Posizionamento periorbitale di una sonda laser Doppler per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale prima dell'occlusione dell'arteria cerebrale media in modelli di roditori

Qui viene mostrata una procedura chirurgica minimamente invasiva, che prevede il posizionamento della sonda laser Doppler sul cranio sopra la regione distale dell'arteria cerebrale media (MCA), una posizione periorbitale adatta a ratti e topi, per valutare il flusso sanguigno durante l'occlusione transitoria MCA.

L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è il metodo gold standard per la modellazione preclinica dell'ictus ischemico nei roditori. Tuttavia, il successo dell'occlusione non è garantito nemmeno dalle mani chirurgiche più esperte. Gli errori si verificano principalmente quando il filamento non è posizionato alla profondità corretta e includono casi di assenza di infarto o perforazione del vaso, che possono causare la morte. La flussimetria laser Doppler (LDF) è una tecnica affidabile che fornisce un feedback in tempo reale sul flusso sanguigno cerebrale regionale (CBF) durante la procedura MCAO. Qui dimostriamo una tecnica rapida per il posizionamento periorbitale di una sonda laser Doppler per la misurazione del CBF sia nei topi che nei ratti. La nostra logica era quella di semplificare l'implementazione di LDF, incoraggiando un uso diffuso per una migliore affidabilità chirurgica. La tecnica elimina la necessità di assottigliare il cranio e di attrezzature specializzate, con il posizionamento nella regione periorbitale piuttosto che nel posizionamento dorsale, promuovendo l'efficienza e la facilità di adozione. Il protocollo qui descritto comprende le preparazioni prechirurgiche, il posizionamento della sonda Doppler periorbitale e l'assistenza post-operatoria. I risultati rappresentativi includono rappresentazioni visive di elementi procedurali insieme a tracciati LDF rappresentativi che illustrano interventi chirurgici MCAO di successo, con casi di posizionamento non riuscito del filamento che hanno portato a complicanze. Il protocollo illustra l'LDF nel confermare il corretto posizionamento del filamento e offre una procedura semplificata rispetto ai metodi alternativi.

Il metodo dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è stato ampiamente utilizzato nei roditori da quando è stato introdotto nella comunità scientifica per l'applicazione ai ratti nel 1986¹ con l'adattamento Longa descritto nel 1990² e gli adattamenti per i topi subito dopo³. Sebbene non descritto nella pubblicazione di Longa, l'uso del segnale di flussimetria laser Doppler (LDF) per confermare il posizionamento del filamento è stato presto descritto in letteratura⁴. L'impiego di LDF durante la procedura MCAO è presente in modo prominente in letteratura, ma è designato come passaggio opzionale nelle attuali procedure operative standard (SOP) delle reti di valutazione preclinica dell'ictus (SPAN)⁵.

L'uso di LDF conferma il corretto posizionamento del filamento durante la procedura MCAO e, quindi, contribuisce al rigore del disegno dello studio e ai risultati successivi, in particolare negli esperimenti progettati per esplorare l'efficacia dei farmaci. L'uso di LDF riduce gli errori chirurgici derivanti da un posizionamento errato del filamento, che si traduce nella situazione dicotomica di assenza di lesioni quando il filamento non è posizionato abbastanza lontano o di morte di animali a causa della perforazione del vaso che si verifica quando il filamento viene inserito troppo lontano. D'altra parte, l'uso di LDF non è associato alla variabilità delle dimensioni dell'infarto comunemente osservata dopo la procedura MCAO⁶. L'uso di LDF nella procedura MCAO può essere percepito come difficile e oneroso, in particolare nei ratti, perché il cranio è più spesso rispetto ai topi e può richiedere l'assottigliamento del cranio prima del posizionamento di LDF ^7,8. Inoltre, il posizionamento della sonda dorsale è spesso descritto con alcuni protocolli che richiedono attrezzature o preparazione specializzate ^7,8,9. Con una qualsiasi di queste barriere, l'implementazione dell'LDF per confermare il posizionamento del filamento potrebbe non aver luogo.

