JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר במחוז יוזגת מצא כי גורמים ביוטיים, כגון מחלות פטרייתיות כמו נבילה וריקבון שורשים, מגבילים את ייצור העדשים. מבודדי פוסריום נמצאו ב-95.4% מהדגימות, מה שמרמז על סקרים מקומיים תקופתיים וניטור קבוע לפיתוח טכנולוגיה בת קיימא ואסטרטגיות בקרה יעילות.

Abstract

עדשים הן צמח קטניות חשוב המאביק את עצמו. ייצורו מוגבל על ידי גורמים ביוטיים שונים, במיוחד חומרים פטרייתיים הגורמים לקומפלקס הנבילה וריקבון השורשים. המחקר נועד להבין את האפידמיולוגיה והאטיולוגיה האזורית של גורמים פטרייתיים פיטופתוגניים כדי לפתח אסטרטגיות בקרה נגד Fusarium spp הנישא בקרקע. מחקר זה חקר 83 יישובים לזריעת עדשים במחוז יוזגת עבור מחלות נבול, שורש וריקבון כתר הנגרמות על ידי מיני פוסריום נפוצים במהלך 2022 ו-2023. צמחי עדשים סימפטומטיים נאספו לבידוד וזיהוי פטרייתי. מבודדי הפוסריום קובצו לפי מורפולוגיה של המושבה ותורבו על מדיום PDA. יתר על כן, DNA גנומי שהתקבל מבודדי Fusarium נותח באמצעות PCR והושווה לבודדי Fusarium אחרים הרשומים ב-NCBI GenBank. הקשרים הגנטיים בין מבודדי Fusarium נקבעו בשיטת Maximum Parsimony (MP) בתוכנית Mega 11. התוצאות, השכיחות הממוצעת ושיעור חומרת המחלה של מחלות נבילה וריקבון שורשים במחוז יוזגת נקבעו כ-16.9% ו-38.6%, בהתאמה. מבודדי פוסריום נמצאו ב-95.4% מהדגימות. הייתה הומוגניות של רצף נוקלאוטידים של 99.5% עד 100% בקרב מבודדים של F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum ו-F. solani , והמין המבודד ביותר היה F. oxysporum. הדנדרוגרמה MP של מבודדי Fusarium חולקה לשני ענפים עיקריים, הענף הראשון כלל את כל מבודדי F. solani . הענף העיקרי השני כלל מיני Fusarium אחרים שבודדו במחקר הנוכחי וב-NCBI GenBank. המחקר מציע סקרים מקומיים תקופתיים כדי לקבוע את תדירות נבילת הפוסריום לדיכוי בעדשים. מומלץ מאוד לדכא בזמן נזקים מבוססי פוסריום כדי לשלוט במחלה ולשמר את מערכת ייצור העדשים.

Introduction

עדשים (Lens culinaris Medik.), קטנית קטנה למאכל השייכת למשפחת Fabaceae, היא יבול המאביק את עצמו בעונה קרירה עם עלים דמויי מחט ופרחים לבנים עד סגולים בהירים או סגולים כהים1. הוא בוית על ידי בני אדם לפני כ-10,000 שנה בחלק המסופוטמי של הסהר הפורה והתפשט במהירות לעולם החדש, כולל אגן הים התיכון ומרכז אסיה, ומאוחר יותר התאזרח באמריקה2. שטח גידול העדשים העולמי הוא כ-5.5 מיליון דונם עם ייצור של 6.6 מיליון טון3. טורקיה מדורגתבמקום הרביעי בייצור עדשים אחרי קנדה, הודו ואוסטרליה. גידול עדשים בטורקיה חשוב מאוד ומהווה 6.7% מהייצור העולמי. סך ייצור העדשים של טורקיה הוא 474,000 טון והוא מיוצר בלפחות 40 מחוזות4. כ-89.5% מייצור העדשים בטורקיה מורכב מעדשים אדומות וירוקות, המהוות 10.5% מיבול החורף באזור דרום מזרח אנטוליה. שאר היבול גדל כגידולי קיץ. מחוזות יוזגאט (39.5%), קוניה (23.7%), קירשהיר (16.3%), צ'ורום (7.6%) ואנקרה (2.9%) תורמים במידה רבה לייצור העדשים הירוקות4. ייצור עדשים יכול להיות מוגבל על ידי גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. כפור ובצורת הם גורמי הלחץ האביוטיים הנפוצים ביותר בייצור עדשים ירוקות בקיץ5. מחלות פטרייתיות כמו קומפלקס ריקבון נבול, שורש וכתר הנגרמות על ידי Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium ומיני Fusarium הן המחלות הפטרייתיות החשובות ביותר, הגורמות לשילוב של מחלות כולל שיכוך, דלקת שתילים, נבילה וריקבון שורשים, בהתאם לעיתוי ההדבקה, רגישות המארח ותנאים מטאורולוגיים 6,7, 8.

פוסריום היא פטרייה חוטית לא מושלמת הנמצאת באדמה, בצמחים ובמצעים אורגניים והיא סוג קוסמופוליטי בין פתוגנים אלה9. הוא גורם למחלות שונות כגון נבילת פוסריום, ריקבון שורש וריקבון צווארון שורש, כמו גם דלקת ראש פוסריום בחיטה, נבילת פוסריום בקוקורביטים וריקבון שורשים ברוב הקטניות, כולל עדשים 10,11,12. ריקבון צווארון הנבילה של כלי הדם, השורש והשורש הנגרם על ידי Fusarium spp. היא המחלה החשובה ביותר של עדשים באזורי גידול עדשים רבים ברחבי העולם10. Fusarium oxysporum הוא מין הפוסריום הנפוץ ביותר הקשור לריקבון נבול, שורש ושורש בעדשים. ברחבי העולם, מחלות נבולה, שורש וריקבון כתר נגרמות על ידי F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani ו- F. verticillioides באזורי שתילת עדשים7. מחלות ריקבון שורש וכתר הנגרמות על ידי Fusarium spp. מתרחשות הן בשלבי השתיל והן בשלבי הבגרות וגורמות לנבילה פתאומית, ייבוש ובסופו של דבר מוות של העלים. תסמיני המחלה כוללים ריקבון זרעים, ריקבון שורשים, עלעלים עליונים נבולים, עיכוב, התכווצות וסלסול עלים. בשלבים האמצעיים והמאוחרים של מילוי התרמילים, הזרעים בדרך כלל מתכווצים, ותסמיני השורש כוללים עיכוב בצמיחה, שינוי צבע חום, קצות שורשים פגומים והתפשטות של שורשים משניים. ייתכן שלא נראה שינוי צבע של רקמת כלי הדם בכל המקרים13.

באזור מרכז אנטוליה נערכו מחקרים על מצב מחלות נבילה וריקבון שורשים בעדשים במספרים מוגבלים. ליוזגת יש אקלים מתון ומתון עם שפע גשמים בחורף בהשוואה לקיץ והיא מסווגת כ-Dsb (אקלים יבשתי חם ולח) על ידי קופן וגייגר14. הטמפרטורה הממוצעת היא 9.6 מעלות צלזיוס עם משקעים ממוצעים של 512 מ"מ. יוזגת ממוקמת בחצי הכדור הצפוני. הקיץ מתרחש ביוני, יולי, אוגוסט וספטמבר. חשוב מאוד שיהיה מידע על האפידמיולוגיה והאטיולוגיה האזורית של הגורמים הפטרייתיים הפיטופתוגניים הגורמים למחלה לפיתוח אסטרטגיות בקרה שונות נגד Fusarium spp. הנישאים באדמה, כדי לשלוט במחלה15. בהקשר זה, מטרות המחקר הנוכחי הן לקבוע ולזהות - את פרמטרי המחלה (שכיחות, שכיחות וחומרת המחלה) של מחלות נבולה, שורש וריקבון כתר בעדשים על ידי ביצוע סקר במחוז יוזגת, שם כ-40% מכלל ייצור העדשים הירוקות נעשה לבד, הפוסריום הפתוגני מינים הגורמים לנבילה וריקבון שורשים בעדשים על ידי ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים, ולקבוע את רמות האלימות האישיות של מיני הפוסריום על ידי ביצוע בדיקות פתוגניות.

Protocol

הערה: פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. סקר שדה, דגימה ובידוד פטרייתי

הערה: עבודות הסקר בוצעו בשנים 2022 ו-2023, על פי Endes16. בסך הכל נצפו 83 אזורי שתילת עדשים המכסים תשעה מחוזות במחוז יוזגת עבור מחלת ריקבון צווארון נבול, שורש ושורש (איור 1).

