Triagem de campos de lentilha para presença de murcha de Fusarium e podridão radicular na Turquia sob clima terrestre

Um estudo na província de Yozgat descobriu que fatores bióticos, como doenças fúngicas como murcha e podridão radicular, limitam a produção de lentilhas. Isolados de Fusarium foram encontrados em 95,4% das amostras, sugerindo levantamentos locais periódicos e monitoramento regular para desenvolvimento de tecnologia sustentável e estratégias de controle eficazes.

A lentilha é uma importante leguminosa autopolinizada. Sua produção é limitada por vários fatores bióticos, especialmente agentes fúngicos causadores do complexo murcha e podridão radicular. O estudo teve como objetivo compreender a epidemiologia regional e a etiologia dos agentes fúngicos fitopatogênicos para desenvolver estratégias de controle contra Fusarium spp. Este estudo investigou 83 localidades de semeadura de lentilhas na província de Yozgat para doenças de murcha, podridão radicular e da coroa causadas por espécies comuns de Fusarium durante 2022 e 2023. Plantas de lentilha sintomáticas foram coletadas para isolamento e identificação de fungos. Os isolados de Fusarium foram agrupados de acordo com a morfologia da colônia e cultivados em meio BDA. Além disso, os DNAs genômicos obtidos de isolados de Fusarium foram analisados por PCR e comparados com outros isolados de Fusarium registrados no NCBI GenBank. As relações genéticas entre os isolados de Fusarium foram determinadas usando o método de Parcimônia Máxima (MP) no programa Mega 11. Os resultados, a incidência média e a taxa de severidade das doenças da murcha e da podridão radicular na província de Yozgat foram determinados em 16,9% e 38,6%, respectivamente. Isolados de Fusarium foram encontrados em 95,4% das amostras. Houve homogeneidade de 99,5% a 100% da sequência de nucleotídeos entre os isolados de F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum e F. solani , sendo que a espécie mais isolada foi F. oxysporum. O dendrograma MP dos isolados de Fusarium foi dividido em dois ramos principais, o primeiro ramo incluiu todos os isolados de F. solani . O segundo ramo principal incluiu outras espécies de Fusarium isoladas no presente estudo e no NCBI GenBank. O estudo sugere pesquisas locais periódicas para determinar a frequência da murcha de Fusarium para supressão em lentilhas. A supressão oportuna dos danos à base de Fusarium é fortemente sugerida para controlar a doença e conservar o sistema de produção de lentilhas.

A lentilha (Lens culinaris Medik.), Uma pequena leguminosa de grão comestível pertencente à família Fabaceae, é uma cultura autopolinizadora de estação fria com folhas em forma de agulha e flores brancas a roxas pálidas ou roxas escuras¹. Foi domesticado por humanos há cerca de 10.000 anos na parte mesopotâmica do Crescente Fértil e rapidamente se espalhou para o Novo Mundo, incluindo a Bacia do Mediterrâneo e a Ásia Central, e mais tarde foi naturalizado para as Américas². A área mundial de cultivo de lentilha é de cerca de 5,5 milhões de hectares, com produção de 6,6 milhões de toneladas³. A Turquia ocupa o^4º lugar na produção de lentilhas, depois do Canadá, Índia e Austrália. O cultivo de lentilha na Turquia é muito importante e representa 6,7% da produção mundial. A produção total de lentilhas da Turquia é de 474.000 toneladas e é produzida em pelo menos 40 províncias⁴. Cerca de 89,5% da produção de lentilhas da Turquia são lentilhas vermelhas e verdes, que constituem 10,5% da safra de inverno na região sudeste da Anatólia. O resto da safra é cultivado como safras de verão. As províncias de Yozgat (39,5%), Konya (23,7%), Kırşehir (16,3%), Çorum (7,6%) e Ancara (2,9%) contribuem amplamente para a produção de lentilhas verdes⁴. A produção de lentilhas pode ser limitada por fatores de estresse bióticos e abióticos. Geada e seca são os fatores de estresse abiótico mais comuns na produção de lentilha verde no verão⁵. Doenças fúngicas como murcha, raiz e complexo de podridão da coroa causadas por Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium e espécies de Fusarium são as doenças fúngicas mais importantes, que causam uma combinação de doenças, incluindo tombamento, ferrugem das plântulas, murcha e podridão radicular, dependendo do momento da infecção, suscetibilidade do hospedeiro e condições meteorológicas ^{6,7, 8}.

Fusarium é um fungo filamentoso imperfeito encontrado no solo, plantas e substratos orgânicos e é um gênero cosmopolita entre esses patógenos⁹. Causa várias doenças, como murcha de Fusarium, podridão da raiz e do colo da raiz, bem como ferrugem da cabeça de Fusarium no trigo, murcha de Fusarium em cucurbitáceas e podridão radicular na maioria das leguminosas, incluindo lentilhas 10,11,12. A murcha vascular, a podridão da raiz e do colo radicular causada por Fusarium spp. é a doença mais importante das lentilhas em muitas áreas de cultivo de lentilhas em todo o mundo¹⁰. Fusarium oxysporum é a espécie mais comum de Fusarium associada à murcha, raiz e podridão do colo da raiz em lentilhas. Globalmente, as doenças da murcha, da raiz e da podridão da coroa são causadas por F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani e F. verticillioides em áreas de plantio de lentilhas⁷. As doenças da murcha, podridão radicular e da coroa causadas por Fusarium spp. ocorrem nos estágios de plântula e adulto e causam murcha súbita, ressecamento e eventual morte das folhas. Os sintomas da doença incluem podridão das sementes, podridão da raiz, murcha dos folíolos superiores, nanismo, encolhimento e enrolamento das folhas. Nos estágios intermediário e tardio de enchimento das vagens, as sementes geralmente são encolhidas e os sintomas das raízes incluem crescimento atrofiado, descoloração marrom, pontas das raízes principais danificadas e proliferação de raízes secundárias. A descoloração do tecido vascular pode não ser observada em todos os casos¹³.