In questo protocollo, descriviamo il posizionamento della sonda laser Doppler sul cranio e sulla regione distale dell'arteria cerebrale media - un posizionamento periorbitale - per la valutazione del flusso sanguigno durante la procedura MCAO sia nei topi che nei ratti. Il nostro razionale è stato quello di sviluppare una procedura che presentasse molteplici vantaggi rispetto ad alcuni metodi riportati in letteratura 7,8,9,10 in quanto è minimamente invasiva, veloce e non richiede assottigliamento del cranio o apparecchiature specializzate oltre alla sonda laser Doppler.

Per illustrare questo protocollo sono stati utilizzati topi e ratti adulti (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). Le procedure di manipolazione e sperimentazione degli animali sono state eseguite con l'approvazione e in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Arizona, le leggi nazionali e secondo i principi della cura degli animali da laboratorio¹¹. Ratti e topi sono stati alloggiati con un programma di 12 ore di luce/buio (7-19) con cibo e acqua disponibili ad libitum.

1. Preparazione prechirurgica

NOTA: Tipicamente, la chirurgia MCAO in un roditore viene eseguita come chirurgia di sopravvivenza, richiedendo l'uso di una tecnica chirurgica asettica o solo punte, come delineato in un protocollo IACUC specifico dell'istituto. In questo caso, il chirurgo utilizza una tecnica di sole punte con strumenti e forniture sterilizzati.

1. Disinfettare la superficie di lavoro chirurgica con disinfettante commerciale e preparare confezioni chirurgiche sterili di strumenti, teli, garze, tamponi, suture e lame di bisturi mediante sterilizzazione in autoclave. Mantenere le condizioni sterili durante la chirurgia di sopravvivenza secondo le tecniche approvate dall'IACUC, come la copertura delle manopole del microscopio e il drappeggio con pellicola di plastica per alimenti.
2. Utilizzare uno sterilizzatore a perline secche germinatore per risterilizzare gli strumenti chirurgici tra le procedure se vengono eseguiti più interventi chirurgici sui roditori durante una sessione.
3. Posizionare il ratto o il topo in una camera di induzione e indurre l'anestesia con isoflurano al 3%-5% (1 L/min utilizzando una miscela combinata di 80% di aria e 20% di ossigeno).
4. Spostare l'animale dalla camera al banco e all'ogiva per l'anestesia (topo: 0,5 L/min 80%/20% di miscela ossigeno/aria; ratto: 1,5 L/min 80%/20% di ossigeno/aria). Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi e radere accuratamente lo spazio tra l'orecchio e l'orbita oculare sul lato dell'intervento chirurgico MCAO (comunemente il destro), in modo da non tagliare la pelle usando il tagliacapelli. Nel ratto, una volta rasato, la fossetta dei baffi sarà visibile approssimativamente a metà strada tra l'orbita e l'orecchio. Continuare a radere le regioni secondo necessità per la procedura MCAO⁹ (non nell'ambito di questo documento).
5. Riportare l'animale nella camera secondo necessità o spostarlo su un ogiva sul tavolo operatorio preparato riscaldato a 37 °C. Inserire un termometro rettale. L'animale deve essere tenuto a una temperatura di circa 36 °C ± 1 °C per tutta la durata della procedura e secondo il protocollo IACUC approvato.
6. Applicare betadine su un batuffolo di cotone e disinfettare la pelle, a spirale verso l'esterno dal centro della regione chirurgica. Pulire con un tampone imbevuto di alcol. Ripetere entrambi i passaggi per un totale di tre cicli. Confermare la corretta anestesia e valutare ogni 15 minuti durante la procedura utilizzando il reflusso del pizzicamento delle dita.