  1. בחר שדות עדשים בשטח של מעל 1000 מ"ר כאזור דגימה. אסוף כל דגימה על ידי הליכה אקראית מהגבול למרכז או לאמצע השדה על ידי זיגזגים ההולכים לאורך האלכסונים באמצעות מסגרת של 1 מ"ר , והצבתה באופן אקראי במינימום של שלוש נקודות שונות שנבחרו באופן אקראי. אספו צמחי עדשים המראים תסמיני מחלה מכל נקודה, הכניסו אותם לשקיות נייר והעבירו אותם למעבדה לשימוש במחקרי בידוד וזיהוי פטריות.
    הערה: השורשים וצווארוני השורש של צמחי עדשים חולים שהועברו למעבדה נשטפו תחילה במי ברז כדי להיפטר משאריות גסות; מאוחר יותר, הם עברו חיטוי פני השטח לבידוד הפתוגנים הפטרייתיים כפי שתואר על ידי אנדס16.
  2. משרים רקמות צמחים חולות באתנול 70% למשך 10-15 שניות, ולאחר מכן שוטפים 3 פעמים למשך 3 דקות כל אחת במים סטריליים. החזיקו את כולם ב-1% נתרן היפוכלוריט (NaOCl) למשך 5 דקות, ושטפו 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד שוב במים סטריליים.
  3. יבש את רקמות הצמח הרטובות על ניירות סינון בארון סטרילי כדי לסיים את תהליך חיטוי פני השטח. לאחר מכן, חותכים את רקמות הצמח המחוטאות לחתיכות באורך 5-10 מ"מ ומניחים 4-5 חתיכות על מדיום PDA המכיל 0.01% סטרפטומיצין בתוך צלחות פטרי (קוטר 90 מ"מ). הכניסו את צלחות הפטרי לחממה בחושך בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 4-7 ימים והתבוננו בצמיחת הפטרייה.
    הערה: המבודדים הפטרייתיים המתפתחים טוהרו בשיטת בידוד הנבגים הבודדים. למטרה זו, המחקר שנערך על ידי Choi et al.17 על השגת תרביות נבגים בודדות של פטריות השייכות ל-Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes ו-Hyphomycetes שונו ושימשו כמתואר להלן.
  4. כדי לטהר מבודדים פטרייתיים, שמור את המבודדים הפטרייתיים שהתקבלו בתום מחקרי הבידוד בחממה בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות של אור פלורסנט / 12 שעות חושך למשך 15 יום כדי לעודד היווצרות מבני רבייה אנמורפיים על PDA.
  5. שוקלים כ -100 מ"ג תפטיר פטריות מתרבויות בנות 15 יום בעזרת מרית, מעבירים אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל ואז טוחנים אותו היטב עם עלי פלסטיק סטריליים להומוגניזציה.
  6. הוסף 1 מ"ל מים סטריליים ומערבולת למשך דקה אחת כדי להבטיח העברת נבגים למים. כדי להתאים את מספר הנבגים המועברים למים, צייר 20 מיקרוליטר מתערובת זו בעזרת פיפטה ובדוק את מספר הנבגים בהגדלה פי 10 של מיקרוסקופ האור.
  7. כאשר כמות הנבגים גדולה מהכמות הרצויה, יש לדלל את תערובת הנבגים-מים ביחסים כגון 1/10, 1/100 ו-1/1000. ספק תערובת המכילה 4-6 נבגים בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
  8. קח 100 מיקרוליטר מתרחיף הנבגים המוכן והעביר אותו לצלחות פטרי בקוטר 90 מ"מ המכילות מדיום PDA בתוספת 0.1% סטרפטומיצין. לאחר מכן, מורחים את המתלה המועבר על מחשב כף היד בעזרת מרית דריגלסקי.
  9. דגרו את מנות הפטרי המוכנות בחושך בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות. בסוף תקופה זו, חתיכות קטנות של קורים התפתחו מקונידיה אחת עם לולאת חיסון לצלחת פטרי חדשה המכילה מדיום PDA. כל תרבות המתקבלת מכל נבג היא תרבית נבגים אחת. אחסן אותם לשימוש בבדיקות פתוגניות וזיהוי מורפולוגי ומולקולרי.
    הערה: המטרה העיקרית היא לשמור על מבודדים פטרייתיים בחיים לאורך זמן מבלי לשנות את המורפולוגיה, הגנטיקה והאלימות שלהם. תהליך האחסון בוצע בשתי שיטות שונות18,19. כל שיטות האחסון המשמשות במחקר זה מוסברות בפירוט להלן.
    1. השיטה הראשונה לאחסון דגימות היא כדלקמן. גדל מבודדים פטרייתיים על מדיום PDA בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס עם חושך של 12:12 שעות: אור למשך 15 יום כדי לקבל דיסקיות תפטיר בקוטר 4 מ"מ שניתן לאחסן במים סטריליים.
    2. חותכים דיסקיות תפטיר (קוטר 4 מ"מ, 10 דיסקים) עם מקדח שעם מתרביות פטרייתיות שגדלו בתנאים הנ"ל. העבירו את דיסקי התפטיר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה המכילים 1 מ"ל מים סטריליים. שמור את הדגימות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה במקרר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
    3. השיטה השנייה לאחסון דגימות היא כדלקמן. ראשית, קחו קמצוץ מהדיסק הפטרייתי הטהור מתרביות הנבגים הבודדות המתקבלות עם לולאת חיסון והעבירו אותו לצלחות פטרי המכילות PDA בתוספת כלורמפניקול, חומצה לקטית, אמפיצילין, ריפמפיצין, טטרציקלין, סטרפטומיצין וכו'.
    4. גדל במשך 5-10 ימים לפני תהליך האחסון בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס בתנאי אור של 12 שעות: 12 שעות. חותכים ומעקרים ניירות סינון לשימוש כללי בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ בחיטוי ב-121 מעלות צלזיוס, 15 psi למשך 60 דקות.
    5. מניחים את ניירות הסינון בצלחות פטרי חדשות עם מדיום זהה או סלקטיבי. חותכים מושבות/נבגים מתרבות פטרייתית טהורה ומניחים אותם על החלק העליון של כל חתיכה.
    6. אוטמים את צלחות הפטרי ומניחים אותן בחממה בתנאי גידול מתאימים (כאמור לעיל). הפטריות המבודדות גדלות לאט על נייר פילטר. יש לדגור במשך כ-15 יום כדי להבטיח קולוניזציה מלאה.
    7. לאחר נבג או היווצרות מושבה מלאה על ניירות סינון, העבירו את פיסות הנייר הבודדות לצלחת פטרי חדשה ללא מדיום תרבית. מאוחר יותר, הכניסו את כלי הפטרי לחממה עד שנייר הסינון והפטרייה יבשים לחלוטין (כ-20-30 יום).
    8. לאחר הייבוש הכניסו 10 פיסות נייר סינון לכל מעטפת נייר סטרילית, סמנו כל מעטפה, הכניסו את המעטפות לשקיות ניילון ואחסנו את שקיות הניילון המכילות את המעטפות בכלי פלסטיק ושקוף בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  10. חשב את שיעור השכיחות של מחלת נבילת עדשים, שורש וריקבון כתר ביוזגת על פי הנוסחה המופיעה להלן, בהתחשב בשכיחות המחלה בכל שדה עדשים, ואחריו שם המחוז של המחוז.
    שיעור שכיחות המחלה (%) = (a / b) x 100
    כאשר a מציין את מספר השדות החולים; b מציין את המספר הכולל של השדות שנסקרו במחוז.
  11. חשב את שכיחות המחלה על פי שיטת הממוצע המשוקלל שדווחה על ידי בורה וקראצ'ה20. ספרו את הצמחים בכל ריבוע בשדה. הפרד אותם לצמחים חולים ולא חולים בכל ריבוע וחשב את שכיחות המחלה לפי הנוסחה המופיעה להלן.
    שיעור שכיחות המחלה (%) = (x / y) x 100
    כאשר x מציין את מספר הצמחים החולים; y מציין את המספר הכולל של הצמחים שנסקרו.
  12. חשב את חומרת המחלה לפי הסולם 0-4 של Öğüt21, כאשר 0 = לא הראה תסמינים, 1 = תסמינים ברמה קלה ב -25% מהעלים; 2 = תסמינים ברמה בינונית ב-26%-50% מהעלים; 3= כלורוזיס חמור ונבילה ב-51%-75% מהעלים; ו-4 = כלורוזיס חמור מאוד ותסמיני נבילה או ייבוש, נשירה, עיכוב בגדילה או עלים מתים ביותר מ-75% צמחים באותו סדר (איור 2).
  13. חשב את חומרת המחלה באמצעות הנוסחה הבאה עם ערכי הסולם שהתקבלו16.
    חומרת המחלה (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    כאשר ni מספר הצמחים בערך הסולם; ערך סולם vi; ערך V בקנה מידה גבוה ביותר; N המספר הכולל של הצמחים שנצפו; i מציין את מספר המחלקות.

