Colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral antes da oclusão da artéria cerebral média em modelos de roedores

Um procedimento cirúrgico minimamente invasivo é mostrado aqui, que envolve a colocação da sonda Doppler a laser no crânio sobre a região distal da artéria cerebral média (ACM), um local periorbital adequado para ratos e camundongos, para avaliar o fluxo sanguíneo durante a oclusão transitória da ACM.

A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o método padrão-ouro para modelagem pré-clínica de AVC isquêmico em roedores. No entanto, a oclusão bem-sucedida não é garantida nem mesmo pelas mãos cirúrgicas mais habilidosas. Os erros ocorrem principalmente quando o filamento não é colocado na profundidade correta e incluem casos de ausência de infarto ou perfuração do vaso, o que pode causar a morte. A fluxometria Doppler a laser (LDF) é uma técnica confiável que fornece feedback em tempo real sobre o fluxo sanguíneo cerebral regional (CBF) durante o procedimento MCAO. Aqui demonstramos uma técnica rápida para colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para medição de CBF em camundongos e ratos. Nossa justificativa era simplificar a implementação do LDF, incentivando o uso generalizado para melhorar a confiabilidade cirúrgica. A técnica elimina a necessidade de afinamento do crânio e equipamentos especializados, com colocação na região periorbital em vez de colocação dorsal, promovendo eficiência e facilidade de adoção. O protocolo descrito aqui engloba preparações pré-cirúrgicas, colocação de sonda Doppler periorbital e cuidados pós-operatórios. Os resultados representativos incluem representações visuais de elementos processuais, juntamente com traçados representativos de LDF ilustrando cirurgias MCAO bem-sucedidas, com casos de colocação malsucedida de filamentos levando a complicações. O protocolo ilustra o LDF na confirmação da colocação adequada do filamento e oferece um procedimento simplificado em comparação com métodos alternativos.

O método de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) tem sido amplamente utilizado em roedores desde que foi introduzido na comunidade científica para aplicação em ratos em 1986¹ com a adaptação de Longa descrita em 1990² e adaptações para camundongos logo após³. Embora não descrito na publicação de Longa, o uso do sinal de fluxometria com Doppler a laser (LDF) para confirmar a colocação do filamento foi logo descrito na literatura⁴. O emprego de LDF durante o procedimento MCAO é destaque na literatura, mas é designado como uma etapa opcional nos atuais Procedimentos Operatórios Padrão (SOPs) das Redes de Avaliação Pré-clínica de AVC (SPAN)⁵.

O uso de LDF confirma a colocação correta do filamento durante o procedimento MCAO e, portanto, contribui para o rigor do desenho do estudo e resultados subsequentes, particularmente em experimentos projetados para explorar a eficácia do medicamento. O uso de LDF reduz os erros cirúrgicos decorrentes da colocação incorreta do filamento, o que resulta na situação dicotômica de nenhuma lesão quando o filamento não é colocado longe o suficiente ou mortes de animais devido à perfuração do vaso que ocorre quando o filamento é inserido muito longe. Por outro lado, o uso de LDF não está associado à variabilidade do tamanho do infarto comumente observada após o procedimento MCAO⁶. O uso de LDF no procedimento MCAO pode ser percebido como difícil e oneroso, particularmente em ratos, porque o crânio é mais espesso do que em camundongos e pode exigir afinamento do crânio antes da colocação de LDF ^7,8. Além disso, a colocação da sonda dorsal é frequentemente descrita com alguns protocolos que requerem equipamento especializado ou preparação ^7,8,9. Com qualquer uma dessas barreiras, a implementação do LDF para confirmar a colocação do filamento pode não ocorrer.

Neste protocolo, descrevemos a colocação da sonda laser Doppler no crânio e sobre a região distal da artéria cerebral média - uma colocação periorbital - para a avaliação do fluxo sanguíneo durante o procedimento MCAO em camundongos e ratos. Nosso raciocínio foi desenvolver um procedimento que tenha múltiplas vantagens sobre alguns métodos relatados na literatura 7,8,9,10, pois é minimamente invasivo, rápido e não requer afinamento craniano ou equipamento especializado além da sonda Doppler a laser.

Camundongos e ratos adultos foram usados para ilustrar este protocolo (25 g, C57BL / 6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). O manejo dos animais e os procedimentos experimentais foram realizados com aprovação e em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona, leis nacionais e de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório¹¹. Ratos e camundongos foram alojados em um horário claro/escuro de 12 h (7h-19h) com comida e água disponíveis ad libitum.