2. Posizionamento della sonda Doppler periorbitale

1. Con piccole forbici, praticare un taglio verticale (topo: ~0,5 cm; ratto: ~0,7 cm) tra l'angolo dell'occhio e la piega dell'orecchio, come mostrato nella Figura 2A (topo) e nella Figura 3A (ratto) per esporre la super faccia e il muscolo sottostante.
   NOTA: Trattare il dolore prima dell'intervento secondo l'approvazione del protocollo IACUC.
2. Usando una pinza affilata e forbici ricurve, taglia con cura lo strato muscolare fino a raggiungere il cranio. Il cranio sarà piatto e difficile da toccare con la punta del forcipe. Questa è la finestra in cui si troverà la sonda laser Doppler, come visualizzato nella Figura 2B.
3. Usa uno strumento di cauterizzazione a pinza per coagulare il sangue che fuoriesce, allargare la finestra e garantire il percorso verso il cranio.
4. Una volta aperta la finestra, tamponare con tamponi di cotone per rimuovere il sangue in eccesso, se necessario.
   Posiziona il topo o il ratto in posizione supina.
5. Usa una pinza per ritrarre la pelle o il tessuto e posiziona la sonda Doppler nella finestra periorbitale in modo che si appoggi al cranio perpendicolarmente senza pelle o muscoli presenti per ostacolare il segnale laser. Questa regione si trova sopra l'MCA distale, come illustrato nella Figura 1A, B. Fissare il posizionamento della sonda con del nastro da laboratorio. In questo protocollo viene descritto l'uso di una sonda diritta.
   NOTA: Riconosciamo che i protocolli chirurgici variano da un laboratorio all'altro. In letteratura (quando riportato), alcuni macinano il cranio sottile e altri no⁹. Potrebbe essere perché il cranio è più sottile nella regione periorbitale, ma questa è solo una speculazione. Nella nostra esperienza, il posizionamento diretto senza macinazione può essere ottenuto nei topi e nei ratti ed è dimostrato in questo protocollo.
6. Monitorare le letture relative del flusso sanguigno sul monitor con un software appropriato (Figura 2D, Figura 3C,D). Le letture LDF possono variare. Tuttavia, l'intervallo ottimale per il rilevamento delle gocce di flusso sanguigno è di >200 unità di perfusione (PU).
7. Procedere all'intervento chirurgico MCAO⁹ (non nell'ambito di questo documento). Durante l'intervento chirurgico MCAO, testare il posizionamento della sonda legando brevemente l'arteria carotide comune, che dovrebbe causare un improvviso calo del flusso sanguigno (~50%).

3. Rimozione della sonda Doppler e assistenza post-operatoria

1. Al termine dell'MCAO o ogni volta che le letture del flusso sanguigno sono completate, rimuovere la sonda laser Doppler dalla finestra chirurgica. La sonda Doppler in genere rimane in posizione per tutta la durata dell'intervento chirurgico MCAO del topo perché i tempi di ischemia sono spesso inferiori a 90 minuti. D'altra parte, nella procedura MCAO di ratto, la sonda Doppler può essere rimossa dopo che il filamento è stato posizionato e durante l'ischemia (tipicamente > 90 minuti) e quindi posizionata nuovamente nella finestra periorbitale per confermare la riperfusione ripetendo i passaggi 2.6 e 2.7.
   NOTA: Nella Figura 4A si può osservare un tipico tracciamento continuo LDF dal MCAO del topo. I tipici tracciati LDF da una procedura MCAO di ratto sono illustrati nella Figura 4B.
2. Iniettare l'anestetico locale approvato da IACUC per via sottocutanea lungo il sito di incisione prospettico.
3. Chiudere la pelle con 1-2 punti di sutura utilizzando un nodo chirurgico standard con filo di sutura riassorbibile o colla chirurgica, secondo il protocollo IACUC approvato. Trattare il dolore post-chirurgico secondo l'approvazione del protocollo IACUC (ad es. bupivacaina HCL 0,5% e lidocaina 2%, una volta intra-incisione per topi e ratti). Gli animali non devono essere lasciati incustoditi fino a quando non sono in grado di mantenere la decubito sternale e nessun animale viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.