Na região da Anatólia Central, estudos sobre o status das doenças da murcha e da podridão radicular nas lentilhas foram realizados em número limitado. Yozgat tem um clima ameno e moderado com chuvas abundantes no inverno quando comparado ao verão e é classificado como Dsb (clima terrestre quente e úmido) pela Köppen e Geiger¹⁴. A temperatura média é de 9,6 °C, com uma precipitação média de 512 mm. Yozgat está localizada no hemisfério norte. O verão ocorre em junho, julho, agosto e setembro. É muito importante ter informações sobre a epidemiologia regional e a etiologia dos agentes fúngicos fitopatogênicos causadores da doença para o desenvolvimento de diferentes estratégias de controle contra Fusarium spp. transmitidas pelo solo, para controlar a doença¹⁵. Nesse contexto, os objetivos do presente estudo são determinar e identificar os parâmetros da doença (prevalência, incidência e severidade da doença) das doenças da murcha, da raiz e da podridão da coroa em lentilhas, realizando um levantamento na província de Yozgat, onde aproximadamente 40% da produção total de lentilha verde é feita isoladamente, o patogênico Fusarium espécies que causam murcha e podridão radicular em lentilhas por meio de análises morfológicas e moleculares, e para determinar os níveis de virulência individuais das espécies de Fusarium por meio da realização de testes de patogenicidade.

NOTA: Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Pesquisa de campo, amostragem e isolamento de fungos

NOTA: O trabalho de levantamento foi realizado em 2022 e 2023, de acordo com o Endes¹⁶. Um total de 83 áreas de plantio de lentilha cobrindo nove distritos na província de Yozgat foram observadas para murcha, raiz e podridão do colo radicular (Figura 1).