1. Preparação pré-cirúrgica

NOTA: Normalmente, a cirurgia MCAO em um roedor é realizada como uma cirurgia de sobrevivência, necessitando do uso de uma técnica cirúrgica asséptica ou apenas de pontas, conforme descrito em um protocolo IACUC específico da instituição. Nesse caso, o cirurgião usa uma técnica somente de dicas com instrumentos e suprimentos esterilizados.

1. Desinfete a superfície de trabalho cirúrgico com desinfetante comercial e prepare pacotes cirúrgicos estéreis de instrumentos, cortinas, gaze, cotonetes, suturas e lâminas de bisturi em autoclavagem. Manter condições estéreis durante a cirurgia de sobrevivência de acordo com as técnicas aprovadas pela IACUC, como cobrir botões de microscópio e cortinas com filme plástico de qualidade alimentar.
2. Use um esterilizador de esferas secas germinador para reesterilizar os instrumentos cirúrgicos entre os procedimentos se várias cirurgias de roedores forem realizadas durante uma sessão.
3. Coloque o rato ou camundongo em uma câmara de indução e induza a anestesia com 3%-5% de isoflurano (1 L/min usando uma mistura combinada de 80% de ar e 20% de oxigênio).
4. Mova o animal da câmara para a bancada e o nariz para anestesia (camundongo: 0,5 L / min 80% / 20% de mistura de oxigênio / ar; rato: 1,5 L / min 80% / 20% de mistura de oxigênio / ar). Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos e raspe cuidadosamente o espaço entre a orelha e a órbita ocular na lateral da cirurgia MCAO (geralmente a direita), para não cortar a pele com um aparador. No rato, quando raspado, a covinha do bigode será visível aproximadamente a meio caminho entre a órbita ocular e a orelha. Continue a raspar as regiões conforme necessário para o procedimento MCAO⁹ (não no escopo deste artigo).
5. Volte o animal para a câmara conforme necessário ou coloque-o num nariz na mesa cirúrgica preparada, aquecido a 37 °C. Insira um termômetro retal. O animal deve ser mantido a aproximadamente 36 °C ± 1 °C durante todo o procedimento e de acordo com o protocolo IACUC aprovado.
6. Aplique betadine em um cotonete e desinfete a pele, espiralando para fora do centro da região cirúrgica. Limpe com uma almofada de preparação de álcool. Repita as duas etapas para um total de três ciclos. Confirme a anestesia adequada e avalie a cada 15 minutos durante o procedimento usando o refluxo de pinça do dedo do pé.

2. Colocação da sonda Doppler periorbital

1. Com uma tesoura pequena, faça um corte vertical (camundongo: ~ 0,5 cm; rato: ~ 0,7 cm) entre o canto do olho e a dobra da orelha, conforme mostrado na Figura 2A (camundongo) e na Figura 3A (rato) para expor o super fácio e o músculo subjacente.
   NOTA: Trate a dor no pré-operatório de acordo com a aprovação do protocolo IACUC.
2. Usando uma pinça afiada e uma tesoura curva, corte cuidadosamente a camada muscular até que o crânio seja alcançado. O crânio será plano e difícil de tocar com a ponta da pinça. Esta é a janela na qual a sonda Doppler a laser ficará, conforme visualizado na Figura 2B.
3. Use uma ferramenta de cautério com fórceps para coagular o sangue emergente, alargar a janela e garantir a rota para o crânio.
4. Assim que a janela estiver aberta, seque com cotonetes para remover o excesso de sangue conforme necessário.
   Coloque o camundongo ou rato em decúbito dorsal.
5. Use uma pinça para retrair qualquer pele ou tecido e coloque a sonda Doppler na janela periorbital de modo que ela encoste no crânio perpendicularmente sem pele ou músculo presente para impedir o sinal do laser. Esta região está sobre a ACM distal, conforme ilustrado na Figura 1A,B. Prenda a colocação da sonda com fita adesiva de laboratório. Neste protocolo, é descrito o uso de uma sonda reta.
   NOTA: Reconhecemos que os protocolos de cirurgia variam entre os laboratórios. Na literatura (quando relatada), alguns trituram o crânio e outros não⁹. Pode ser porque o crânio é mais fino na região periorbital, mas isso é apenas especulação. Em nossa experiência, a colocação direta sem trituração pode ser alcançada em camundongos e ratos e é demonstrada neste protocolo.
6. Monitore as leituras relativas do fluxo sanguíneo no monitor com o software apropriado (Figura 2D, Figura 3C,D). As leituras do LDF variam. No entanto, a faixa ideal para detecção de quedas de fluxo sanguíneo é de >200 unidades de perfusão (UP).
7. Prossiga para a cirurgia MCAO⁹ (não no escopo deste artigo). Durante a cirurgia MCAO, teste a colocação da sonda amarrando brevemente a artéria carótida comum, o que deve causar uma queda repentina no fluxo sanguíneo (~ 50%).