Il posizionamento della sonda laser Doppler nella regione MCA è illustrato visivamente nella Figura 1, offrendo un pittogramma della vascolarizzazione e fungendo da guida visiva dalle prospettive sagittale e dorsale. La Figura 2 riassume i passaggi critici per il posizionamento della sonda laser Doppler e i risultati nel topo. La Figura 2A presenta l'immagine di un topo anestetizzato e preparato con una marcatura tratteggiata nel sito dell'incisione verticale necessaria per il successivo posizionamento della sonda laser Doppler. La finestra periorbitale del cranio è illustrata nella Figura 2B.

La Figura 3 riassume il posizionamento della sonda laser Doppler nel ratto. Un'immagine di un ratto anestetizzato e preparato con una marcatura tratteggiata nel sito dell'incisione verticale necessaria per il successivo posizionamento della sonda laser Doppler è mostrata nella Figura 3A. La finestra periorbitale non può essere visualizzata perché è più profonda del mouse. In questo caso, il teschio può essere sentito, come accennato nel passaggio 2.3. La sonda laser Doppler posizionata nella regione periorbitale nel ratto supino è mostrata nella Figura 3B.

Un tipico tracciamento LDF durante la procedura MCAO del topo è mostrato nella Figura 4A. Illustra una riuscita induzione dell'ischemia, come evidenziato da un calo distinto e immediato del flusso sanguigno cerebrale relativo (CBF) quando l'arteria carotide è legata e di nuovo quando il filamento viene avanzato fino all'ostio dell'MCA. L'inizio della riperfusione è mostrato alla fine del tracciato, evidenziato da un netto e immediato aumento del CBF relativo quando l'arteria carotide viene slegata e di nuovo quando il filamento viene ritirato dall'MCA. Una tipica lettura LDF dell'ischemia durante l'intervento chirurgico MCAO nel ratto è mostrata nella Figura 4B, che mostra un'induzione riuscita dell'ischemia seguita dalla rimozione della sonda e dal riposizionamento per la misurazione dell'LDF durante la riperfusione. Nella chirurgia dei ratti, i tempi di ischemia possono essere superiori a 60 minuti e gli animali possono riprendersi durante il periodo di ischemia e devono essere nuovamente anestetizzati per la riperfusione. In questo caso, la sonda viene riposizionata nella finestra periorbitale e i tracciati LDF continuano. L'ischemia è evidenziata nel tracciato da un netto e immediato calo del CBF relativo quando l'arteria carotide è legata e il filamento avanza verso l'ostio MCA. La riperfusione è evidenziata nel secondo tracciato LDF da un aumento distinto e immediato del CBF relativo, dopo di che l'arteria carotide viene slegata e, di nuovo, quando il filamento viene ritirato dall'ostio dell'MCA. Il Doppler periorbitale è posizionato sopra il ramo distale dell'MCA e, quindi, nell'ambito della distribuzione sanguigna dell'MCA con una diminuzione osservata del CBF come evidenziato dalla riduzione del flusso sanguigno durante la procedura MCAO, illustrata nella Figura 4.

Nella Figura 5 mostriamo i tracciati LDF che esemplificano gli interventi chirurgici MCAO falliti. La Figura 5A riassume un tracciato LDF da un intervento chirurgico nel ratto con un'occlusione carotidea riuscita che in seguito si è allentata e un posizionamento del filamento non riuscito, contrassegnato da un lento calo del CBF relativo. Questo pattern LDF è tipicamente associato a un MCA perforato che può essere confermato con l'autopsia. Un altro tracciato da un intervento chirurgico MCAO nel topo (Figura 5B) illumina l'occlusione inconcludente dell'arteria carotide che probabilmente ha contribuito all'incapacità di rilevare il posizionamento del filamento negli osti MCA. Si sospettava una perforazione dell'MCA perché quando il filamento veniva leggermente ritirato, il CBF relativo mostrava un recupero lento. Questi esempi evidenziano il ruolo critico dei tracciati LDF nell'identificare gli interventi chirurgici MCAO riusciti rispetto a quelli non riusciti e sottolineano l'importanza di procedure chirurgiche meticolose e misure per risultati sperimentali affidabili.