1. Selecione campos de lentilha com mais de 1000 m² de área como área de amostragem. Colete cada amostra caminhando aleatoriamente da borda para o centro ou meio do campo em ziguezagues caminhando ao longo das diagonais usando um quadro de 1 m² , colocando-o aleatoriamente em um mínimo de três pontos diferentes selecionados aleatoriamente. Colete plantas de lentilha que apresentem sintomas de doenças em cada ponto, coloque-as em sacos de papel e transfira-as para o laboratório para uso em estudos de isolamento e identificação de fungos.
   NOTA: As raízes e colos radiculares de plantas de lentilha doentes transferidas para o laboratório foram primeiro lavadas com água da torneira para se livrar dos resíduos grosseiros; posteriormente, foram submetidos à desinfecção de superfície para o isolamento dos patógenos fúngicos, conforme descrito por Endes¹⁶.
2. Mergulhe os tecidos vegetais doentes em etanol a 70% por 10-15 s e depois enxágue 3x por 3 minutos cada em água estéril. Segure todos eles em hipoclorito de sódio a 1% (NaOCl) por 5 min e enxágue 3x por 5 min cada novamente com água estéril.
3. Seque os tecidos vegetais úmidos em papéis de filtro em um gabinete estéril para finalizar o processo de desinfecção da superfície. Em seguida, corte os tecidos vegetais desinfetados em pedaços de 5-10 mm de comprimento e coloque 4-5 pedaços em um meio de BDA contendo 0,01% de estreptomicina em placas de Petri (90 mm de diâmetro). Coloque as placas de Petri em uma incubadora no escuro a 25 ± 1 °C por 4-7 dias e observe o crescimento do fungo.
   NOTA: Os isolados de fungos em desenvolvimento foram purificados através do método de isolamento de esporos únicos. Para tanto, o estudo realizado por Choi et ^al.17 sobre a obtenção de culturas de esporos únicos de fungos pertencentes a Ascomicetes, Basidiomicetos, Celomicetos e Hyphomycetes foi modificado e utilizado conforme descrito a seguir.
4. Para purificar os isolados de fungos, manter os isolados de fungos obtidos no final dos estudos de isolamento numa incubadora a 25 ± 1 °C durante 12 h de luz fluorescente / 12 h de escuridão durante 15 dias para favorecer a formação de estruturas anamórficas de reprodução no PCA.
5. Pese cerca de 100 mg de micélio de fungo de culturas de 15 dias com uma espátula, transfira-o para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL e, em seguida, triture-o completamente com pilões de plástico estéreis para homogeneização.
6. Adicione 1 mL de água estéril e vórtice por 1 min para garantir a transferência de esporos para a água. Para ajustar o número de esporos transferidos para a água, extraia 20 μL dessa mistura com uma pipeta e verifique o número de esporos com ampliação de 10x do microscópio óptico.
7. Quando a quantidade de esporos for maior do que a quantidade desejada, dilua a mistura de esporos e água em proporções como 1/10, 1/100 e 1/1000. Forneça uma mistura contendo 4-6 esporos no campo de visão do microscópio.
8. Pegue 100 μL da suspensão de esporos preparada e transfira-a para placas de Petri de 90 mm de diâmetro contendo meio BDA suplementado com estreptomicina a 0,1%. Em seguida, espalhe a suspensão transferida no PDA com uma espátula Drigalski.
9. Incubar as placas de Petri preparadas no escuro a 25 ± 1 °C durante 12-24 h. No final deste período, transferir pequenos pedaços de hifas desenvolvidos de um único conídio com uma alça de inoculação para uma nova placa de Petri contendo meio BDA. Cada cultura obtida de cada esporo é uma única cultura de esporos. Armazene-os para serem usados em testes de patogenicidade e identificação morfológica e molecular.
   NOTA: O objetivo principal é manter os isolados de fungos vivos por muito tempo sem alterar sua morfologia, genética e virulência. O processo de armazenamento foi realizado por meio de dois métodos diferentes^18,19. Todos os métodos de armazenamento usados neste estudo são explicados em detalhes abaixo.
   1. O primeiro método para armazenar amostras é o seguinte. Cultivar isolados de fungos em meio BDA a 25 ± 1 °C com uma luz escura de 12:12 h durante 15 dias para obter discos de micélio de 4 mm de diâmetro que possam ser armazenados em água estéril.
   2. Corte discos de micélio (4 mm de diâmetro, 10 discos) com uma broca de cortiça de culturas fúngicas que cresceram nas condições acima mencionadas. Transfira os discos de micélio para tubos de microcentrífuga contendo 1 mL de água estéril. Manter as amostras em tubos de microcentrífuga no frigorífico a -20 °C durante 6 meses.
   3. O segundo método para armazenar amostras é o seguinte. Em primeiro lugar, pegue uma pitada do disco fúngico puro das culturas de esporos únicos obtidos com uma alça de inoculação e transfira-o para placas de Petri contendo BDA suplementado com cloranfenicol, ácido lático, ampicilina, rifampicina, tetraciclina, estreptomicina, etc.
   4. Crescer durante 5-10 dias antes do processo de armazenamento a 25 ± 1 °C com uma condição de 12 h: 12 h escura: clara. Corte e esterilize papéis de filtro de uso geral de 1 cm x 1 cm em uma autoclave a 121 °C, 15 psi por 60 min.
   5. Colocar os papéis de filtro em placas de Petri novas com o mesmo meio ou com meio selectivo. Corte colônias / esporos de cultura fúngica pura e coloque-os no topo de cada peça.
   6. Sele as placas de Petri e coloque-as em uma incubadora em condições de crescimento apropriadas (como mencionado acima). Os isolados de fungos crescem lentamente em papel de filtro. Incubar por aproximadamente 15 dias para garantir a colonização completa.
   7. Após a esporulação ou formação completa de colônias em papéis de filtro, transfira os pedaços individuais de papel para uma nova placa de Petri sem meio de cultura. Posteriormente, coloque as placas de Petri na incubadora até que o papel de filtro e o fungo estejam completamente secos (aproximadamente 20-30 dias).
   8. Após a secagem, coloque 10 pedaços de papel de filtro em cada envelope de papel estéril, etiquete cada envelope, coloque esses envelopes em sacos plásticos e guarde os sacos plásticos contendo os envelopes em um recipiente plástico e transparente a -20 °C.
10. Calcule a taxa de prevalência da murcha da lentilha, raiz e podridão da coroa em Yozgat de acordo com a fórmula abaixo, considerando a prevalência da doença em cada campo de lentilha, seguido do nome do distrito da província.
    Taxa de prevalência da doença (%) = (a / b) x 100
    onde a indica o número de campos doentes; b indica o número total de campos pesquisados em um distrito.
11. Calcular a incidência da doença de acordo com o método da média ponderada relatada por Bora e Karaca²⁰. Conte as plantas em cada quadrado do campo. Separe-os em plantas doentes e não doentes em cada quadrado e calcule a prevalência da doença de acordo com a fórmula abaixo.
    Taxa de prevalência da doença (%) = (x / y) x 100
    onde x indica o número de plantas doentes; y indica o número total de plantas pesquisadas.
12. Calcule a severidade da doença de acordo com a escala de 0 a 4 de Öğüt²¹, onde 0 = não apresentou sintomas, 1 = sintomas de nível leve em 25% das folhas; 2 = sintomas de nível moderado em 26%-50% das folhas; 3= clorose severa e murcha em 51%-75% das folhas; e 4 = clorose muito severa e sintomas de murcha ou secagem, queda, retardo de crescimento ou folhas mortas em mais de 75% das plantas na mesma ordem (Figura 2).
13. Calcule a gravidade da doença usando a seguinte fórmula com os valores de escala obtidos¹⁶.
    Gravidade da doença (%) = [∑ [i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    em que ni número de plantas no valor da escala; valor da escala vi; V maior valor de escala; N número total de plantas observadas; i indica o número de classes.

2. Dados meteorológicos

1. Realize estudos de pesquisa. Para este protocolo, foram realizados inquéritos durante os períodos de maio e junho de 2022 e 2023. Obtenha os valores de temperatura, umidade relativa e precipitação total para o período de março a julho de 2022, 2023 e longos anos da Diretoria de Meteorologia Provincial de Yozgat (Tabela 1).

3. Identificação morfológica

1. Compare as características culturais (cor da colônia, micélio aéreo, taxa de crescimento do micélio) e conídios (dimensões dos conídios, forma, cor e número de septos) dos isolados de Fusarium com as de estudos anteriores e identifique provisoriamente as espécies de fungos.
2. Selecionar amostras representativas dos grupos a serem utilizados na identificação morfológica. Purifique essas amostras de acordo com o método de isolamento de esporos únicos, conforme mencionado acima. Durante este período, observar as características de pigmentação da colônia de isolados de Fusarium , bem como as estruturas de micro/macroconídios e clamidósporos.
3. Para promover a formação de estruturas micromorfológicas como micro/macroconídios e clamidósporos nas culturas fúngicas puras obtidas, incubar em BDA a 25 ± 1 °C e 12 h: 12 h escuro: claro por 25-30 dias em uma incubadora. Medir o comprimento e a largura dos conídios de cada isolado de Fusarium por microscopia de luz. Além disso, documente a estrutura, forma, cor e septos ou sem septos dos conídios usando um microscópio de luz fornecido com uma câmera digital.
4. Com base nas observações acima, agrupe os isolados de Fusarium de acordo com o nível da espécie, conforme descrito em Leslie e Suerell²².