3. Remoção da sonda Doppler e cuidados pós-operatórios

1. Na conclusão do MCAO ou sempre que as leituras do fluxo sanguíneo forem concluídas, remova a sonda Doppler a laser da janela cirúrgica. A sonda Doppler normalmente permanece no lugar durante a cirurgia MCAO do camundongo porque os tempos de isquemia geralmente são inferiores a 90 min. Por outro lado, no procedimento MCAO de rato, a sonda Doppler pode ser removida após a colocação do filamento e durante a isquemia (normalmente > 90 min) e, em seguida, colocada novamente na janela periorbital para confirmar a reperfusão, repetindo as etapas 2.6 e 2.7.
   NOTA: Um rastreamento contínuo LDF típico do MCAO do camundongo pode ser observado na Figura 4A. Os traçados típicos de LDF de um procedimento MCAO de rato são ilustrados na Figura 4B.
2. Injete anestésico local aprovado pela IACUC por via subcutânea ao longo do local da incisão prospectiva.
3. Feche a pele com 1-2 suturas usando um nó cirúrgico padrão com fio de sutura absorvível ou cola cirúrgica, de acordo com o protocolo IACUC aprovado. Trate a dor pós-cirúrgica de acordo com a aprovação do protocolo IACUC (por exemplo, bupivacaína HCL 0,5% e lidocaína 2%, uma vez intra-incisão para camundongos e ratos). Os animais não devem ser deixados sozinhos até que sejam capazes de manter a decúbito esternal, e nenhum animal é devolvido à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

A colocação da sonda Doppler a laser na região da ACM é representada visualmente na Figura 1, oferecendo um pictograma da vasculatura e servindo como um guia visual das perspectivas sagital e dorsal. A Figura 2 resume as etapas críticas para a colocação e os resultados da sonda Doppler a laser no mouse. A Figura 2A apresenta uma imagem de um camundongo anestesiado e preparado com uma marcação tracejada no local da incisão vertical necessária para a colocação subsequente da sonda Doppler a laser. A janela periorbital para o crânio é ilustrada na Figura 2B.

A Figura 3 resume a colocação da sonda Doppler a laser no rato. A Figura 3A mostra a imagem de um rato anestesiado e preparado com uma marcação tracejada no local da incisão vertical necessária para a colocação da sonda Doppler a laser subsequente. A janela periorbital não pode ser visualizada porque é mais profunda que o mouse. Nesse caso, o crânio pode ser sentido, conforme mencionado na etapa 2.3. A sonda Doppler a laser colocada na região periorbital do rato supino é mostrada na Figura 3B.

Um rastreamento LDF típico durante o procedimento MCAO do camundongo é mostrado na Figura 4A. Ele ilustra uma indução bem-sucedida de isquemia, evidenciada por uma queda distinta e imediata no fluxo sanguíneo cerebral relativo (FSC) quando a artéria carótida é amarrada e novamente quando o filamento é avançado para o óstio da ACM. O início da reperfusão é mostrado no final do traçado, evidenciado por um aumento distinto e imediato do FSC relativo quando a artéria carótida é desamarrada e novamente quando o filamento é retirado da ACM. Uma leitura típica de LDF de isquemia durante a cirurgia MCAO de rato é mostrada na Figura 4B, que mostra uma indução bem-sucedida de isquemia seguida de remoção da sonda e recolocação para medição de LDF durante a reperfusão. Na cirurgia de ratos, os tempos de isquemia podem ser superiores a 60 min, e os animais podem se recuperar durante o período de isquemia e devem ser reanestesiados para reperfusão. Nesse caso, a sonda é reposicionada na janela periorbital e os traçados LDF são continuados. A isquemia é evidenciada no traçado por uma queda distinta e imediata do FSC relativo quando a artéria carótida é amarrada e o filamento avançado para o óstio da ACM. A reperfusão é evidenciada no segundo traçado do LDF por um aumento distinto e imediato do FSC relativo, após o qual a artéria carótida é desamarrada e, novamente, quando o filamento é retirado do óstio da ACM. O Doppler periorbital está posicionado sobre o ramo distal da ACM e, portanto, dentro do escopo da distribuição sanguínea da ACM, com uma diminuição observada no FSC, evidenciada pela redução do fluxo sanguíneo durante o procedimento da ACCM, ilustrada na Figura 4.

