = E_1/2 — E_-1/2 = g_eμ_{BB 0} = hυ (Equação 2)

Um elétron se move entre os dois estados_apósa emissão ou absorção de um fóton com energia ΔE =hυ. Equação 2 se aplica a um único elétron livre. No entanto, semelhante à forma como a mudança química em ¹H NMR depende do ambiente químico do átomo de H, os elétrons dentro das moléculas não se comportam da mesma forma que um elétron isolado. O gradiente de campo elétrico da molécula influenciará o campo magnético eficaz, dado pela Equação 3.

B_eff = B₀(1   — σ) (Equação 3)

onde σ é o efeito dos campos locais, que podem ser um valor positivo ou negativo.

Conectando a Equação 3 na Equação 2,podemos definir o fator gpara um elétron não pago em uma determinada molécula como g = g_e(1 - σ), o que simplifica a equação geral para:

hυ = gμ_{BB 0}(Equação 4)

Durante o experimento EPR, a frequência é varrida, mais comumente na região do micro-ondas variando de 9.000-10.000 MHz, e o campo é mantido constante em aproximadamente 0,35 T, permitindo o cálculo de g. Experimentalmente determinando g usando EPR fornece informações sobre a estrutura eletrônica de uma molécula paramagnética.

Figura 1. Divisão de estados de momento magnético, m_s,na presença de um campo magnético.

Aplicação do EPR:

Neste experimento, usaremos espectroscopia de EPR para investigar a química dos antioxidantes. O₂, que compreende ~ 21% da atmosfera da Terra, é um forte oxidante. Apesar de seu potencial de agir como um oxidante, O₂ é um trigêmeo de estado terrestre e, portanto, só reage muito lentamente com a maioria das moléculas orgânicas. Uma reação importante, embora muitas vezes indesejada, mediada por O₂ é a autoxidação. Na química da autoxidação, O₂ inicia processos radicais em cadeia, que podem consumir rapidamente moléculas orgânicas. A Figura 2 ilustra uma autoxidação comum, na qual os aldeídos são oxidados a ácidos carboxílicos.

Prevenir a química da autoxidação é importante para evitar a decomposição de muitos materiais orgânicos comuns, como plásticos, e um grande campo se desenvolveu em torno da identificação de antioxidantes eficazes para inibir a autoxidação. Um mecanismo pelo qual os antioxidantes podem funcionar é reagindo com os intermediários radicais para inibir processos radicais em cadeia. Como espécies radicais têm spins não pagos, a EPR é uma ferramenta valiosa para entender a química dos antioxidantes. Neste experimento, usaremos espectroscopia EPR para explorar o papel do BHT como um antioxidante na autoxidação de aldeídos alifáticos.

Figura 2. A autoxida de aldeído prossegue através de um mecanismo de cadeia radical.

1. Autoxidação de Butyraldeído

1. Prepare uma solução de butiradeído (100 mgs) e CoCl₂·6H₂O (1 mg) em 1,2-dicloroetano (DCE) (4 mL) em um frasco de cintilação de 20 mL. Adicione uma barra de meximento magnética e encaixe o frasco com um septo de borracha.
2. Conecte o barril de uma seringa de plástico de 1 mL a um pequeno pedaço de tubo de borracha. Insira a tubulação de borracha em um balão de látex e fixe o balão no tubo com um elástico e fita elétrica. Infle um balão de látex com O₂.
3. Insira a agulha do balão O₂ no frasco de reação. Insira uma segunda agulha no septo e purgue o espaço da cabeça do vaso de reação com O₂.
4. Usando uma placa de mexida, mexa a reação à temperatura ambiente por 4h sob uma atmosfera O_2.
5. Concentre a mistura de reação usando um evaporador rotativo e tome um espectro de ¹H NMR do resíduo oleoso resultante no CDCl₃.

2. Usando BHT como antioxidante para a autoxidação de Butyraldeído

Configure dois frascos como descrito abaixo. Um será usado para analisar a distribuição do produto e outro será usado na etapa 3 para espectroscopia EPR.