4. Identificação molecular

NOTA: O DNA genômico total dos isolados de Fusarium foi extraído usando o seguinte método, que foi ligeiramente modificado do protocolo do Cenis²³. As análises de PCR e eletroforese dos isolados de Fusarium foram realizadas usando o protocolo descrito por Aras e Endes²⁴.

1. Extração de DNA genômico fúngico
   1. A partir de uma cultura fresca (10 dias de idade) de isolados de Fusarium cultivados em BDA, raspe 100 mg de micélio com um bisturi estéril e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Incubar os tubos a -20 °C durante a noite.
   2. Após a incubação durante a noite, adicione 500 μL de tampão de extração de DNA (200 mM Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% de dodecil sulfato de sódio) nos tubos e esmague com um pilão de plástico estéril.
   3. Em seguida, adicione 150 μL de acetato de sódio 3M (NaOAc) pH 5,2 aos tubos e incube a -20 °C por 30 min. Após esta etapa, centrifugue os tubos a 4.000 x g por 10 min.
   4. Após a centrifugação, transfira 400 μL do sobrenadante na parte superior do tubo para novos tubos (1,5 mL) e adicione um volume igual de isopropanol (2-propanol). Incubar os novos tubos a -20 °C durante 30 min. Durante este tempo, misture delicadamente os tubos 5x ou 6x.
   5. Centrifugue a 4.000 x g por 10 min para precipitar o DNA genômico e descartar todo o líquido restante nos tubos.
   6. Adicione 1 mL de etanol a 70% ao pellet de DNA genômico como um sedimento branco ou creme no fundo do tubo. Misture suavemente o tubo para cima e para baixo 4x-5x por aproximadamente 1 min, descartando todo o etanol nos tubos. Em seguida, abra os tubos em fluxo de ar laminar por 30 min para evaporar completamente o etanol no pellet de DNA.
   7. Para dissolver o DNA genômico e armazená-lo por um longo tempo, adicione 50 μL de solução tampão TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0) aos tubos e incube os tubos em banho-maria a 65 ° C por 1 h. Durante este tempo, misture suavemente o tubo para cima e para baixo 8x-10x. Conservar o ADN genómico dissolvido numa solução tampão TE num congelador a -20 °C para utilização em estudos moleculares.
2. Para estudos de PCR, use os primers oligonucleotídeos ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') para amplificar a região ITS do rDNA²⁵. Realize cada reação de PCR com 2,5 μL de tampão PCR 10x, 2,5 μL de MgCl₂ (25 mM), 2,5 μL de dNTP (2 mM), 0,5 μL de cada primer (10 μM), 2 μL de DNA molde, 0,5 μL de Taq DNA polimerase (1 U/μL, Fermantas) e 14 μL de sQH2O em um volume total de 25 μL.
3. Para a reação de PCR de 25 μL, execute o seguinte programa de PCR a 95 °C por 2 min (desnaturação inicial), seguido de 40 ciclos; 95 °C por 30 s (desnaturação), 55 °C por 45 s (recozimento), 72 °C por 90 s (extensão) e 72 °C por 5 min (extensão final). Produtos de PCR eletroforese por 1,5 h a 90 V em gel de agarose a 1,5% preparado em solução tampão 1x TAE (Tris Base - Ácido Acético Glacial - EDTA).
   1. Para preparar o tampão TAE para eletroforese em gel, dissolva 242 g de base Tris em 700 mL de água estéril; adicione os 57,1 mL de ácido acético glacial; adicione os 100 mL de solução de EDTA 0,5 M e ajuste o volume para 1 L adicionando água estéril. Ajuste o pH final do tampão TAE 1 L 50x para 8,5. Para fazer o tampão de trabalho 1x TAE, adicione 49 partes de água estéril a 1 parte do tampão 50x TAE.
4. Pinte os géis com brometo de etídio de 0,5 μg/mL e inspecione-os visualmente, tornando-os visíveis em um transiluminador UV.
5. A fim de examinar a relação filogenética entre isolados de agentes de podridão radicular e da coroa, obtenha-se as sequências de bases do gene ITS por PCR, que foram sintetizadas bidirecionalmente (5'-3' e 3'- 5') por meio de um fornecedor. Compare as sequências de bases com os dados genéticos do site do NCBI (National Center of Biotechnology Information) e as sequências de bases do gene ITS de outros isolados de Fusarium no mundo usando o programa Blast. Use-o para identificar os isolados no nível da espécie, conforme descrito abaixo.
   1. Acesse https://www.ncbi.nlm.nih.gov site. Clique na guia BLAST na seção Recursos Populares.
   2. Clique na guia Nucleotide BLAST na nova janela. Na seção Inserir Sequência de Consulta na nova janela, insira as sequências base no formato Fasta e escreva o nome do estudo na seção Cargo.
   3. Em seguida, marque Bancos de dados padrão (nr etc.) na guia Banco de dados na seção Escolher conjunto de pesquisa na parte inferior.
   4. Marque Sequências altamente semelhantes (megablast) na guia Otimizar para na seção Seleção de programa e clique na guia BLAST na parte inferior da página.
6. Use o programa de análise filogenética MEGA 11 para determinar a relação filogenética entre os isolados de Fusarium . Alinhe as sequências de bases usando o programa ClustalW e crie as árvores genealógicas genéticas dos isolados de acordo com a parcimônia máxima para o gene ITS²⁶.
   1. Para baixar o software Mega, acesse o site https://www.megasoftware.net e instale o software Mega. O software MEGA é fornecido GRATUITAMENTE para uso em pesquisa e educação.
   2. Primeiro, salve as sequências na área de trabalho como um arquivo do Bloco de Notas (.txt) no formato FASTA. Execute o programa de software Mega e clique na guia ALIGN. Clique em Editar/Construir Alinhamento na janela. Em seguida, marque Criar um novo alinhamento na nova janela e clique em OK para confirmar.
   3. Clique na guia DNA . Exclua o 1. Sequência que aparece automaticamente na janela, vá para o arquivo Editar e clique na guia Inserir sequência do arquivo . Abra o arquivo do Bloco de Notas (.txt) que contém as sequências e está localizado na área de trabalho.
   4. Nesta fase, todas as sequências aparecem na tela. Primeiro, clique em Qualquer sequência que apareça na tela e, em seguida, marque todas as sequências com CTRL + A. Abra o arquivo Alinhamento e clique em Alinhar por Clustal W a partir daí e clique em OK para executar o programa nas configurações padrão.
   5. Depois de examinar as diferenças no alinhamento das sequências, vá para o arquivo de dados, clique em Análise filogenética e, em seguida, clique em Não na caixa de seleção da janela para saber se as sequências sintetizam proteínas ou não. Nossas sequências não sintetizam proteínas porque pertencem à região ITS.
   6. Retorne à janela principal do software Mega. Clique em Filogenia e selecione Construir/Testar Árvore(s) de Parcimônia Máxima. Na nova janela, selecione Método de Bootstrap para o teste de Filogenia e insira os valores de bootstrap 1.000 para testar a força da ramificação. Na guia Lacunas/Tratamento de Dados Ausentes, selecione Exclusão Parcial, selecione SPR (Poda de Subárvore-Reenxertia) como o método de pesquisa MP e clique em OK para confirmar as operações.
   7. Aguarde o resultado da análise para mostrar a árvore filogenética.