Mostramos traçados de LDF que exemplificam cirurgias MCAO malsucedidas na Figura 5. A Figura 5A resume um traçado de LDF de uma cirurgia de rato com uma oclusão carotídea bem-sucedida que mais tarde se soltou e uma colocação de filamento malsucedida, marcada por uma queda lenta no FSC relativo. Esse padrão de LDF é tipicamente associado a uma ACM perfurada que pode ser confirmada com necropsia. Outro traçado de uma cirurgia MCAO em camundongos (Figura 5B) ilumina a oclusão inconclusiva da artéria carótida que provavelmente contribuiu para a incapacidade de detectar a colocação do filamento nos óstios da MCA. Suspeitou-se de perfuração da ACM porque, quando o filamento foi ligeiramente retirado, o FSC relativo exibiu recuperação lenta. Esses exemplos destacam o papel crítico dos traçados LDF na identificação de cirurgias MCAO bem-sucedidas versus malsucedidas e destacam a importância de procedimentos cirúrgicos meticulosos e medidas para resultados experimentais confiáveis.

Figura 1: Pictograma da colocação aproximada da sonda Doppler a laser em relação à MCA. Esquema da colocação da sonda Doppler a laser a partir de uma visão sagital (A) e (B) dorsal. Criado com Biorender.com; KT26JWLYF6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ilustração das etapas da cirurgia para colocação da sonda Doppler a laser no camundongo. (A) Imagem da localização da incisão vertical necessária para a colocação da sonda Doppler a laser com o mouse em decúbito dorsal. (B) Imagem da janela periorbital e do crânio preparada por fórceps e/ou tesoura no camundongo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ilustração das etapas da cirurgia para colocação de sonda Doppler a laser no rato. (A) Imagem da localização da incisão vertical necessária para a colocação da sonda Doppler a laser com o rato em decúbito dorsal. (B) Colocação da sonda Doppler a laser na região periorbital no rato supino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos de traçados de LDF confirmando o procedimento MCAO bem-sucedido em camundongos e ratos. (A) Leitura de LDF da região MCA durante o procedimento MCAO de camundongos. Este rastreamento ilustra a confirmação de 1. oclusão da artéria carótida com amarração; 2. colocação de filamentos no MCA; 3. remoção do filamento após 60 min de isquemia contínua; e 4. reperfusão quando a artéria carótida está desatada. Os elementos a. e b. ilustram como é o traçado Doppler quando a carótida é desamarrada e amarrada novamente durante a leitura. Esta técnica pode ser usada para confirmar o posicionamento da sonda. (B) Leituras LDF da região MCA durante o procedimento MCAO de rato. Como o mouse, esse rastreamento ilustra a confirmação de 1. oclusão da artéria carótida com empate e 2. colocação de filamentos no MCA. No procedimento MCAO de ratos, a sonda Doppler é frequentemente removida e o animal passa todo o tempo de isquemia acordado e em movimento. Para a reperfusão, o LDF é restabelecido antes da reperfusão: 3. confirma a remoção do filamento e 4. confirma que a carótida está desvinculada da reperfusão completa. Nos procedimentos MCAO de camundongos e ratos, a colocação bem-sucedida da sonda é usada para visualizar a colocação correta do filamento e é indicada quando o traçado mostra duas diminuições distintas e repentinas no LDF (para isquemia) seguidas por dois aumentos distintos e repentinos no LDF (reperfusão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Exemplos de traçados de fluxometria Doppler a laser que indicam procedimentos MCAO malsucedidos no camundongo e no rato. (A) Um exemplo de um traçado LDF que indica uma colocação inconclusiva de filamento no rato. Enquanto a carótida estava amarrada (1.), solta (2.) e depois amarrada novamente (3.), há uma queda indistinta e lenta, em vez de uma queda repentina no LDF quando o filamento estava no MCA Ostia. Esse traçado pode indicar uma ACM perfurada, e o animal pode não sobreviver às primeiras 24 h de reperfusão; A perfuração do filamento pode ser confirmada com necropsia. (B) Um exemplo de um rastreamento LDF que indica uma colocação inconclusiva de filamento no mouse. Neste traçado, a evidência de vínculo carotídeo é inconclusiva (1.), seguida por uma queda indistinta no LDF com colocação de filamento nos óstios da ACM (2.). Além disso, quando o filamento foi ligeiramente retirado, o fluxo sanguíneo cerebral relativo aumentou lentamente (3.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O MCAO é o procedimento padrão-ouro para modelar a oclusão e reperfusão da artéria cerebral em roedores e tem sido a pedra angular da pesquisa pré-clínica de AVC, permitindo a indução de isquemia focal em roedores para mimetizar a fisiopatologia do AVC humano. É um procedimento cirúrgico exigente com significativa variabilidade inter e até intra-cirurgião. Embora não haja evidências de que a aplicação do LDF reduza a variabilidade, ela pode melhorar o rigor científico e os resultados do estudo em alguns projetos. Isso é feito porque o LDF valida a colocação do filamento e fornece informações em tempo real sobre o FSC durante a cirurgia, confirmando se ocorreu oclusão da ACM. Aproximadamente 75% dos estudos com camundongos descrevem o uso de uma sonda Doppler a laser^12,13, enquanto este não foi um parâmetro relatado em uma meta-análise de estudos com ratos¹⁴. Uma alternativa frequentemente utilizada ao LDF é medir a inserção do filamento (por exemplo, 18-20 mm da bifurcação da artéria carótida comum em ratos) usando filamentos marcados ou medir o filamento remanescente projetando-se do ponto de inserção (por exemplo, 10 mm)¹⁰. No entanto, essa alternativa é inferior ao LDF porque a profundidade exata de inserção do filamento pode variar um pouco dependendo de fatores como o tamanho e o peso do rato, bem como o protocolo específico usado no experimento. Tais diferenças são considerações essenciais para a reprodutibilidade da cirurgia MCAO, dado o risco de perfuração do vaso ou oclusão incompleta, ambos resultados cirúrgicos negativos.