Figura 1: Pittogramma del posizionamento approssimativo della sonda laser Doppler in relazione all'MCA. Schema del posizionamento della sonda laser Doppler da una vista (A) sagittale e (B) dorsale. Creato con Biorender.com; KT26JWLYF6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione delle fasi dell'intervento chirurgico per il posizionamento della sonda laser Doppler nel mouse. (A) Immagine della posizione dell'incisione verticale necessaria per il posizionamento della sonda laser Doppler con il mouse in posizione supina. (B) Immagine della finestra periorbitale e del cranio preparata con pinze e/o forbici nel topo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Illustrazione delle fasi dell'intervento chirurgico per il posizionamento della sonda laser Doppler nel ratto. (A) Immagine della posizione dell'incisione verticale necessaria per il posizionamento della sonda laser Doppler con il ratto in posizione supina. (B) Posizionamento della sonda Laser Doppler nella regione periorbitale nel ratto supino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempi di tracciati LDF che confermano il successo della procedura MCAO nel topo e nel ratto. (A) Lettura LDF della regione MCA durante la procedura MCAO del topo. Questa traccia illustra la conferma di 1. occlusione dell'arteria carotide con legatura; 2. posizionamento del filamento all'MCA; 3. rimozione del filamento dopo 60 minuti di ischemia continua; e 4. riperfusione quando l'arteria carotide è slegata. Gli elementi a. e b. illustrano l'aspetto del tracciato Doppler quando la carotide viene slegata e rilegata durante la lettura. Questa tecnica può essere utilizzata per confermare il posizionamento della sonda. (B) Letture LDF della regione MCA durante la procedura MCAO del ratto. Come il topo, questa traccia illustra la conferma di 1. occlusione dell'arteria carotide con cravatta e 2. posizionamento del filamento presso l'MCA. Nella procedura MCAO del ratto, la sonda Doppler viene spesso rimossa e l'animale trascorre l'intero tempo dell'ischemia sveglio e in movimento. Per la riperfusione, l'LDF viene ristabilito prima della riperfusione: 3. conferma la rimozione del filamento e 4. conferma che la carotide è slegata per la completa riperfusione. Sia nelle procedure MCAO di topo che in quelle di ratto, il posizionamento riuscito della sonda viene utilizzato per visualizzare il corretto posizionamento del filamento ed è indicato quando il tracciato mostra due diminuzioni distinte e improvvise di LDF (per ischemia) seguite da due aumenti distinti e improvvisi di LDF (riperfusione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esempi di tracciati di flussimetria laser Doppler che indicano procedure MCAO non riuscite nel topo e nel ratto. (A) Un esempio di tracciamento LDF che indica un posizionamento inconcludente del filamento nel ratto. Mentre la carotide è stata legata (1.), si è allentata (2.) e poi è stata legata di nuovo (3.), c'è una caduta indistinta e lenta, piuttosto che un calo improvviso di LDF quando il filamento era all'MCA di Ostia. Questo tracciato può indicare un MCA perforato e l'animale potrebbe non sopravvivere alle prime 24 ore di riperfusione; La perforazione del filamento può essere confermata con l'autopsia. (B) Un esempio di tracciamento LDF che indica un posizionamento inconcludente del filamento nel topo. In questo tracciato, l'evidenza di legame carotideo è inconcludente (1.), seguita da un calo indistinto di LDF con posizionamento del filamento all'ostia MCA (2.). Inoltre, quando il filamento è stato leggermente ritirato, il flusso sanguigno cerebrale relativo è aumentato lentamente (3.). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La MCAO è la procedura gold standard per modellare l'occlusione e la riperfusione dell'arteria cerebrale nei roditori ed è stata la pietra angolare della ricerca preclinica sull'ictus, consentendo l'induzione dell'ischemia focale nei roditori per imitare la fisiopatologia dell'ictus umano. Si tratta di una procedura chirurgica impegnativa con una significativa variabilità inter- e anche intra-chirurgo. Sebbene non ci siano prove che l'applicazione di LDF riduca la variabilità, in alcuni disegni può migliorare il rigore scientifico e i risultati dello studio. Ciò si ottiene perché LDF convalida il posizionamento del filamento e fornisce informazioni in tempo reale sulla CBF durante l'intervento chirurgico, confermando se si è verificata l'occlusione dell'MCA. Circa il 75% degli studi sui topi descrive l'utilizzo di una sonda laser Doppler^12,13, mentre questo non era un parametro riportato in una meta-analisi di studi sui ratti¹⁴. Un'alternativa spesso utilizzata all'LDF è quella di misurare l'inserzione del filamento (ad esempio, 18-20 mm dalla biforcazione dell'arteria carotide comune nei ratti) utilizzando filamenti contrassegnati o di misurare il filamento rimanente che sporge dal punto di inserzione (ad esempio, 10 mm)¹⁰. Tuttavia, questa alternativa è inferiore all'LDF perché l'esatta profondità di inserimento del filamento può variare leggermente a seconda di fattori quali le dimensioni e il peso del ratto, nonché il protocollo specifico utilizzato nell'esperimento. Tali differenze sono considerazioni essenziali per la riproducibilità della chirurgia MCAO, dato il rischio di perforazione del vaso o di occlusione incompleta, entrambi esiti chirurgici negativi.