5. Teste de patogenicidade

1. Utilizar quatro isolados para estudos de patogenicidade para cada espécie representativa das espécies de Fusarium que foram identificadas por métodos moleculares. Realizar estudos de patogenicidade a 24 °C, 16 h de luz fluorescente/8 h de fotoperíodo escuro, com 65% de umidade em uma sala com ar condicionado.
2. Semeie sementes de lentilha em frascos de plástico preto com 45 orifícios de 5 cm de diâmetro. Mantenha cada frasco em hipoclorito de sódio a 1% por 3 min e depois enxágue com água destilada estéril 3x. Seque as sementes em um armário estéril por 24 h e semeie com uma semente em cada cova.
   NOTA: As sementes de lentilha da variedade Kayı 91, sensíveis à doença, foram utilizadas em todos os testes de patogenicidade⁶. A técnica de imersão em plântulas foi utilizada como método de inoculação²⁷.
3. Incubar culturas puras de cada isolado em BDA a 24 °C durante 7-10 dias. Raspar as colónias cultivadas a partir da cultura de reserva da superfície do meio com uma espátula e preparar a suspensão de esporos/micélio com água destilada estéril.
4. Remova os resíduos grandes da suspensão por filtração através de uma gaze de 4 camadas e ajuste a concentração de esporos/micélio para 1 x 10⁶ esporos/mL com a ajuda de um hemocitômetro.
5. Após esta fase, arranque as raízes das mudas previamente cultivadas nos frascos quando tiverem 2-3 folhas verdadeiras. Lave em água da torneira e machuque levemente as raízes com uma agulha estéril. Mergulhe essas mudas na suspensão preparada de esporos / micélio por 3 min e, em seguida, transplante-as em frascos de plástico contendo a mistura estéril de solo / turfa (2: 1; v / v).
6. Para as mudas usadas como controle, arranque suas raízes, machuque-as e plante-as mergulhando-as apenas em água estéril. Faça avaliações de teste de patogenicidade 3 semanas após o processo de inoculação de acordo com a escala de 0-4.
7. Após os valores calculados de severidade da doença foram submetidos à transformação angular, submeter os valores obtidos à análise de variância e avaliar as diferenças entre as médias de acordo com o teste HSD de Tukey (p = 0,05). Severidade da doença: Isolados com 0%-15% foram avaliados como tendo virulência muito baixa (LV), isolados com 16%-35% foram avaliados como baixa virulência (LV), isolados com 36%-50% foram avaliados como virulência moderada (O), isolados com 51%-70% foram avaliados como alta virulência (VV), isolados com 71%-100% foram avaliados como muito alta virulência (VV) e isolados sem sintomas da doença foram avaliados como isolados saprófitos ou epífitos.