Embora o LDF seja um método para validar a colocação do filamento e seja suportado pelo SPAN, não é uma etapa obrigatória no SPAN-SOP⁵ publicado. O protocolo descrito supera barreiras como o uso de equipamentos especiais e a difícil colocação de sondas em cortes dorsais do crânio quando o procedimento principal é realizado em um animal posicionado em decúbito dorsal; Esses fatores geralmente estendem os tempos cirúrgicos. Em contraste, este protocolo usa uma única sonda e monitor Doppler a laser reto, localização de colocação periorbital e nenhum afinamento do crânio. Quando combinadas, essas etapas resultam em um procedimento bastante simplificado e mais curto (geralmente menos de 5 minutos) - uma melhoria significativa em relação a métodos semelhantes, mas alternativos, descritos na literatura 7,8,9,10. Este protocolo também pode ser adaptado pelos cirurgiões, conforme necessário. A solução de problemas das técnicas descritas pode exigir e incluir o reposicionamento da sonda, especialmente se uma diminuição no fluxo sanguíneo não for observada na etapa 2.8.

O uso de LDF limita-se a confirmar a colocação do filamento e não tem sido associado à variabilidade do tamanho do infarto, que pode ser de >20% nos métodos de camundongos e ratos^12,14. A variabilidade do infarto tem sido um problema de longa data na pesquisa pré-clínica de AVC. Considerando que esse aumento da variabilidade pode mimetizar a diversidade de tamanhos de infarto observados na condição humana¹³, quando não devidamente contabilizada, a variabilidade observada pode resultar em estudos que não são adequadamente alimentados. Embora não haja um único fator que preveja a variabilidade do método, a confirmação da colocação é um fator importante para os estudos de eficácia do medicamento. O protocolo aqui descrito, embora possivelmente já empregado em procedimentos de MCAO em camundongos, pode ser subutilizado em ratos, dadas as descrições mais frequentes de posicionamento dorsal na literatura⁹. Acreditamos que esta descrição de uma colocação simplificada de sonda Doppler a laser contribui para refinar as metodologias de pesquisa pré-clínica de AVC, visando maior precisão experimental e relevância translacional.

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta pesquisa foi financiada pelo NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6

This corrects the article 10.3791/66839