1. Prepare uma solução de butildeído (100 mgs) e CoCl₂·6H₂O (1 mg) em DCE (4 mL) em um frasco de cintilação de 20 mL. Adicione BHT (10 mg) à solução. Adicione uma barra de meximento magnética e encaixe o frasco com um septo de borracha.
2. Conecte o barril de uma seringa de plástico de 1 mL a um pequeno pedaço de tubo de borracha. Insira a tubulação de borracha em um balão de látex e fixe o balão no tubo com um elástico e fita elétrica. Infle um balão de látex com O₂.
3. Insira a agulha do balão O₂ no frasco de reação. Insira uma segunda agulha no septo e purgue o espaço da cabeça do vaso de reação com O₂.
4. Usando uma placa de mexida, mexa a reação à temperatura ambiente por 4h sob uma atmosfera O_2.
5. Concentre a mistura de reação usando um evaporador rotativo e tome um espectro de ¹H NMR do resíduo oleoso resultante no CDCl₃.

3. Medindo os espectros de EPR

1. Ligue o espectrômetro EPR e deixe o instrumento aquecer por 30 minutos. Configure uma aquisição de EPR com os seguintes parâmetros: campo central 3.345 G, largura de varredura 100 G, tempo de varredura 55 s, tempo constante de 10 ms, potência MW 5 mW, modulação de 100 kHz e amplitude de modulação 1 G.
2. Meça um espectro EPR de um tubo EPR vazio para garantir que não haja sinais de fundo do tubo EPR ou do ressonador de instrumentos.
3. Prepare uma solução de BHT em DCE em um porta-luvas n_2. Transfira 0,5 mL da solução para um tubo de EPR e meça o espectro EPR da BHT utilizando os parâmetros de aquisição estabelecidos na etapa 3.1.
4. Transfira 0,5 mL da solução de reação adicionada bht da Etapa 2 para um tubo EPR e adquira e espectro EPR utilizando os parâmetros de aquisição estabelecidos na Etapa 3.1.

A autoxidação de butyraldeído proporciona ácido butírico. O espectro de ¹H NMR obtido a partir da reação realizada no Passo 1 mostra a falta de uma ressonância C-H aldeídica e a presença das ressonâncias esperadas do ácido butírico. Em contraste, a RMN obtida a partir da mistura de reação da etapa 2 (com BHT adicionado) exibe sinais consistentes com butyraldeído, sem ácido butírico presente. A partir desses dados, observamos que o butyraldeído serviu como um antioxidante na autoxida de aldeído.

O papel do BHT na inibição da autoxida de aldeído é iluminado pelos espectros de EPR obtidos de BHT e de BHT adicionados à reação de autoxidato de aldeído. BHT é uma molécula orgânica diamagnética, o que significa que não há elétrons não pagos. Assim, o espectro EPR do BHT não exibe sinais. Em contraste, o espectro EPR da reação de autoxidação na qual o BHT foi adicionado exibe um forte padrão de quatro forrados, consistente com um radical orgânico. Esse espectro surge porque a ligação O-H da BHT é fraca e na presença de radicais gerados durante a autoxidação, a transferência de átomos de H a partir do BHT sacia o mecanismo de cadeia radical e gera um radical estável centrado em O.

Neste experimento, exploramos o papel dos antioxidantes na inibição da química da autoxidação. Sondamos o mecanismo de inibição usando espectroscopia de EPR, que revelou que o BHT serve como um antioxidante, saciando intermediários radicais reativos via transferência de átomos de H.

Moléculas com elétrons não ressarciantes podem ser desafiadoras para caracterizar por NMR e, portanto, a espectroscopia EPR frequentemente fornece informações úteis e complementares sobre essas espécies. A espectroscopia de EPR é uma técnica experimental que é frequentemente usada para detectar e caracterizar radicais orgânicos. Além disso, complexos inorgânicos paramagnéticos também exibem frequentemente espectros de EPR que podem ser instrutivos para caracterização. Espectros experimentais de EPR delineiam o fator gdo elétron não perdurado, que fornece informações sobre a estrutura eletrônica do centro paramagnético. Além disso, os giros nucleares dos núcleos com um elétron não verificado, bem como núcleos vizinhos também influenciam o momento magnético de um elétron, dando origem à divisão adicional dos estados m_s e múltiplas linhas no espectro EPR. O acoplamento hiperfine e super-hiperfino resultante fornece mais informações sobre a estrutura eletrônica da molécula.

Além de caracterizar espécies orgânicas e inorgânicas de casca aberta, a sensibilidade requintada da espectroscopia de EPR é fundamental para a aplicação a sistemas bioinorgânicos, onde a concentração de cofatores metálicos é baixa. Os espectros EPR são rotineiramente usados em química bioinorgânica para fornecer informações diretas sobre as estruturas e estados de oxidação de íons metálicos no coração das enzimas.