Determinação dos parâmetros da doença
Um total de 83 áreas de semeadura de lentilha cobrindo nove regiões diferentes de Yozgat foram avaliadas em termos de murcha, raízes e sintomas de podridão da coroa foram pesquisados, estendendo-se por uma área de 1,1984 x 10⁶ m² (Tabela 2). Sintomas de murcha ou podridão radicular foram encontrados em todos os campos. No entanto, a incidência de murcha e podridão radicular em Yozgat foi determinada em 16,9%, com severidade da doença de 38,6% nos distritos de Sorgun e Sarıkaya. A incidência considerável da doença também foi determinada nos distritos de Şefaatli (26,4%), Boğazlayan (23,0%) e Sorgun (20,1%). Paradoxalmente, a maior porcentagem de gravidade da doença foi determinada no distrito de Sorgun com 45,2%, seguido por Boğazlayan com 36,0% e Sarıkaya com 35,4%. Além disso, 679 plantas apresentaram sintomas da doença em amostras coletadas nos campos de lentilha das áreas demarcadas examinadas (Tabela 3). Seguiu-se a identificação morfológica dos agentes fúngicos isolados distribuídos em dois grupos. Os isolados de Fusarium classificados no primeiro grupo incluíram patógenos ou saprófitas como Alternaria sp, Ascochyta sp. e Rhizoctonia sp. A porcentagem da taxa de isolamento dos isolados de Fusarium foi de 95,4%. F. oxysporum foi determinada como a espécie de fungo mais isolada de plantas de lentilha apresentando sintomas da doença em Yozgat, com uma porcentagem de taxa de isolamento de 59,5%. Esta espécie patogênica de Fusarium foi seguida por F. graminearum (15,8%) e F. culmorum (10,2%). Paradoxalmente, F. solani (4,4%) e F. acuminatum (5,5%) foram isolados em níveis mais baixos de plantas com sintomas da doença. F. oxysporum foi obtido em todos os distritos onde o estudo de pesquisa foi realizado, e o percentual de taxa de isolamento de acordo com os bairros foi distribuído entre 45,3% e 72,2%. F. oxysporum foi mais isolado nos distritos Central (72,2%), Şefaatli (71,9%), Akdağmadeni (68,3%) e Sorgun (62,2%) de Yozgat. Em contraste, F. solani e F. acuminatum foram as espécies de Fusarium menos isoladas em Yozgat. F. solani não foi isolado dos distritos de Çekerek e Central; F. acuminatum também não foi isolado dos distritos de Akdağmadeni, Central e Şefaatli (Tabela 3).

Identificação morfológica
Culturas puras de isolados de Fusarium foram identificadas morfologicamente de acordo com os caracteres de suas colônias, bem como estruturas de microconídios, macroconídios e clamidósporos. Estudos de identificação foram realizados em nível de espécie, de acordo com Leslie e Summerell²². Todos os isolados fúngicos obtidos de plantas com sintomas de murcha, raiz e podridão do colo radicular nas lentilhas foram coletados em seis grupos de acordo com sua colônia e micromorfologia (Tabela 3). Enquanto os cinco primeiros grupos incluíam isolados pertencentes a espécies de Fusarium , o outro grupo incluía isolados de fungos patogênicos diferentes do gênero Fusarium , como Alternaria, Rhizoctonia e Ascochyta.

Os isolados de F. oxysporum com maior taxa de isolamento apresentam colônias brancas a amarelas e pigmentação lilás-púrpura. As macrocônias são de comprimento curto a médio, ligeiramente curvadas e geralmente têm de 3 a 5 septos. A estrutura de esporos de alguns isolados é ligeiramente enganchada com dimensões de macroconídios determinadas como 33,8 a 71,5 μm x 3,1 a 4,5 μm. Os microconídios são geralmente não septados, ovais, elípticos ou em forma de rim. A formação de clamidósporos ocorreu lentamente (4-6 semanas). Foi observado em clusters duplos e uma estrutura de cadeia curta¹⁶.

A segunda espécie com maior taxa de isolamento, os isolados de F. graminearum , apresentam micélio aéreo branco-rosa e pigmentação vermelha escura. Os macroconídios são finos, retos ou ligeiramente curvos, com cinco a sete septos. Os septos são bastante distintos. Tem uma célula apical pontiaguda e uma célula basal distintamente em forma de pé. As dimensões são 25,7 a 97,3 μm x 3,5 a 5,5 μm. Não foram observados microconídios e formação de clamidósporos²⁸.

As colônias de isolados de F. culmorum no terceiro grupo eram inicialmente brancas, mas com a idade, observou-se uma estrutura micelial rosa claro a rosa escuro. Os macroconídios são curtos, 4-6 septados e ligeiramente curvos. Dimensões dos macrósporos; 15,8 - 60,0 μm x 3,2 - 5,1 μm. Eles são numerosos. Microsporos não foram observados. A formação de clamidósporos é rápida em comparação com outras espécies (3-5 semanas). Eles são encontrados individualmente ou em grupos de dois²⁹.

As colônias da quarta espécie, isolados de F. acuminatum , são laranja pálido, laranja e bordô claro. É uma espécie de crescimento relativamente lento. Seus macroconídios são finos, têm uma curvatura distinta e têm uma estrutura septada de 3-5. As dimensões dos macroconídios foram determinadas como 31,0-65,5 × 4,3-6,6 μm. Os microconídios têm 0 e 1 septado. Foi observado raramente em imagens microscópicas. A formação de clamidósporos é muito lenta (mais de 6 semanas). Forma-se em cadeias e aglomerados²².

A cor da colônia da última espécie patogênica identificada, isolado de F. solani , é branca e de cor creme. Sua macroconia é larga, plana e ligeiramente curva. As hifas são 3-7 septadas e abundantes. As dimensões dos macrósporos são determinadas como 20,2 a 50,6 μm x 3,1 a 6,2 μm. Os microconídios são indivisíveis ou 1-divididos. Eles são ovais e elipsóides em estrutura. Os clamidósporos são encontrados terminalmente em cadeias curtas em meio CLA dentro de 2-4 semanas³⁰.