2. נתונים מטאורולוגיים

  1. לערוך מחקרי סקרים. לצורך פרוטוקול זה, נערכו סקרים בתקופות מאי ויוני 2022 ו-2023. קבל את ערכי הטמפרטורה, הלחות היחסית וסך המשקעים לתקופה מרץ-יולי בשנים 2022, 2023, ושנים ארוכות מהמנהלת למטאורולוגיה מחוזית ב-Yozgat (טבלה 1).

3. זיהוי מורפולוגי

  1. השווה את המאפיינים התרבותיים (צבע המושבה, תפטיר אווירי, קצב גידול התפטיר) והקונידיאלי (מידות קונידיאליות, צורה, צבע ומספר המחיצות) של מבודדי הפוסריום לאלה של מחקרים קודמים וזהה באופן זמני מיני פטרייה.
  2. בחר דגימות מייצגות מהקבוצות שישמשו בזיהוי מורפולוגי. טהר דגימות אלו על פי שיטת בידוד הנבגים הבודדת כאמור לעיל. במהלך תקופה זו, שימו לב למאפייני הפיגמנטציה של המושבה של מבודדי פוסריום וכן מבני מיקרו/מקרוקונידיה וכלמידוספור.
  3. כדי לקדם את היווצרותם של מבנים מיקרומורפולוגיים כגון מיקרו/מקרוקונידיה וכלמידוספורים בתרביות הפטריות הטהורות המתקבלות, דגרו על PDA בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ו-12 שעות: 12 שעות חושך: אור למשך 25-30 יום בחממה. מדוד את האורך והרוחב של קונידיה עבור כל Fusarium מבודד על ידי מיקרוסקופ אור. בנוסף, תעד את המבנה, הצורה, הצבע והמחיצה או ללא מחיצות של הקונידיה באמצעות מיקרוסקופ אור המסופק עם מצלמה דיגיטלית.
  4. בהתבסס על התצפיות לעיל, קבץ את מבודדי הפוסריום לפי רמת המינים, כמתואר בלסלי וסוארל22.

4. זיהוי מולקולרי

הערה: ה-DNA הגנומי הכולל של מבודדי הפוסריום חולץ בשיטה הבאה, ששונתה מעט מהפרוטוקול של Cenis23. ניתוחי PCR ואלקטרופורזה של מבודדי פוסריום בוצעו באמצעות הפרוטוקול שתואר על ידי אראס ואנדס24.

  1. מיצוי DNA גנומי פטרייתי
    1. מתרבית טרייה (בת 10 ימים) של Fusarium isolates הגדלים על PDA, מגרדים 100 מ"ג תפטיר עם אזמל סטרילי ולאחר מכן מעבירים אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לאחר דגירה של לילה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מיצוי DNA (200 מ"מ Tris-HCl pH: 8.5, 250 מ"מ NaCl, 25 מ"מ EDTA, 0.5% נתרן דודציל סולפט) לתוך הצינורות ומועך בעזרת עלי פלסטיק סטרילי.
    3. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של 3M נתרן אצטט (NaOAc) pH 5.2 לצינורות ודגירה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שלב זה, צנטריפוגה את הצינורות ב -4,000 x גרם למשך 10 דקות.
    4. לאחר צנטריפוגה, העבירו 400 מיקרוליטר של הסופרנטנט בחלק העליון של הצינור לצינורות חדשים (1.5 מ"ל) והוסיפו נפח שווה של איזופרופנול (2-פרופנול). דגרו את הצינורות החדשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו, ערבבו בעדינות את הצינורות פי 5 או 6.
    5. צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות כדי לזרז את ה-DNA הגנומי ולהשליך את כל הנוזל שנותר בצינורות.
    6. הוסף 1 מ"ל של 70% אתנול לכדור ה-DNA הגנומי כמשקע לבן או בצבע שמנת בתחתית הצינור. מערבבים בעדינות את הצינור למעלה ולמטה 4x-5x למשך כדקה אחת, וזורקים את כל האתנול בצינורות. לאחר מכן, פתח את הצינורות בזרימת אוויר למינרית למשך 30 דקות כדי לאדות לחלוטין את האתנול על כדור ה-DNA.
    7. כדי להמיס את ה-DNA הגנומי ולאחסן אותו לאורך זמן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת חיץ TE (1M Tris-HCl pH: 8.0; 0.5M EDTA pH 8.0) לצינורות ודגר את הצינורות באמבט מים ב-65 מעלות צלזיוס למשך שעה. במהלך תקופה זו, ערבבו בעדינות את הצינור למעלה ולמטה פי 8-10. אחסן את ה-DNA הגנומי המומס בתמיסת חיץ TE במקפיא עמוק של -20 מעלות צלזיוס לשימוש במחקרים מולקולריים.
  2. למחקרי PCR, השתמש בפריימרים אוליגונוקלאוטידים ITS5 F (5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') כדי להגביר את אזור ה- ITS של rDNA25. בצע כל תגובת PCR עם 2.5 מיקרוליטר של מאגר PCR פי 10, 2.5 מיקרוליטר של MgCl2 (25 מ"מ), 2.5 מיקרוליטר של dNTP (2 מ"מ), 0.5 מיקרוליטר מכל פריימר (10 מיקרומטר), 2 מיקרוליטר של DNA תבנית, 0.5 מיקרוליטר של Taq DNA פולימראז (1 U/μL, פרמנטס) ו-14 מיקרוליטר של sQH2O בנפח כולל של 25 מיקרוליטר.
  3. עבור תגובת PCR של 25 מיקרוליטר, הפעל את תוכנית ה-PCR הבאה 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (דנטורציה ראשונית), ואחריה 40 מחזורים; 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (דנטורציה), 55 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (חישול), 72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות (הארכה) ו-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (הארכה סופית). מוצרי PCR אלקטרופוריים למשך 1.5 שעות ב-90 וולט בג'ל אגרוז 1.5% המוכן בתמיסת חיץ 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA).
    1. להכנת מאגר TAE לאלקטרופורזה של ג'ל, ממיסים 242 גרם בסיס טריס ב-700 מ"ל מים סטריליים; הוסף 57.1 מ"ל של חומצה אצטית קרחון; הוסף את 100 מ"ל של תמיסת EDTA של 0.5 M, והתאם את הנפח ל-1 ליטר על ידי הוספת מים סטריליים. התאם את ה-pH הסופי של מאגר 1 L 50x TAE ל-8.5. כדי ליצור את מאגר העבודה 1x TAE, הוסף 49 חלקים של מים סטריליים לחלק אחד של מאגר ה-50x TAE.
  4. צבעו את הג'לים ב-0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד ובדקו אותם ויזואלית על ידי הפיכתם לגלויים על גבי משדר UV.
  5. על מנת לבחון את הקשר הפילוגנטי בין מבודדי חומר ריקבון שורש וכתר, השג את רצפי הבסיס של הגן ITS על ידי PCR, שסונתזו באופן דו-כיווני (5'-3' ו-3'-5') באמצעות ספק. השווה את רצפי הבסיס עם נתוני הגנים מאתר NCBI (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי) ורצפי הבסיס של גן ה-ITS של מבודדי Fusarium אחרים בעולם באמצעות תוכנית Blast. השתמש בזה כדי לזהות את המבודדים ברמת המין כמתואר להלן.
    1. עבור אל אתר האינטרנט https://www.ncbi.nlm.nih.gov. לחץ על הכרטיסייה BLAST בקטע משאבים פופולריים.
    2. לחץ על הכרטיסייה פיצוץ נוקלאוטיד בחלון החדש. בקטע הזן רצף שאילתות בחלון החדש, הזן את רצפי הבסיס בפורמט Fasta וכתוב את שם המחקר בסעיף תפקיד.
    3. לאחר מכן, בדוק מסדי נתונים סטנדרטיים (nr וכו') בכרטיסייה מסד נתונים בקטע בחר ערכת חיפוש בתחתית.
    4. בדוק רצפים דומים מאוד (מגה-בלסט) בכרטיסייה אופטימיזציה עבור בקטע בחירת תוכנית ולחץ על הכרטיסייה BLAST בתחתית העמוד.
  6. השתמש בתוכנית הניתוח הפילוגנטי MEGA 11 כדי לקבוע את הקשר הפילוגנטי בין מבודדי פוסריום . יישר את רצפי הבסיס באמצעות תוכנית ClustalW וצור את עצי המשפחה הגנטיים של המבודדים בהתאם לחסכון המקסימלי עבור הגן ITS26.
    1. להורדת תוכנת מגה, היכנסו לאתר https://www.megasoftware.net, והתקינו את תוכנת מגה. תוכנת MEGA ניתנת בחינם לשימוש במחקר וחינוך.
    2. תחילה, שמור את הרצפים בשולחן העבודה כקובץ פנקס רשימות (.txt) בפורמט FASTA. הפעל את תוכנת מגה ולחץ על הכרטיסייה ALIGN . לחץ על ערוך/בנה יישור בחלון. לאחר מכן, סמן צור יישור חדש בחלון החדש ולחץ על אישור כדי לאשר.
    3. לחץ על לשונית DNA . מחק את ה- 1. רצף שמופיע אוטומטית בחלון, ועבור אל ערוך קובץ, ולאחר מכן לחץ על הוסף רצף מקובץ הכרטיסייה. פתח את קובץ פנקס הרשימות (.txt) המכיל את הרצפים וממוקם בשולחן העבודה.
    4. בשלב זה, כל הרצפים מופיעים על המסך. ראשית, לחץ על כל רצף שמופיע על המסך, ולאחר מכן סמן את כל הרצפים עם CTRL + A. פתח את יישור file ולחץ על Align by Clustal W משם, ולחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית בהגדרות ברירת המחדל.
    5. לאחר בחינת ההבדלים ביישור הרצפים, עבור לקובץ הנתונים, לחץ על ניתוח פילוגנטי ולאחר מכן לחץ על לא בתיבת הסימון בחלון אם הרצפים מסנתזים חלבונים או לא. הרצפים שלנו אינם מסנתזים חלבונים מכיוון שהם שייכים לאזור ה-ITS.
    6. חזור לחלון הראשי של תוכנת מגה. לחץ על פילוגנטיה ובחר בנה/בדוק עצי חסכון מקסימליים. בחלון החדש, בחר שיטת אתחול עבור מבחן הפילוגניה והזן ערכי אתחול 1,000 כדי לבדוק את חוזק הענף. בכרטיסייה Gaps/Data Treatment (טיפול בנתונים חסרים), בחר Partial Deletion, בחר Subtree-pruning-Regrafting (SPR) כשיטת החיפוש MP ולחץ על OK כדי לאשר את הפעולות.
    7. המתן לתוצאת הניתוח כדי להראות את העץ הפילוגנטי.