Sebbene LDF sia un metodo per convalidare il posizionamento dei filamenti e sia supportato da SPAN, non è un passaggio obbligatorio nella SPAN-SOP⁵ pubblicata. Il protocollo descritto supera barriere come l'uso di attrezzature speciali e il difficile posizionamento della sonda sulle sezioni dorsali del cranio quando la procedura principale viene eseguita su un animale in posizione supina; Questi fattori spesso allungano i tempi chirurgici. Al contrario, questo protocollo utilizza una singola sonda laser Doppler e un monitor diretto, una posizione di posizionamento periorbitale e nessun assottigliamento del cranio. Se combinati, questi passaggi si traducono in una procedura notevolmente semplificata e abbreviata (spesso meno di 5 minuti), un miglioramento significativo rispetto a metodi simili ma alternativi descritti in letteratura 7,8,9,10. Questo protocollo può anche essere adattato dai chirurghi secondo necessità. La risoluzione dei problemi delle tecniche descritte può richiedere e includere il riposizionamento della sonda, soprattutto se non si osserva una diminuzione del flusso sanguigno nel passaggio 2.8.

L'uso di LDF è limitato alla conferma del posizionamento del filamento e non è stato associato alla variabilità delle dimensioni dell'infarto, che può essere del >20% nei metodi su topi e ratti^12,14. La variabilità dell'infarto è stata un problema di lunga data nella ricerca preclinica sull'ictus. Mentre questa maggiore variabilità può imitare la diversità delle dimensioni dell'infarto osservate nella condizione umana¹³, quando non adeguatamente considerata, la variabilità osservata può portare a studi che non sono adeguatamente alimentati. Sebbene non esista un singolo fattore che predice la variabilità del metodo, la conferma del posizionamento è un fattore importante per gli studi sull'efficacia dei farmaci. Il protocollo qui descritto, sebbene probabilmente già impiegato nelle procedure MCAO del topo, potrebbe essere sottoutilizzato nei ratti, date le descrizioni più frequenti del posizionamento dorsale in letteratura⁹. Riteniamo che questa descrizione del posizionamento semplificato di una sonda laser Doppler contribuisca a perfezionare le metodologie di ricerca preclinica sull'ictus, puntando a una maggiore precisione sperimentale e rilevanza traslazionale.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa ricerca è stata finanziata da NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6

This corrects the article 10.3791/66839