Identificação molecular
A PCR foi realizada usando primers ITS4/ITS5 com DNA genômico total obtido de isolados de Fusarium . As sequências de bases bidirecionais (5'-3' e 3'-5') foram registradas e comparadas com outros NCBI GenBank usando o programa Blast (Tabela 4 e Tabela 5). Os isolados de F. oxysporum apresentaram homogeneidade de 99,5% a 100% na sequência de nucleotídeos com isolados da Índia (MT740398), Lituânia (KF646094) e Alemanha (MT453296). Os isolados de F. culmorum apresentaram 100% de homogeneidade na sequência de nucleotídeos com isolados do Canadá (AY147290), França (OW983123) e República Tcheca (MT453296). Os isolados de F. graminearum apresentaram homogeneidade de 99,5% a 100% na sequência de nucleotídeos com isolados da Colômbia (MT598163) e da China (ON527490). Os isolados de F. acuminatum apresentaram homogeneidade de 99,5% a 100% na sequência de nucleotídeos com isolados do Uzbequistão (OR975902) e da China (MZ424810, PP336554). Os isolados de F. solani apresentaram 100% de homogeneidade na sequência de nucleotídeos com isolados do Egito (OR713084), China (PQ482231) e Índia (OP848138). Em seguida, a relação genética entre os isolados de Fusarium foi determinada pela árvore filogenética obtida de acordo com o método de Máxima Parcimônia (MP) usando o programa Mega 11 (Figura 3). Na árvore filogenética MP, 638 caracteres de nucleotídeos foram usados, incluindo lacunas, e 145 desses nucleotídeos foram determinados como regiões informativas que fornecem parcimônia. As análises de MP produziram uma das árvores mais parcimoniosas (Figura 3; Comprimento da Árvore: 172; Índice de Consistência (ConI): 0,974; Índice de Retenção (IR): 0,961; Índice Composto (ComI): 0,7600). Quando este dendrograma MP de isolados de Fusarium foi examinado, a árvore genealógica foi primeiro dividida em dois ramos principais. O primeiro deles correspondeu a todos os isolados de F. solani suportados por 100% de valor de bootstrap. O outro ramo principal foi reunido dentro de si com um valor de bootstrap de 78% e quatro subgrupos F. acuminatum, F. redolens, F. proliferatum e F. acutatum. O outro ramo principal foi dividido em cinco subgrupos F. oxysporum, F. culmorum, F. graminarum, F. pseudograminearum e F. equiseti, com um valor de bootstrap de 97%.

Determinação dos níveis de virulência de isolados de Fusarium
Os resultados dos estudos de patogenicidade de Fusarium spp. isolados de lentilhas mostrando murcha e podridão radicular, para os quais foram concluídos estudos de caracterização morfológica e molecular, estão resumidos na Tabela 6 e na Figura 4. Em geral, todos os isolados de Fusarium apresentaram diferenças nos níveis de severidade das doenças que causaram na lentilha Kayı 91 variedade F _{(19-60; 0,05)} = 43,06; p< 0,0001). Os isolados mais virulentos foram F. oxysporum (YBUFol4), F. culmorum (YBUFc1, YBUFc2) e F. graminearum (YBUFg1, YBUFg3). Descobriu-se que esses cinco isolados tinham um nível de virulência muito alto. Por outro lado, um isolado de F. oxysporum (YBUFol2), F. solani (YBUFs1) e F. graminearum (YBUFg2) apresentou virulência moderada. Além disso, os isolados de F. acuminatum (YBUFa1, YBUFa2, YBUFa3 e YBUFa4) apresentaram virulência fraca ou baixa. Todos os isolados utilizados nos estudos de patogenicidade variaram de 42,5% a 97,5% e foram obtidos após a inoculação de mudas de lentilha.

Figura 1: Plantas de lentilha afetadas por espécies de Fusarium. (A) Visão geral de áreas doentes localizadas em um campo de lentilha com alta gravidade da doença. (B) Vista de plantas com severidade da doença 4. (C) Vista de plantas com severidade da doença 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Vista das plantas de lentilha nos níveis de severidade da doença de 0 a 4. Nível 0 = não apresentou sintomas, 1 = sintomas das folhas em 25%; 2 = 26%-50%; 3 = 51%-75% das folhas; 4 = mais de 75% na mesma ordem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Árvore não enraizada mais parcimoniosa com base na região ITS de Fusarium sp. usando MEGA 11. Os isolados são indicados por asteriscos. O resto é retirado do GenBank. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Taxas de reisolamento (%) e severidade da doença (%) de Fusarium spp. isolado de plantas de lentilha. As linhas verticais representam o erro padrão na barra (n = 16). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Dados meteorológicos do local pesquisado durante a temporada de produção de lentilhas por ano.

Tabela 2: Parâmetros da doença, prevalência, incidência e severidade da murcha, podridão da raiz e do colo da raiz em campos de lentilha.

Tabela 3: Informações sobre lentilhas amostradas para frequência de isolamento fúngico na província de Yozgat, na Turquia.

Tabela 4: Fusarium spp. isolados de lentilha (Lens culinaris) da província de Yozgat, região central da Turquia, usados no estudo filogenético.

Tabela 5: Sequências de espécies de Fusarium usadas do GenBank em estudo filogenético.

Tabela 6: Testes de patogenicidade de espécies de Fusarium em plantas de lentilha. Isolados classificação média <10% = não agressivo; 11%-25% = fraco agressivo; 26%-50% = menos agressivo; 51%-70% = moderadamente agressivo; >70% = altamente agressivo. ^um Diferença estatística entre os isolados de acordo com o teste Tukey HSD (p < 0,05).