5. מבחן פתוגניות

  1. השתמש בארבעה מבודדים למחקרי פתוגניות עבור כל מין מייצג ממיני הפוסריום שזוהו בשיטות מולקולריות. בצע מחקרי פתוגניות ב-24 מעלות צלזיוס, 16 שעות של אור פלואורסצנטי/8 שעות אור חושך, עם 65% לחות בחדר ממוזג.
  2. זורעים זרעי עדשים בבקבוקוני פלסטיק שחורים עם 45 חורים בקוטר 5 ס"מ. שמור כל בקבוקון בנתרן היפוכלוריט 1% למשך 3 דקות ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים סטריליים פי 3. יבש את הזרעים בארון סטרילי למשך 24 שעות וזרע עם זרע אחד בכל חור.
    הערה: זרעי העדשים מזן Kayı 91, הרגישים למחלה, שימשו בכל בדיקות הפתוגניות6. טכניקת טבילת השתילים שימשה כשיטת החיסון27.
  3. דגרו תרביות טהורות של כל איזולט ב-PDA ב-24 מעלות צלזיוס למשך 7-10 ימים. מגרדים את המושבות המעובדות מתרבות הציר מפני השטח של המדיום בעזרת מרית ומכינים את תרחיף הנבגים/תפטיר באמצעות מים מזוקקים סטריליים.
  4. הסר שאריות גדולות מהתרחיף על ידי סינון דרך בד גבינה בן 4 שכבות והתאם את ריכוז הנבגים/תפטיר ל-1 x 106 נבגים/מ"ל בעזרת המוציטומטר.
  5. לאחר שלב זה, עקרו את שורשי השתילים שגדלו בעבר בבקבוקונים כאשר יש להם 2-3 עלים אמיתיים. שוטפים במי ברז ופוצעים מעט שורשים בעזרת מחט סטרילית. טבלו את השתילים הללו בתרחיף הנבגים/תפטיר המוכן למשך 3 דקות ולאחר מכן השתלו אותם בבקבוקוני פלסטיק המכילים תערובת אדמה/כבול סטרילית (2:1; v/v).
  6. עבור השתילים המשמשים כבקרות, עקרו את שורשיהם, פצעו אותם ואז שתלו אותם על ידי טבילתם במים סטריליים בלבד. בצע הערכות בדיקת פתוגניות 3 שבועות לאחר תהליך החיסון לפי סולם 0-4.
  7. לאחר שערכי חומרת המחלה המחושבים עברו שינוי זווית, הכניסו את הערכים שהתקבלו לניתוח שונות והעריכו את ההבדלים בין הממוצעים על פי מבחן HSD (p = 0.05) של Tukey. חומרת המחלה: מבודדים עם 0%-15% הוערכו כבעלי אלימות נמוכה מאוד (LV), מבודדים עם 16%-35% הוערכו כאלימות נמוכה (LV), מבודדים עם 36%-50% הוערכו כאלימות בינונית (O), מבודדים עם 51%-70% הוערכו כאלימות גבוהה (VV), מבודדים עם 71%-100% הוערכו כאלימות גבוהה מאוד (VV) ומבודדים ללא תסמיני מחלה הוערכו כמבודדים ספרופיטיים או אפיפיטיים.

תוצאות

קביעת פרמטרים של מחלה
בסך הכל נסקרו 83 אזורי זריעת עדשים המכסים תשעה אזורים שונים של יוזגת במונחים של תסמיני מחלת נבול, שורש וריקבון עטרה, המשתרעים על פני שטח של 1.1984 x 106 מ"ר (טבלה 2). תסמיני מחלת נבילה או ריקבון שורשים נתקלו בכל התחומים. עם זאת, שכיחות מחלת הנבילה וריקבון השורשים ביוזגת נקבעה כ-16.9%, עם חומרת מחלה של 38.6% במחוזות סורגון וסריקאיה. שכיחות ניכרת של המחלה נקבעה גם במחוזות שפאטלי (26.4%), בוגאזליאן (23.0%) וסורגון (20.1%). באופן פרדוקסלי, אחוז חומרת המחלה הגבוה ביותר נקבע במחוז סורגון עם 45.2%, ואחריו בוגאזליאן עם 36.0% וסאריקאיה עם 35.4%. יתר על כן, 679 צמחים הראו תסמיני מחלה בדגימות שנאספו משדות העדשים של האזורים המסומנים שנבדקו (טבלה 3). לאחר מכן בוצע זיהוי מורפולוגי של החומרים הפטרייתיים המבודדים המופצים בשתי קבוצות. מבודדי פוסריום שסווגו בקבוצה הראשונה כללו פתוגנים או ספרופיטים כגון Alternaria sp, Ascochyta sp. ו-Rhizoctonia sp. אחוז שיעור הבידוד של מבודדי פוסריום היה 95.4%. F. oxysporum נקבע כמין הפטרייה המבודד ביותר מצמחי עדשים המראה תסמיני מחלה ב-Yozgat עם אחוז בידוד של 59.5%. אחרי מין Fusarium פתוגני זה הגיעו F. graminearum (15.8%) ו-F. culmorum (10.2%). באופן פרדוקסלי, F. solani (4.4%) ו-F. acuminatum (5.5%) בודדו ברמות נמוכות יותר מצמחים שהראו תסמיני מחלה. F. oxysporum התקבל מכל המחוזות שבהם נערך מחקר הסקר, ואחוז שיעור הבידוד לפי המחוזות התחלק בין 45.3% ל-72.2%. F. oxysporum בודד הכי הרבה במחוזות המרכז (72.2%), שפאטלי (71.9%), אקדאמדני (68.3%) וסורגון (62.2%) של יוזגת. לעומת זאת, F. solani ו-F. acuminatum היו מיני הפוסריום הכי פחות מבודדים ב-Yozgat. פ. סולאני לא היה מבודד ממחוזות צ'קרק ומרכז; F. acuminatum גם לא בודד ממחוזות Akdağmadeni, Central ו-Şefaatli (טבלה 3).

