腹部大動脈瘤の近赤外蛍光イメージング

出典:アービン・H・ソエプリアートナ^1、ケルシー・A・ブレンス^2、クレイグ・J・ゲーゲン¹

¹インディアナ州パデュー大学、ウェストラファイエット大学ウェルドンバイオメディカルエンジニアリングスクール

²インディアナ州ウェストラファイエット校パデュー大学生化学科

近赤外蛍光(NIRF)イメージングは、蛍光プローブを利用して組織の複雑な生体分子アセンブリを可視化するエキサイティングな光学技術です。NIRFイメージングは、疾患の非侵襲的イメージングのための従来のイメージング方法に対して多くの利点を有する。単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)や陽電子放射断層撮影(PET)とは異なり、NIRFイメージングは高速で高スループットであり、電離放射線を伴いません。さらに、工学的標的特異的および活性化可能な蛍光プローブの最近の発展は、NIRFに高い特異性と感度を提供し、癌および心血管疾患の研究において魅力的なモダリティとなっています。提示された手順は、NIRFイメージングの背後にある原理と、様々な疾患を研究するために、小動物の生体内およびex vivo実験を行う方法を実証するように設計されています。ここに示す具体例は、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP2)の活性化可能な蛍光プローブを用いて、腹部大動脈瘤(AAA)の2つの異なるげっ歯類モデルにおける取り込みを研究する。

名前が示すように、NIRFイメージングは、650 nmから900 nmまでの最初の近赤外窓内の光を利用して、フォトンを組織に送り込みます。フォトンのエネルギーEは式1が特徴で、hはプランクの定数、cは真空中の光の速度、λは光の波長です。

= (式 1)

蛍光色素と呼ばれる標的特異的蛍光分子は、通常、遺伝子工学を介して、またはイメージングの前に尾静脈注射を介して動物に導入される。これらの蛍光体は光子エネルギーを吸収し、これは分子のエネルギーを接地状態_S0から不安定で励起状態_S1'に上昇させる。S_1'状態の不安定性のために、分子はその状態内で最も低い振動エネルギーレベルにリラックスし、熱の形でエネルギーを放出します。蛍光色素は、現在、緩和された励起状態_S1で、次いで、特定の波長で発光する接地状態_S0に戻る。熱の形でエネルギーの放散のために長い波長を有する放出された光は、蛍光イメージングシステムを使用して捕捉され、記録される。吸収スペクトルと発光スペクトルの基本的なシフトはストークスシフトと呼ばれ、励起光と発光光を区別できるため重要です。

次の手順では、小動物から生体内およびex vivo NIRF画像を収集するために必要な詳細な手順を示します。

1.実験的なセットアップ

1. 光ファイバ光源を光ファイバ光ガイドを使用して蛍光イメージングシステムに接続します。
2. 実験に適した励起フィルタを選択します。励起フィルタは、サンプルに送達される光の波長を決定し、サンプルに導入された蛍光色素の励起スペクトルと一致するように選択する必要があります。
3. 適切な放出フィルタを選択します。発光フィルタは、自己蛍光に起因する可能性のある望ましくないスペクトル成分をブロックし、蛍光体の発光スペクトルに一致するように選択する必要があります。

2. サンプル調製

1. イン・ヴィヴォ
   1. 流量計ダイヤルで3〜4%の濃度でイソフルランを使用して誘導室内で動物を麻酔する。
   2. イメージング段階で固定された鼻コーンに動物を移し、1〜2%の濃度でアイソフルランを維持する。動物は通常短期間(>5分)しか画像化されず、体温が実質的に低下しないため、熱源は必要ありません。
   3. モーションアーティファクトを最小限に抑えるために、動物の足を固定します。脱毛クリームを塗ることによって、対象の領域から髪を削除します。
   4. 必要な最小領域に脱毛クリームを塗布します。30sの後、ガーゼパッドで拭き取り、エチルアルコール湿ったガーゼパッドでもう一度領域を拭き取り、脱毛クリームを完全に除去します。
   5. 角膜の乾燥を防ぐために眼に眼軟膏を塗布する。
   6. 活性化可能な蛍光分子プローブを動物に注入する。この特定のアプリケーションについて、MMP2活性化可能なプローブを尾静脈に静脈内に注入した。この時点で、マウスをイメージできます。続行するには、このプロトコルの「イメージの取り付け」に進みます。短い手順を通して定期的な呼吸のために動物を監視します。
2. Ex Vivo
   1. 蛍光プローブの注入後、動物の安楽死のための2013 AVMAガイドラインに従って、人道的な方法で動物を安楽死させる。二酸化炭素_(CO2)過剰摂取は、小動物を安楽死させる標準的な習慣である。
   2. 外科的に目的の組織または器官を抽出し、鉗子で余分な脂肪組織を慎重に除去する。
   3. リン酸緩衝生理食塩水で組織をすすいで残りの血液を除去し、サンプルをイメージング段階に直接置きます。