A murcha de Fusarium é conhecida por causar sérias perdas de rendimento econômico em algumas partes do mundo³¹. A doença foi relatada pela primeira vez na Hungria³² e posteriormente relatada em muitos países, como Egito, Índia, Mianmar, Nepal, Paquistão, Turquia, Síria e EUA³³. Kumar et ^al.34 relataram uma ampla distribuição de murcha de lentilha, raiz e podridão do colo radicular com relatos de ocorrência em pelo menos 26 países em todo o mundo. Em um estudo recente, 12 espécies de fungos foram isoladas de plantas de lentilha doentes coletadas em diferentes estados da Índia, e F. oxysporum f. sp. lentis foi identificado como o patógeno mais importante (30%), seguido por Rhizoctonia bataticola (17,5%) e Sclerotium rolfsii (15,7%)³¹. Da mesma forma, no presente estudo, o gênero fúngico mais frequentemente isolado foi o Fusarium (95,4%). De acordo com Zitnick-Anderson et ^al.7, Fusarium (50%) foi o gênero fúngico dominante causando murcha, podridão radicular e do colo radicular nas plantações de lentilha de Dakota do Norte. Eles também relataram que F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. equiseti, F. acuminatum, F. graminearum, F. redolens e F. avenaceum são patógenos dentro deste gênero.

As características morfológicas das cinco espécies de Fusarium identificadas neste estudo foram semelhantes às de estudos recentes³⁵. De acordo com Rathod et ^al.36, os isolados de F. oxysporum relataram que apresentavam desenvolvimento de colônias septadas, ramificadas, inicialmente brancas e depois elevadas ou afundadas na PCA, que se tornaram coloridas em diferentes pigmentações. Da mesma forma, no estudo atual, os isolados de F. oxysporum formaram inicialmente colônias brancas, posteriormente amarelas, violetas ou rosa. Por outro lado, clamidósporos na forma de duas ou três cadeias, que foram utilizados como critério morfológico de identificação de isolados de F. oxysporum , foram observados em colônias com aproximadamente 30 dias de idade. De fato, Endes¹⁵ relatou que os clamidósporos de isolados de F. oxysporum mantidos por >30 dias obtidos de tiveram maior tendência a infectar plantas em áreas de cultivo de grão-de-bico da província de Yozgat foram geralmente observados em ambientes antigos.

A podridão radicular de Fusarium em grão-de-bico e lentilha é causada por muitas espécies de Fusarium, como F. solani, F. oxysporum e F. graminearum³⁷. Conforme relatado por Dean et ^al.38, F. graminearum e F. oxysporum estão entre os patógenos fúngicos de plantas mais comumente isolados por micologistas de plantas em todo o mundo. No entanto, Aydın et ^al.6 relataram que F. graminearum está entre os agentes causadores da murcha, raiz e podridão da coroa em áreas de cultivo de lentilha na região sudeste da Anatólia da Turquia. Além disso, F. graminearum é conhecido por causar podridão radicular e da coroa em lentilhas no estado de Dakota do Norte, EUA⁷.

Fletcher et ^al.39 relataram que F. culmorum raramente pode ser isolado como patógeno em áreas de cultivo de lentilhas. Além disso, em um estudo recente de Zitnick-Anderson et ^al.7, foi relatado que F. culmorum está associado à murcha, raiz e podridão do colo radicular em plantas de lentilha. No entanto, Aydın et ^al.6 identificaram muitas espécies de Fusarium que causam murcha e podridão radicular em áreas de cultivo de lentilhas, mas não relataram F. culmorum como patógeno. Essa situação, que difere do presente estudo, pode ser devido ao número diferente de áreas pesquisadas ou ao apoio de estudos morfológicos com métodos moleculares no presente estudo.

Zitnick-Anderson et ^al.7 relataram que F. acuminatum está entre as espécies de Fusarium que causam murcha e podridão radicular e do colo radicular em campos de lentilha de Dakota do Norte. Por outro lado, Aydın et ^al.6 documentaram que F. solani está entre os agentes causadores da murcha e podridão radicular em áreas de cultivo de lentilha. Sabe-se também que F. solani é isolado de áreas de cultivo de lentilha como um patógeno fraco⁷.

As espécies de Fusarium são parasitas facultativos. Infecções devido ao gênero Fusarium em lentilhas podem causar destruição completa das plantas, especialmente em temperaturas extremas no final da primavera ou início do verão. Al Ahmad e Mouselli⁴⁰ relataram que F. oxysporum e F. solani causaram sintomas de amarelecimento, desfolha e dessecação em plantações de lentilha no sul da Síria. F. solani causa podridão radicular e doenças murchas na Anatólia Central, incluindo Yozgat¹⁶. Além disso, algumas outras espécies de Fusarium também foram consideradas patogênicas em certas taxas. Zitnick-Anderson et ^al.7 relataram que a murcha de Fusarium é causada por Fusarium oxysporum f. sp lentis, mas as espécies de F. culmorum, F. solani, F. graminearum também podem causar murcha de acordo com características morfológicas, fisiológicas e patológicas. Além disso, Fletcher et ^al.39 relataram que F. acuminatum, que causa murcha e podridão radicular em lentilhas, tem virulência fraca ou baixa.

O estudo revelou que 95,4% dos isolados de Fusarium obtidos dos campos de lentilha examinados eram espécies de Fusarium e tiveram uma incidência de 1,6% - 26,4% e severidade da doença de 14,4% - 45,2% em plantas de lentilha. Condições climáticas adversas, como primavera quente e seca e calor do início do verão, enfraquecem o crescimento das plantas e tornam as plantas suscetíveis às espécies de Fusarium . A maioria das espécies de Fusarium são patógenos fracos e, quando as condições ambientais enfraquecem a planta hospedeira, causam um aumento na murcha de Fusarium , especialmente em condições de seca.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este estudo foi apoiado pelo Centro de Pesquisa e Aplicação de Coordenação de Projetos da Universidade Bozok, unidade BAP com número de projeto FÇD-2022-1096. Este estudo faz parte do estudo de doutorado de Sevim Atmaca.