זיהוי מורפולוגי
תרביות טהורות של מבודדי פוסריום זוהו מורפולוגית על פי מאפייני המושבה שלהם, כמו גם מבני מיקרו-קונידיה, מקרו-קונידיה וכלמידוספור. מחקרי זיהוי בוצעו ברמת המינים, על פי לסלי וסאמרל22. כל המבודדים הפטרייתיים שהתקבלו מצמחים המראים תסמיני ריקבון נבול, שורש ושורש על עדשים נאספו בשש קבוצות על פי המושבה והמיקרו-מורפולוגיה שלהם (טבלה 3). בעוד שחמש הקבוצות הראשונות כללו מבודדים השייכים למיני Fusarium, הקבוצה השנייה כללה מבודדים פטרייתיים פתוגניים שאינם הסוג Fusarium, כגון Alternaria, Rhizoctonia ו-Ascochyta.

לבודדים של F. oxysporum עם שיעור הבידוד הגבוה ביותר יש מושבות לבנות עד צהובות ופיגמנטציה לילך-סגולה. המקרוקוניה קצרה עד בינונית, מעוקלת מעט, ובדרך כלל יש לה 3-5 מחיצות. מבנה הנבגים של חלק מהמבודדים מחובר מעט לממדי מקרוקונידיה שנקבעו כ-33.8 עד 71.5 מיקרומטר x 3.1 עד 4.5 מיקרומטר. מיקרוקונידיות הן בדרך כלל לא מחורצות, סגלגלות, אליפטיות או בצורת כליה. היווצרות כלמידוספור התרחשה באיטיות (4-6 שבועות). הוא נצפה באשכולות כפולים ובמבנה שרשרת קצר16.

המין השני בעל שיעור הבידוד הגבוה ביותר, F. graminearum מבודד, הוא בעל תפטיר אווירי לבן-ורוד ופיגמנטציה אדומה כהה. המקרוקונידיות דקות, ישרות או מעוקלות מעט, עם חמש עד שבע מחיצות. המחיצות נבדלות למדי. יש לו תא אפיקלי מחודד ותא בסיס בצורת כף רגל מובהקת. הממדים הם 25.7 עד 97.3 מיקרומטר x 3.5 עד 5.5 מיקרומטר. היווצרות מיקרוקונידיה וכלמידוספור לא נצפו28.

מושבות של F. culmorum מבודדים בקבוצה השלישית היו בתחילה לבנות, אך עם הגיל נצפה מבנה תפטיר ורוד בהיר עד ורוד כהה. מקרוקונידיות קצרות, 4-6 מחיצות ומעוקלות מעט. מידות Macrospore; 15.8 - 60.0 מיקרומטר x 3.2 - 5.1 מיקרומטר. הם רבים. מיקרוספורים לא נצפו. היווצרות כלמידוספור מהירה בהשוואה למינים אחרים (3-5 שבועות). הם נמצאים בודדים או באשכולות שלשניים 29.

המושבות של המין הרביעי, F. acuminatum isolates, הן כתומות בהירות, כתומות ובורדו בהיר. זהו מין שגדל לאט יחסית. המקרוקונידיה שלו דקה, בעלת עקמומיות מובהקת ובעלת מבנה מחיצה של 3-5. מידות המקרוקונידיה נקבעו כ-31.0-65.5 ×-4.3-6.6 מיקרומטר. למיקרוקונידיה יש 0 ו-1 מחיצה. הוא נצפה לעתים רחוקות בתמונות מיקרוסקופיות. היווצרות כלמידוספור איטית מאוד (יותר מ-6 שבועות). הוא נוצר בשרשראות ובאשכולות22.

צבע המושבה של המין הפתוגני האחרון שזוהה, F. solani isolate, הוא לבן וצבע קרם. המקרוקוניה שלו רחבה, שטוחה ומעוקלת מעט. קורים הם 3-7 מחיצות ושופעים. מידות המקרוספור נקבעות כ-20.2 עד 50.6 מיקרומטר x 3.1 עד 6.2 מיקרומטר. מיקרוקונידיות אינן מחולקות או מחולקות 1. הם סגלגלים ואליפסואידים במבנה. כלמידוספורים נמצאים באופן סופי בשרשראות קצרות במדיום CLA תוך 2-4 שבועות30.

זיהוי מולקולרי
PCR בוצע באמצעות פריימרים ITS4/ITS5 עם DNA גנומי כולל שהתקבל מבודדי Fusarium . רצפי הבסיס הדו-כיווניים (5'-3' ו-3'-5') נרשמו והושוו ל-NCBI GenBank אחרים באמצעות תוכנית Blast (טבלה 4 וטבלה 5). מבודדי F. oxysporum הראו הומוגניות של 99.5% עד 100% ברצף נוקלאוטידים עם מבודדים מהודו (MT740398), ליטא (KF646094) וגרמניה (MT453296). מבודדי F. culmorum הראו הומוגניות של 100% רצף נוקלאוטידים עם מבודדים מקנדה (AY147290), צרפת (OW983123) וצ'כיה (MT453296). מבודדי F. graminearum הראו הומוגניות של 99.5% עד 100% ברצף נוקלאוטידים עם מבודדים מקולומביה (MT598163) וסין (ON527490). מבודדי F. acuminatum הראו הומוגניות של 99.5% עד 100% ברצף נוקלאוטידים עם מבודדים מאוזבקיסטן (OR975902) וסין (MZ424810, PP336554). מבודדי F. solani הראו הומוגניות של 100% רצף נוקלאוטידים עם מבודדים ממצרים (OR713084), סין (PQ482231) והודו (OP848138). לאחר מכן, הקשר הגנטי בין מבודדי Fusarium נקבע על ידי העץ הפילוגנטי שהתקבל על פי שיטת Maximum Parsimony (MP) באמצעות תוכנית Mega 11 (איור 3). בעץ הפילוגנטי MP נעשה שימוש ב-638 תווי נוקלאוטידים, כולל פערים, ו-145 מהנוקלאוטידים הללו נקבעו כאזורים אינפורמטיביים המספקים חסכון. ניתוחי MP הניבו את אחד העצים החסכוניים ביותר (איור 3; אורך העץ: 172; מדד עקביות (ConI): 0.974; מדד שימור (RI): 0.961; מדד משולב (ComI): 0.7600). כאשר נבדקה דנדרוגרמה MP זו של מבודדי פוסריום , עץ המשפחה חולק תחילה לשני ענפים עיקריים. הראשון מביניהם תאם את כל מבודדי F. solani הנתמכים על ידי ערך אתחול של 100%. הענף העיקרי השני נאסף בתוך עצמו עם ערך אתחול של 78% וארבע תת-קבוצות F. acuminatum, F. redolens, F. proliferatum ו-F. acutatum. הענף העיקרי השני חולק לחמש תת-קבוצות: F. oxysporum, F. culmorum, F. graminarum, F. pseudograminearum ו-F. equiseti, עם ערך אתחול של 97%.

קביעת רמות האלימות של מבודדי פוסריום
תוצאות מחקרי הפתוגניות של Fusarium spp. שבודדו מעדשים המראים נבילה וריקבון שורשים, שעבורם הושלמו מחקרי אפיון מורפולוגיים ומולקולריים, מסוכמים בטבלה 6 ובאיור 4. באופן כללי, כל מבודדי הפוסריום הראו הבדלים ברמות החומרה של המחלות שהם גרמו בזן העדשים Kayı 91 F(19-60; 0.05) = 43.06; עמ< 0.0001). המבודדים האלימים ביותר היו F. oxysporum (YBUFol4), F. culmorum (YBUFc1, YBUFc2) ו-F. graminearum (YBUFg1, YBUFg3). חמשת המבודדים הללו נמצאו בעלי רמת אלימות גבוהה מאוד. מצד שני, בודד אחד של F. oxysporum (YBUFol2), F. solani (YBUFs1) ו-F . graminearum (YBUFg2) נמצא כבעל אלימות בינונית. בנוסף, מבודדי F. acuminatum (YBUFa1, YBUFa2, YBUFa3 ו-YBUFa4) נמצאו בעלי אלימות חלשה או נמוכה. כל המבודדים ששימשו במחקרי פתוגניות נעו בין 42.5% ל-97.5% והתקבלו לאחר חיסון שתילי עדשים.