3. 画像取得

1. 分子イメージングソフトウェアを開き、光ファイバ光源と蛍光イメージングシステムの両方をオンにします。
2. 集録ウィンドウを開き、スタディに適した露出のタイプを指定します。利用可能な露出には、単一の画像をキャプチャするための標準露出、一定の時間間隔で一連の画像をキャプチャするTime Lapse Exposure、異なる露光時間で連続した露出をキャプチャするプログレッシブ露出などがあります。
3. イルミネーション ソースとしてUV トランスイルミネーションを選択します。
4. プレビューされた画像を参照として使用して、レンズの焦点、視野、およびキャプチャシステムチャンバー内のfストップ/絞りを調整して、サンプリングされた画質を最適化します。サンプルの露光時間と位置を調整します。
5. プレビュー ウィンドウを閉じ、取得ウィンドウのすべてのパラメータがカメラとフィルタの設定と一致していることを確認します。
6. [公開] をクリックして、イメージを取得して保存します。
7. 標準的な分子イメージングソフトウェアは、通常、画像解析用の蛍光信号を定量化するためのさまざまな分析、測定、および画像補正ツールを提供します。
8. イメージングセッションの最後に、サンプル/動物を取り外し、システムの電源を切り、イメージングステージを清掃してシステムへのダメージを最小限に抑えます。

腹部大動脈瘤(AAA)を有するげっ歯類から撮影した生体内およびex vivo NIRF画像の代表を図1-2に示す。活性化可能な蛍光プローブを尾静脈を介して全身的に注入し、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP2)活性を可視化した。MMP2は、AAAの開始および進行に大きな役割を果たす細胞外マトリックスの分解に関与するエラストリスティック酵素である。すべての画像は、625 nm励起フィルタ、700 nm発光フィルタ、および60秒露光時間を用いて取得した。

図1:アンジオテンシンIIの注入後にAAAを発症したアポリポタンパク質E欠損マウスの生体内NIRF画像の代表者。高いシグナルを示す小さな斑点のほとんどは、皮膚の自己蛍光(黄色の矢印)からのものである。血管系は、高い蛍光シグナル(赤い矢印)を有する管状構造として可視化することができる。スケールバー:1センチメートル。

図2は、腹部大動脈の健康領域に対するシグナル強度の観察された増加によって見られる腹部大動脈の動脈瘤領域におけるMMP2活性の増加を示す。この結果は、AAA 内の MMP2 レベルの上昇を示す文献の結果と一致します。過剰な蛍光プローブを濾過し、腎臓に蓄積し、明るい蛍光シグナルを導いた。

図2: 2つの異なる動物モデルからのAAAのNIRF画像:(A)アンジオテンシンII注入アポリポプロテイン-E欠損マウスにおける副腎AAAと(B)豚膵臓エラスターゼを注入したラットにおけるインフラレナルAAA黄色の矢印は AAA を指します。スケールバー:3ミリメートル。

NIRFイメージングは、蛍光プローブに依存して、組織内の生体分子アセンブリを定量化し、可視化します。近赤外光から吸収された光子エネルギーは蛍光分子をより高いエネルギー状態に励起し、より長い特性波長の発光光を蛍光イメージングシステムによって捕捉します。ここで、腹部大動脈瘤におけるMMP2活性を研究するNIRFイメージングの応用は、生体内およびex vivoにおいて実証された。体内の代謝過程を非侵襲的に研究する際の金本位と考えられているSPECTやPETとは異なり、NIRFイメージングは放射線のイオン化を伴わない迅速かつ高スループットのイメージング技術です。このモダリティの制限の1つは、比較的小さな浸透深さです。この制限は、深い組織の臨床イメージングを困難にしますが、NIRFイメージングは、小動物の腫瘍および心血管疾患を研究する重要な役割を果たしています。

適切な蛍光プローブを考えると、提示されたNIRFイメージング手順を用いて多くの分子構造を可視化し、小動物モデルにおける疾患の開始と進行の両方を研究することができる。特定のex vivoおよびin vivoアプリケーションには、1)げっ歯類血管におけるMMP活性の評価、2)異なるタイプの癌における早期腫瘍検出、および3)ナノ粒子薬物動態および治療用途のためのバイオ分布の評価が含まれる。AAA内のMMP2活性の増加に加えて、他のMMP蛍光プローブは、アテローム性動脈硬化症の進行を研究し、心筋梗塞後の心臓細胞外マトリックス組成物を特徴付けるために利用されている。さらに、フルオロフォアインドシアニングリーンは、後肢虚血のマウスモデルにおける組織灌流を研究するために使用されている。早期がん検出におけるNIRFイメージングの応用について詳しく説明するために、腫瘍標的性NIRF染料を使用して腫瘍のマージンを評価し、切除手順を支援することができます。近赤外線蛍光色素を薬物送達用に開発したナノ粒子に統合することで、科学者は様々な疾患に対してより効果的なナノ粒子ベースの治療薬を開発することができます。最後に、動物全体または無傷の組織における蛍光シグナルを空間的に局在させる能力は、動物を犠牲にして組織を均質化する必要がある他の従来の酵素アッセイ(ゲルザイモグラフィー)およびタンパク質分析(ウェスタンブロット)に対して明らかな利点です。