figure-results-8145
איור 1: צמחי עדשים שהושפעו ממיני Fusarium. (A) מבט כללי על אזורים חולים מקומיים בשדה עדשים עם חומרת מחלה גבוהה. (B) מבט על צמחים עם חומרת מחלה 4. (C) מבט על צמחים עם חומרת מחלה 3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8753
איור 2: מבט על צמחי עדשים ברמות חומרת מחלה 0-4. רמה 0 = לא הראתה תסמינים, 1 = תסמיני העלים ב-25%; 2 = 26%-50%; 3 = 51%-75% מהעלים; 4 = יותר מ-75% באותו סדר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9261
איור 3: העץ החסכוני ביותר ללא שורשים המבוסס על אזור ITS של Fusarium sp. באמצעות MEGA 11. המבודדים מסומנים בכוכביות. השאר נלקחו מבנק הגנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9777
איור 4: בידוד מחדש (%) ושיעורי חומרת המחלה (%) של Fusarium spp. מבודד מצמחי עדשים. קווים אנכיים מייצגים את שגיאת התקן בסרגל (n = 16). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טמפרטורה (°C)לחות יחסית (%)משקעים (מ"מ)
חודש20222023לטווח ארוך20222023לטווח ארוך20222023לטווח ארוך
Akdağmadeni
מרץ11.17.43.845.168.871.121.478.760.6
אפריל11.111.48.859.26761.556.5109.842.6
מאי16.315.112.964.373.964.848.583.674.1
יוני16.518.416.263.453.269.10.320.157.2
יולי2222.218.74840.560.51.407
Boğazlıyan
מרץ12.39.95.247.865.566136440.1
אפריל12.813.510.262.666.659.320.224.224.4
מאי18.717.714.662.567.461.265.42035.1
יוני19.720.618.652.949.959.902.435.5
יולי24.32421.742.539.550003.9
Çekerek
מרץ13.510.86.652.870.46924.3111.348.7
אפריל14.113.911.563.972.36148.173.432
מאי19.318.615.869.172.765.480.36959.3
יוני20.121.819.461.557.567.8016.462.8
יולי24.624.72257.852.457.533.2010.9
יוזגת
מרץ11.58.4447.368.767.514.684.887.3
אפריל12.412.79.360.165.258.747.454.441.9
מאי17.516.813.764.26860.292.661.672.2
יוני18.320.317.457.950.761.214.863.6
יולי22.923.620.550.944.352.770.28.8
סרייקנט
מרץ14.896.250.971.17111.177.355.3
אפריל12.512.310.564.673.260.735.336.129
מאי17.616.414.269.176.765.947.872.457
יוני18.219.218.263.86169.6028.656.1
יולי23.223.121.654.251.757.9007.4
סאריקאיה
מרץ12.99.65.64768.266.518.475.553.6
אפריל13.213.110.75968.856.524.860.627.2
מאי18.517.314.763.271.660.657.664.547.2
יוני18.920.518.45953.962016.150.6
יולי242421.348.645.451.5006.4
שפאאטלי
מרץ13.110.66.248.261.16712.671.550.2
אפריל11.214.311.161.660.958.648.450.526
מאי19.918.615.466.761.962.365.295.453.7
יוני20.422.219.755.845.561.21.22.546.8
יולי2525.323.247.939.547.1004.1
סורגון
מרץ12.29.44.848.468.26721.6104.249.8
אפריל1313.310.159.766.158.953.233.831.7
מאי18.317.414.563.769.160.956.689.644.2
יוני18.920.318.356.853.461.5016.655.2
יולי23.723.721.25044.952.9407.5
ירקוי
מרץ1512.1641.260.561.34.446.160.1
אפריל16.216.213.554.860.450.940.946.823
מאי21.520.617.455.459.652.25723.635.1
יוני2324.520.945.241.456.40.2039.1
יולי27.527.724.438.235.542.20.203.5

טבלה 1: נתונים מטאורולוגיים של המקום שנסקר בעונת גידול העדשים לפי שנה.

מחוזמספר שדותשטח זריעה שנסקר (Decare)שכיחות המחלה (%)שכיחות המחלה (%)חומרת המחלה (%)
Akdağmadeni443.2100721.8
Boğazlıyan486.41002336
Çekerek12.71001.614.4
מרכז324.31005.823
סרייקנט653.31008.128.2
סאריקאיה12189.31001735.4
סורגון48683.210020.145.2
שפאאטלי273.710026.423.4
ירקוי342.31009.132.9
הכולל831198.410016.938.6

טבלה 2: פרמטרים של מחלה, שכיחות, שכיחות וחומרת ריקבון נבול, שורש ושורש בשדות עדשים.

מחוזמספר הצמחים המשמשים לבידודתדירות הבידוד (%)
ו. אוקסיספורוםו. קולמורוםפ. סולאניפ. אקומינאטוםפ. גרמינרוםאחר
Akdağmadeni4168.39.82.4014.64.9
Boğazlıyan5754.41.812.3715.88.8
Çekerek2152.44.8023.89.59.5
מרכז3672.211.10013.92.8
סרייקנט6445.312.57.84.721.97.8
סאריקאיה14856.811.57.45.415.53.4
סורגון23362.29.41.37.316.33.4
שפאאטלי3271.915.63.109.40
ירקוי4757.414.94.32.114.96.4
הכולל67959.510.24.45.515.84.6

טבלה 3: מידע על עדשים שנדגמו לתדירות בידוד פטרייתי ממחוז יוזגת בטורקיה.

מיני פוסריוםלבודדמחוזמקור בידודמספר הצטרפות לבנק הגנים
ו. אוקסיספורוםYBUFol1סורגוןשורשPQ573109
YBUFol2בוגזליאןצווארון שורשPQ573110
YBUFol3סאריקאיהשורשPQ573111
YBUFol4אקדגמדנישורשPQ573112
ו. קולמורוםYBUFc1סורגוןשורשPQ573113
YBUFc2ירקוישורשPQ573114
YBUFc3סאריקאיהשורשPQ573115
YBUFc4סרייקנטצווארון שורשPQ573116
פ. סולאניYBUFs1יוזגתשורשPQ573117
YBUFs2סורגוןשורשPQ573118
YBUFs3צפאטלישורשPQ573119
YBUFs4סאריקאיהשורשPQ573120
פ. אקומינאטוםיבופ1צ'קרקשורשPQ573121
יבופ2בוגזליאןצווארון שורשPQ573122
יבופ3סאריקאיהצווארון שורשPQ573123
YBUFa4סורגוןשורשPQ573124
פ. גרמינרוםYBUFg1יוזגתשורשPQ573125
YBUFg2סורגוןשורשPQ573126
YBUFg3סרייקנטשורשPQ573127
YBUFg4סאריקאיהצווארון שורשPQ573128

טבלה 4: Fusarium spp. מבודדים מעדשים (Lens culinaris) ממחוז יוזגט, מרכז טורקיה ששימשו במחקר הפילוגנטי.

מיני פוסריוםלבודדמדינהמקור בידודמספר ההצטרפות של GenBank
פ. אקומינאטוםAAG4לא ישיםPrunus persicaOR975902
WHWNSHJ1סיןMalus domesticaPP336553
פ. אקוטאטוםסי.בי.אס 739.97הודולא ישיםMH862669
NSF1מצריםטטרנה אלבהPP038127
ו. קולמורום2090הודולא ישיםKC577191
G49פוליןPisum sativumMH681147
F. equisetiFusarium equiseti א577סיןפצ'וליKX463031
Fusarium equiseti א571סיןפצ'וליKX463025
פ. גרמינרוםWm-233סיןלא ישיםMZ267014
טז אלא ישיםלא ישיםKY272768
ו. אוקסיספורוםYBUFoc4טורקיהCicer arietinumOQ954786
לוק-8סיןחרצית x morifoliumPQ481995
F. proliferatumסי.בי.אס 246.61גרמניהלא ישיםMH858039
סי.בי.אס 186.56לא ישיםלא ישיםMH857573
F. pseudograminearumWZ-8AסיןחיטהJN862235
GAAET080סיןתירסOK017464
ו. רדולנסM11לא ישיםפטריהFJ441013
2008לא ישיםפטריהFJ467370
פ. סולאניעונה 2-27צרפתלא ישיםJX537966
UENFCF279ברזילגויאבהJN006818

טבלה 5: רצפים של מיני Fusarium ששימשו מ-GenBank במחקר פילוגנטי.

מיני פוסריוםלבודדחומרת המחלה (%) ארמת האלימות של הבידודבידוד מחדש (%)
(ממוצע ± שגיאת תקן)
ו. אוקסיספורוםYBUFol120. 0 ± 1.1 iחלש62.5
YBUFol256.9 ± 1.2 cdeלמדי85
YBUFol342.5 ± 1.0 EFGפחות77.5
YBUFol473.1 ± 3.9 ABמאוד90
ו. קולמורוםYBUFc172.5 ± 1.0 ABמאוד95
YBUFc272.5 ± 2.7 abמאוד95
YBUFc323.6 ± 1.6 הייחלש60
YBUFc448.1 ± 2.6 איכותפחות77.5
פ. סולאניYBUFs158.8 ± 1.6 BCDלמדי97.5
YBUFs246.9 ± 2.1 איכותפחות75
YBUFs317.5 ± 2.3 iחלש65
YBUFs436.3 ± 1.6 FGHפחות80
פ. אקומינאטוםיבופ142.5 ± 2.3 EFGפחות65
יבופ216.9 ± 2.8 iחלש42.5
יבופ330.6 ± 6.1 הייפחות62.5
YBUFa444.1 ± 7.1 דפפחות67.5
פ. גרמינרוםYBUFg176.3 ± 2.2 אמאוד97.5
YBUFg250.6 ± 3.3 באיכותלמדי92.5
YBUFg368.1 ± 2.1 ABCלמדי95
YBUFg435.6 ± 1.9 FGHפחות87.5

טבלה 6: בדיקות פתוגניות של מיני פוסריום על צמחי עדשים. ממוצע מבודדים <10% = לא אגרסיבי; 11%-25% = אגרסיבי חלש; 26%-50% = פחות אגרסיבי; 51%-70% = אגרסיבי בינוני; >70% = אגרסיבי מאוד. א הבדל סטטיסטי בין מבודדים על פי מבחן Tukey HSD (עמ' < 0.05).

Discussion

ידוע כי נבילת פוסריום גורמת לאובדן תשואה כלכלי חמור בחלקים מסוימים של העולם31. המחלה דווחה לראשונה בהונגריה32 ומאוחר יותר דווחה במדינות רבות כמו מצרים, הודו, מיאנמר, נפאל, פקיסטן, טורקיה, סוריה וארה"ב33. Kumar et al.34 דיווחו על תפוצה רחבה של נבילת עדשים, שורש וריקבון צווארון שורש עם דיווחים על התרחשות בלפחות 26 מדינות ברחבי העולם. במחקר שנערך לאחרונה, בודדו 12 מיני פטריות מצמחי עדשים חולים שנאספו ממדינות שונות בהודו, ו-F. oxysporum f. sp. lentis זוהה כפתוגן החשוב ביותר (30%), ואחריו Rhizoctonia bataticola (17.5%) ו-Sclerotium rolfsii (15.7%)31. באופן דומה, במחקר הנוכחי, סוג הפטרייה המבודד בתדירות הגבוהה ביותר היה Fusarium (95.4%). על פי Zitnick-Anderson et al.7, Fusarium (50%) היה סוג הפטרייה הדומיננטי שגרם לריקבון נבול, שורש ושורש במטעי עדשים בצפון דקוטה. הם גם דיווחו כי F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. equiseti, F. acuminatum, F. graminearum, F. redolens ו-F. avenaceum הם פתוגנים בסוג זה.

המאפיינים המורפולוגיים של חמשת מיני הפוסריום שזוהו במחקר זה היו דומים לאלה של מחקרים אחרונים35. על פי Rathod et al.36, מבודדי F. oxysporum דיווחו שהם הראו התפתחות מחיצה, מסועפת, בתחילה לבנה, ולאחר מכן התפתחות מושבה מוגבהת או שקועה על PDA, שהפכה לצבועה בפיגמנטציות שונות. באופן דומה, במחקר הנוכחי, מבודדי F. oxysporum יצרו בתחילה מושבות לבנות, מאוחר יותר צהובות, סגולות או ורודות. מצד שני, כלמידוספורים בצורת שתיים או שלוש שרשראות, ששימשו כקריטריון מורפולוגי לזיהוי מבודדים של F. oxysporum , נצפו במושבות שהיו בנות כ -30 יום. למעשה, אנדס15 דיווח כי כלמידוספורים של מבודדי F. oxysporum שהוחזקו במשך >30 יום שהושגו היו בעלי נטייה גבוהה יותר להדביק צמחים באזורי גידול חומוס במחוז יוזגת נצפו בדרך כלל בסביבות ישנות.

ריקבון שורש פוסריום בחומוס ובעדשים נגרם על ידי מינים רבים של פוסריום, כגון F. solani, F. oxysporum ו-F. graminearum37. כפי שדווח על ידי דין ואחרים 38, F. graminearum ו- F. oxysporum הם בין הפתוגנים הפטרייתיים המבודדים ביותר על ידי מיקולוגים של צמחים ברחבי העולם. עם זאת, Aydın et al.6 דיווחו כי F. graminearum הוא בין הגורמים הגורמים לריקבון נבול, שורש וכתר באזורי גידול עדשים באזור דרום מזרח אנטוליה בטורקיה. בנוסף, F. graminearum ידוע כגורם לריקבון שורש וכתר בעדשים במדינת דקוטה הצפונית, ארה"ב7.

פלטשר ואחרים דיווחו כי לעתים רחוקות ניתן לבודד את F. culmorum כפתוגן באזורי גידול עדשים. בנוסף, במחקר שנערך לאחרונה על ידי Zitnick-Anderson et al.7, דווח כי F. culmorum קשור לריקבון נבול, שורש ושורש בצמחי עדשים. עם זאת, Aydın et al.6 זיהו מינים רבים של Fusarium הגורמים לנבילה וריקבון שורשים באזורי גידול עדשים, אך לא דיווחו על F. culmorum כפתוגן. מצב זה, השונה מהמחקר הנוכחי, עשוי לנבוע ממספר האזורים השונים שנסקרו או מתמיכה במחקרים מורפולוגיים בשיטות מולקולריות במחקר הנוכחי.

Zitnick-Anderson et al.7 דיווחו כי F. acuminatum הוא בין מיני הפוסריום הגורמים לנבילה ולריקבון שורשים וצווארון שורשים בשדות עדשים בצפון דקוטה. מצד שני, Aydın et al.6 תיעדו כי F. solani הוא בין הגורמים הגורמים לנבילה וריקבון שורשים באזורי גידול עדשים. ידוע גם כי F. solani מבודד מאזורי גידול עדשים כפתוגן חלש7.

מיני פוסריום הם טפילים פקולטטיביים. זיהומים עקב הסוג Fusarium בעדשים עלולים לגרום להרס מוחלט של צמחים, במיוחד בטמפרטורות קיצוניות בסוף האביב או בתחילת הקיץ. אל-אחמד ומוסלי40 דיווחו כי F. oxysporum ו-F. solani גרמו לתסמיני הצהבה, נשירת עלים והתייבשות במטעי עדשים בדרום סוריה. F. solani גורם לריקבון שורשים ומחלות נבילה במרכז אנטוליה, כולל Yozgat16. בנוסף, כמה מינים אחרים של פוסריום נמצאו גם הם פתוגניים בשיעורים מסוימים. Zitnick-Anderson et al.7 דיווחו כי מחלת נבילת Fusarium נגרמת על ידי Fusarium oxysporum f. sp lentis, אך מיני F. culmorum, F. solani, F. graminearum יכולים גם לגרום למחלת נבילה על פי מאפיינים מורפולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים. בנוסף, פלטשר ואחרים דיווחו כי ל-F. acuminatum, הגורם לנבילה ולריקבון שורשים בעדשים, יש אלימות חלשה או נמוכה.

המחקר גילה כי 95.4% מבודדי הפוסריום שהתקבלו משדות העדשים שנבדקו היו מיני פוסריום והיו בעלי שכיחות של 1.6% - 26.4% וחומרת מחלה של 14.4% - 45.2% בצמחי עדשים. תנאי אקלים שליליים כמו חום חם ויבש באביב ובתחילת הקיץ מחלישים את צמיחת הצמחים והופכים את הצמחים לרגישים למיני פוסריום . רוב מיני הפוסריום הם פתוגנים חלשים, וכאשר תנאי הסביבה מחלישים את הצמח המארח, הם גורמים לעלייה בנבילת הפוסריום , במיוחד בתנאי בצורת.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מרכז הבקשה והמחקר לתיאום פרויקטים של אוניברסיטת בוזוק, יחידת BAP עם מספר פרויקט FÇD-2022-1096. מחקר זה הוא חלק ממחקר הדוקטורט של Sevim Atmaca.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(S)-lactic acidMerck100366Was used as an antibiotic in studies.
2-propanolMerck109634Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)Eppendorf ResearchLB.EP.3123000012Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)Eppendorf ResearchLB.EP.4924000916Used to measure small volumes of liquids.
AgarMerck110453For use in making fungal media.
AgaroseSigma-Aldrich18300012For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room?klimlabWas used to grow plants under controlled conditions.
AmpisilinSigma-AldrichA9393Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balanceShimadzu ATX224Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizerZealway GF-120DRIt was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscopeLeica DM750For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinetHFsafe Class II A2To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
CentrifugalDLAB DM1424LB.DL.903001124Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
ChloramphenicolSigma-Aldrich220551Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer setSigma-AldrichZ165220It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slideISOLAB075.01.006 / 075.02.005Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrateMerck108342For use in making fungal media.
DFC450 with digital cameraLeicaDigital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope LeicaMIC5246Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresisthermo fisher scientificB2-UVT
Dna gel loading dye (6x)Thermo ScientificR0611For use in molecular diagnostics.
dNTP mixThermo ScientificR0192Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)Thermo ScientificK1082For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatuleISOLAB082.03.001It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta Thermo Scientific17892For use in molecular diagnostics.
EthanolMerck100983Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE6758Used in molecular studies.
Filter paperISOLAB107.58.158Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinetZHICHENG ZXDS-A-1090For use in incubation processes.
Fume hoodElektromag EM1201LB.EM.EM1201It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging systemSyngene G:BOX Chemi XX6For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladderThermo ScientificSM0372For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acidMerck1005706Used in molecular studies.
GlycerolMerck104094For use in stock culture of fungi.
LancetISOLAB048.50.002Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chlorideSigma-Aldrich814733Used in molecular studies.
Measuring tapeISOLAB016.07.500Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubesISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003Used to store different volumes of liquids.
PCR tubeISOLAB123.01.002It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishesISOLAB120.13.090For use in growing fungus culture.
Pipette tipsISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bagISOLAB039.30.005Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic potToXAWas used for growing plants.
Pliers, clampsISOLAB048.08.130It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortarISOLAB038.02.150Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agarCondalab1022For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water systemhuman CORPORATIONLT.HC.NHP009Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)VestelFor use in the storage of stock materials.
RifampicinSigma-Aldrich557303Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetateMerck106268Used in molecular studies.
Sodium chlorideMerck1064041000Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich436143Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solutionMerck105614Used for surface disinfection.
SpatulaISOLAB047.33.210It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfateBioShop CanadaSTP101To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pureTekkimTK.200650For use as a disinfectant in all stages of work.
TetrasiklinSigma-AldrichT3258Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCRBio?Rad T100For use in genomic analyses.
Thoma lamISOLAB075.03.002For use in spore counting.
Tris HCLRoche10812846001Used in molecular studies.
TrizmaSigma-AldrichT1503Used in molecular studies.
Tween 80Merck822187For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteksVelp WIZARDLB.VLP.F202A0175Used to mix substances in liquid volumes.
Water bathsMemmert WNB 221018-5702It was used during incubation in dna extraction studies.

References

  1. Skrzypkowski, W., Kiełkowska, A. Current status of haploidization in cool-season grain legume crop species. Agriculture. 14 (7), 1031 (2024).
  2. Liber, M., Duarte, I., Maia, A. T., Oliveira, H. R. The history of lentil (Lens culinaris subsp. culinaris) domestication and spread as revealed by genotyping-by-sequencing of wild and landrace accessions. Front Plant Sci. 12, 628439 (2021).
  3. . FAOSTAT Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data (2022)
  4. TÜİK. . Agricultural statistics report. , (2023).
  5. Baxevanos, D., et al. Lentil cultivar evaluation in diverse organic mediterranean environments. Agronomy. 14 (4), 790 (2024).
  6. Aydın, M., Koç, M., Sağır, A. Investigations on determination of soilborne fungal pathogens causing root rot, crown rot and wilt on lentil in Southeast Anatolia Region. Plant Protect Bulletin. 44 (1), 93-103 (2004).
  7. Zitnick-Anderson, K., et al. Fusarium species associated with root rot of lentil (Lens culinaris) in North Dakota. Plant Health Prog. 22 (4), 524-528 (2021).
  8. Kushwaha, D. A. . A research book of seed mycoflora of chickpea (Cicer arietinum). , (2020).
  9. Ekwomadu, T. I., Mwanza, M. Fusarium fungi pathogens, identification, adverse effects, disease management, and global food security: A review of the latest research. Agriculture. 13 (9), 1810 (2023).
  10. Jiskani, A. M., et al. A destructive disease of lentil: Fusarium wilt of lentil. Plant Arch. 21 (1), 2117-2127 (2021).
  11. Alisaac, E., Mahlein, A. K. Fusarium head blight on wheat: biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins. 15 (3), 192 (2023).
  12. Yang, F., et al. Effects of rhizosphere microbial communities on cucumber Fusarium wilt disease suppression. Microorganisms. 11 (6), 1576 (2023).
  13. Kumari, N., Katoch, S. Wilt and root rot complex of important pulse crops: their detection and integrated management. Management of Fungal Pathogens in Pulses. Fungal Biology. , (2020).
  14. Köppen, W., Geiger, R. . Handbuch der klimatologie. , (1936).
  15. Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (2005).
  16. Endes, A. Occurrence and distribution of Chickpea root rot and wilt disease in Yozgat Kırşehir and Kırıkkale Provinces. Çukurova J Agri Food Sci. 38 (2), 284-298 (2023).
  17. Choi, Y. W., Hyde, K. D., Ho, W. H. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 29-38 (1999).
  18. Baskarathevan, J., Jaspers, M. V., Jones, E. E., Ridgway, H. J. Evaluation of different storage methods for rapid and cost effective preservation of Botryosphaeria species. New Zealand Plant Protect. 62, 234-237 (2009).
  19. Dikilitaş, M., Katırcıoğlu, Z., Altınok, H. Latest developments and methods on long-term storage, protection, and recycle of fungi and fungal material. JAgric Fac HR U. 15 (1), 55-69 (2011).
  20. Bora, T., Karaca, &. #. 3. 0. 4. ;. . Measurement of disease and damage in cultivated plants. , (1970).
  21. Öğüt, E. . Pathogenic and molecular characterization of some Fusarium spp. causing root rot and wilt on lentil with determination of variety reactions in south eastern Anatolia. , (2015).
  22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium Laboratory manual. , (2006).
  23. Cenis, J. L. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. Nuc Acids Res. 20 (9), 2380 (1992).
  24. Aras, S., Endes, A. Effect of Fusarium oxysporum infection on strawberry under calcium, iron, and zinc deficiency conditions. Zemdirbyste-Agri. 110 (1), 71-78 (2023).
  25. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc A Guide Metho Appl. , 315-322 (1990).
  26. Endes, A. Characterization and pathogenicity of Botryosphaeriaceae species associated with Gummosis, Dieback, Trunk and Branch Cankers of almond trees in Türkiye. J Agri Sci. 30 (4), 698-711 (2024).
  27. Gordon, T. R., Okamoto, D., Jacobson, D. J. Colonization of muskmelon and non-susceptible crops by Fusarium oxysporum f. sp. melonis and other species of Fusarium. Phytopathology. 79 (10), 1095-1100 (1989).
  28. Xu, X., et al. Fusarium species associated with maize leaf blight in Heilongjiang Province, China. J Fungi. 8 (11), 1170 (2022).
  29. Fonseca-Guerra, I. R., Chiquillo-Pompeyo, J. C., Benavides Rozo, M. E., Díaz Ovalle, J. F. Fusarium spp. associated with Chenopodium quinoa crops in Colombia. Sci Rep. 12 (1), 20841 (2022).
  30. Khan, M. F., et al. First report of damping-off and seedling rot of Hemp (Cannabis sativa) caused by Fusarium solani in North Dakota, U.S.A. Plant Dis. 107 (1), 232 (2023).
  31. Chaudhary, R. G., Saxena, D. R., Dhar, V., Singh, R. K., Namdev, J. K. Prevalence of wilt-root rot and their associated pathogens at reproductive phase in lentil. Arch Phytopathol Plant Protect. 43 (10), 996-1000 (2010).
  32. Fleischmann, R. Some observations on Maize smut in Hungary. Pflanzenbau. 14 (5), 199-206 (1937).
  33. Bedasa, T. . Distribution and management of Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. lentis) of lentil (Lens culinaris Medikus) in Central Highlands of Ethiopia. , (2018).
  34. Kumar, S., et al. Vascular wilt disease of lentil: A review. J Lentil Res. 4, 1-14 (2010).
  35. Chenari, S., Abbasi, S., Chehri, K. Phylogeny and host specificity of Fusarium solani species complex isolated from chickpea, lentil and common bean. Arch Phytopathol Plant Protect. , 1-15 (2024).
  36. Rathod, A., et al. Isolation of causal organism of wilt and collar rot of lentil and its pathogenicity tests. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 10 (12), 276-282 (2021).
  37. Hayit, T., Endes, A., Hayit, F. The severity level classification of Fusarium wilt of chickpea by pre-trained deep learning models. J Plant Pathol. 106 (1), 93-105 (2024).
  38. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (4), 414-430 (2012).
  39. Fletcher, J. D., Broadhurst, P. G., Bansal, R. K. F. avenaceum: A pathogen of lentil in New Zealand. New Zealand J Crop Horticultural Sci. 19 (2), 207-210 (1991).
  40. Al Ahmad, M., Mouselli, N. Wilt and root rot of lentis. Lens. 14 (1/2), 27-31 (1987).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE218ITSNCBILens culinaris

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved