설치류 모델에서 중뇌동맥 폐색 전 대뇌 혈류 모니터링을 위한 레이저 도플러 프로브의 안와 주변 배치

여기에는 레이저 도플러 프로브를 쥐와 생쥐에게 적합한 안와 주위 위치인 중간 대뇌 동맥(MCA)의 원위 영역 위에 두개골에 배치하여 일시적인 MCA 폐색 중 혈류를 평가하는 것이 포함됩니다.

중뇌동맥폐색(MCAO)은 설치류에서 허혈성 뇌졸중의 전임상 모델링을 위한 최고의 표준 방법입니다. 그러나 가장 숙련된 수술 손으로도 성공적인 교합이 보장되지 않습니다. 오류는 주로 필라멘트가 올바른 깊이에 배치되지 않고 경색이 없거나 혈관 천공이 있을 때 발생하여 사망을 초래할 수 있습니다. 레이저 도플러 유량계(LDF)는 MCAO 절차 중 국소 뇌혈류(CBF)에 대한 실시간 피드백을 제공하는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 여기에서는 생쥐와 생쥐 모두에서 CBF를 측정하기 위해 레이저 도플러 프로브의 궤도 주위 배치를 위한 신속한 기술을 보여줍니다. 우리의 이론적 근거는 LDF 구현을 단순화하여 수술 신뢰성 향상을 위해 광범위한 사용을 장려하는 것이었습니다. 이 기술은 두개골 솎아내기와 특수 장비의 필요성을 없애고, 등쪽 배치가 아닌 안와 주위 부위에 배치하여 효율성과 채택 용이성을 촉진합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 수술 전 준비, 안와 주위 도플러 프로브 배치 및 수술 후 관리가 포함됩니다. 대표적인 결과로는 성공적인 MCAO 수술을 보여주는 대표적인 LDF 추적과 함께 절차적 요소의 시각적 묘사가 있으며, 필라멘트 배치에 실패한 사례는 합병증을 유발합니다. 이 프로토콜은 적절한 필라멘트 배치를 확인하는 LDF를 설명하고 대체 방법에 비해 간소화된 절차를 제공합니다.

중뇌동맥폐색법(MCAO)은 1986년 과학계에 소개된 이래 설치류에서 널리 사용되어 왔으며,¹⁹⁹⁰년 2년에 기술된 Longa 적응법과 그 직후에 생쥐에 대한 적응이 이루어졌다.³. Longa의 간행물에는 설명되어 있지 않지만, 필라멘트 배치를 확인하기 위해 레이저 도플러 유량계(LDF) 신호를 사용하는 것이 곧 문헌⁴에 설명되었습니다. MCAO 절차 중 LDF 고용은 문헌에 두드러지게 나타나 있지만 현재 뇌졸중 전임상 평가 네트워크(SPAN) 표준 수술 절차(SOP⁾⁵에서는 선택 단계로 지정되어 있습니다.

LDF의 사용은 MCAO 절차 중 올바른 필라멘트 배치를 확인하므로 특히 약물 효능을 탐구하도록 설계된 실험에서 연구 설계 엄격성 및 후속 결과에 기여합니다. LDF를 사용하면 필라멘트가 충분히 멀리 배치되지 않았을 때 부상이 없거나 필라멘트가 너무 많이 삽입되었을 때 혈관 천공으로 인한 동물의 죽음이라는 이분법적 상황을 초래하는 잘못된 필라멘트 배치로 인한 수술 실수를 줄일 수 있습니다. 반면에, LDF의 사용은 MCAO 절차⁶에 따라 일반적으로 관찰되는 경색 크기 변동성과 관련이 없습니다. MCAO 절차에서 LDF를 사용하는 것은 두개골이 마우스보다 두껍고 LDF 배치 ^7,8 전에 두개골을 얇게 해야 할 수 있기 때문에 특히 랫트에서 어렵고 부담스러운 것으로 인식될^{수 있습니다.} 또한, 등쪽 프로브 배치는 종종 특수 장비 또는 준비를 필요로 하는 일부 프로토콜로 설명됩니다 ^7,8,9. 이러한 장벽 중 하나로 인해 필라멘트 배치를 확인하기 위한 LDF의 구현이 이루어지지 않을 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 마우스와 랫드 모두에서 MCAO 절차 중 혈류를 평가하기 위해 두개골과 중뇌 동맥의 원위 영역(안와 주위 배치)에 레이저 도플러 프로브를 배치하는 방법을 설명합니다. 우리의 이론적 근거는 문헌 7,8,9,10에 보고된 일부 방법에 비해 최소 침습적이고 빠르며 두개골 얇아짐 또는 레이저 도플러 프로브 이상의 특수 장비가 필요하지 않다는 점에서 여러 장점이 있는 절차를 개발하는 것이었습니다.

이 프로토콜을 설명하기 위해 성체 마우스와 랫트를 사용하였다(25g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250g, Sprague Dawley, Envigo). 동물 취급 및 실험 절차는 University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee, 국내법 및 실험실 동물 관리 원칙에 따라 승인 하에 수행되었습니다¹¹. 쥐와 생쥐는 12 시간의 밝은 / 어두운 일정 (오전 7 시부 터 오후 7 시까 지)에 따라 음식과 물을 즉시 사용할 수 있습니다.

1. 수술 전 준비

참고: 일반적으로 설치류에 대한 MCAO 수술은 생존 수술로 수행되므로 기관별 IACUC 프로토콜에 설명된 대로 무균 또는 팁 전용 수술 기술을 사용해야 합니다. 이 경우 외과의는 멸균된 기구와 용품을 사용하여 팁 전용 기술을 사용합니다.

1. 상업용 소독제로 수술 작업 표면을 소독하고 고압멸균으로 기구, 드레이프, 거즈, 면봉, 봉합사 및 메스 블레이드로 구성된 멸균 수술 팩을 준비합니다. 현미경 손잡이를 덮고 식품 등급의 플라스틱 랩을 사용하여 드레이핑하는 것과 같은 IACUC 승인 기술에 따라 생존 수술 중 멸균 상태를 유지합니다.
2. 한 세션 동안 여러 설치류 수술을 수행하는 경우 시술 사이에 수술 기구를 다시 멸균하기 위해 germinator dry bead sterilizer를 사용하십시오.
3. 쥐나 생쥐를 유도 챔버에 넣고 3%-5% 이소플루란(1% 공기와 80% 산소 혼합물을 결합한 20L/분)으로 마취를 유도합니다.
4. 마취를 위해 동물을 챔버에서 벤치 및 노즈콘으로 옮깁니다(마우스: 0.5L/min 80%/20% 산소/공기 혼합물, 쥐: 1.5L/min 80%/20% 산소/공기 혼합물). 양쪽 눈에 안과 연고를 바르고 MCAO 수술 측면(일반적으로 오른쪽)의 귀와 안와(eye-socket) 사이의 공간을 클리퍼로 피부를 자르지 않도록 조심스럽게 면도합니다. 쥐의 경우 면도할 때 수염 보조개가 안와와 귀 사이의 대략 중간에서 볼 수 있습니다. MCAO 절차⁹ 에 필요한 만큼 영역을 계속 면도합니다(이 문서의 범위에 포함되지 않음).
5. 필요에 따라 동물을 챔버로 되돌리거나 37°C로 데워진 준비된 수술 테이블의 노즈콘으로 옮깁니다. 직장 체온계를 삽입합니다. 동물은 시술 기간 동안 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 약 36°C ± 1°C에서 보관해야 합니다.
6. 면봉에 베타딘을 바르고 수술 부위 중앙에서 바깥쪽으로 나선형으로 피부를 소독합니다. 알코올 준비 패드로 닦으십시오. 총 3주기 동안 두 단계를 모두 반복합니다. 적절한 마취를 확인하고 발가락 꼬집기 역류를 사용하여 시술 중 15분마다 평가합니다.

2. 궤도 주위 도플러 프로브 배치

1. 그림 2A (마우스) 및 그림 3A (쥐)와 같이 작은 가위로 눈꼬리와 귀 주름 사이를 세로로 자릅니다(마우스: ~0.5cm, 쥐: ~0.7cm).
   알림: IACUC 프로토콜 승인에 따라 수술 전에 통증을 치료하십시오.
2. 날카로운 집게와 구부러진 가위를 사용하여 두개골에 닿을 때까지 근육층을 조심스럽게 자릅니다. 두개골은 평평하고 집게 끝으로 만지기 어렵습니다. 이것은 그림 2B에서 시각화된 것처럼 레이저 도플러 프로브가 위치할 창입니다.
3. 겸자 소작 도구를 사용하여 나오는 혈액을 응고시키고 창을 넓히며 두개골로 가는 경로를 확인합니다.
4. 창문이 열리면 필요에 따라 면봉으로 닦아 과도한 피를 제거합니다.
   쥐나 쥐를 앙와위 위치에 놓습니다.
5. 겸자를 사용하여 피부나 조직을 집어넣고 도플러 프로브를 안와 주위 창에 배치하여 레이저 신호를 방해하는 피부나 근육이 없는 상태에서 두개골과 수직으로 맞닿도록 합니다. 이 영역은 그림 1A,B와 같이 원위 MCA 위에 있습니다. 실험실 테이프로 프로브 배치를 고정합니다. 이 프로토콜에서는 직선 프로브의 사용에 대해 설명합니다.
   참고: 수술 프로토콜은 실험실마다 다르다는 것을 알고 있습니다. 문헌(보고될 때)에 의하면 어떤 사람들은 두개골을 얇게 갈고 다른 사람들은 그렇지 않다⁹. 두개골이 안와 주위 영역에서 더 얇기 때문일 수 있지만 이것은 단지 추측일 뿐입니다. 우리의 경험에 따르면, 생쥐와 쥐에서 분쇄 없이 직접 배치할 수 있으며 이 프로토콜에서 입증되었습니다.
6. 적절한 소프트웨어를 사용하여 모니터의 상대 혈류 판독값을 모니터링합니다(그림 2D, 그림 3C, D). LDF 판독값은 다를 수 있습니다. 그러나 혈류 강하를 감지하기 위한 최적의 범위는 >200 관류 단위(PU)입니다.
7. MCAO 수술⁹ 로 진행합니다(이 문서의 범위에 포함되지 않음). MCAO 수술 중에는 혈류가 갑자기 떨어지는(~50%) 유발하는 총경동맥을 잠시 묶어 프로브 배치를 테스트합니다.

3. 도플러 프로브 제거 및 수술 후 관리

1. MCAO가 끝나거나 혈류 판독이 완료될 때마다 수술 창에서 레이저 도플러 프로브를 제거합니다. 도플러 프로브는 허혈 시간이 종종 90분 미만이기 때문에 마우스 MCAO 수술 기간 동안 일반적으로 제자리에 유지됩니다. 반면에, 랫트 MCAO 절차에서, 도플러 프로브는 필라멘트를 배치한 후 허혈 동안(일반적으로 90분 >) 제거한 후 안와 주위 창에 다시 배치하여 2.6 및 2.7 단계를 반복하여 재관류를 확인할 수 있습니다.
   알림: 마우스 MCAO의 일반적인 LDF 연속 추적은 그림 4A에서 관찰할 수 있습니다. 랫트 MCAO 절차의 일반적인 LDF 추적은 그림 4B에 나와 있습니다.
2. IACUC에서 승인한 국소 마취제를 예상 절개 부위를 따라 피하에 주입합니다.
3. 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 흡수성 봉합사 또는 수술용 접착제가 있는 표준 수술용 매듭을 사용하여 1-2개의 봉합사로 피부를 닫습니다. IACUC 프로토콜 승인에 따른 수술 후 통증 치료(예: bupivacaine HCL 0.5% 및 lidocaine 2%, 생쥐 및 생쥐에 대한 절개 1회). 동물은 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 방치해서는 안 되며, 완전히 회복될 때까지 어떤 동물도 다른 동물과 함께 돌려보내서는 안 됩니다.

MCA 영역에서 레이저 도플러 프로브의 배치는 그림 1에 시각적으로 묘사되어 있으며, 혈관 구조의 상형 문자를 제공하고 시상 및 등쪽 관점에서 시각적 가이드 역할을 합니다. 그림 2 는 레이저 도플러 프로브 배치에 대한 중요한 단계와 마우스에서의 결과를 요약한 것입니다. 그림 2A 는 후속 레이저 도플러 프로브 배치에 필요한 수직 절개 부위에 점선 표시가 있는 마취 및 준비된 마우스의 이미지를 나타냅니다. 두개골에 대한 안와 주위 창은 그림 2B에 설명되어 있습니다.

그림 3은 쥐의 레이저 도플러 프로브 배치를 요약한 것입니다. 후속 레이저 도플러 프로브 배치에 필요한 수직 절개 부위에 점선 표시가 있는 마취 및 준비된 쥐의 이미지가 그림 3A에 나와 있습니다. 안와 주위 창은 마우스보다 깊기 때문에 볼 수 없습니다. 이 경우 2.3단계에서 언급한 것처럼 두개골을 느낄 수 있습니다. 앙와위 쥐의 안와 주위 영역에 배치된 레이저 도플러 프로브는 그림 3B에 나와 있습니다.

마우스 MCAO 절차 중 일반적인 LDF 추적은 그림 4A에 나와 있습니다. 이는 경동맥이 연결될 때와 필라멘트가 MCA의 골로 전진할 때 상대 대뇌 혈류(CBF)의 뚜렷하고 즉각적인 감소로 입증되는 허혈의 성공적인 유도를 보여줍니다. 재관류의 시작은 추적이 끝날 때 표시되며, 경동맥이 풀릴 때와 필라멘트가 MCA에서 철회될 때 다시 상대 CBF의 뚜렷하고 즉각적인 증가로 입증됩니다. 랫트 MCAO 수술 중 허혈의 일반적인 LDF 판독값은 그림 4B에 나와 있으며, 이는 허혈 유도에 이어 재관류 중 LDF 측정을 위한 프로브 제거 및 재배치를 보여줍니다. 쥐 수술에서 허혈 시간은 60분 이상일 수 있으며 동물은 허혈 기간 동안 회복될 수 있으므로 재관류를 위해 다시 마취해야 합니다. 이 경우 프로브는 궤도 주변 창에 재배치되고 LDF 추적이 계속됩니다. 허혈은 경동맥이 연결되고 필라멘트가 MCA ostium으로 진행될 때 상대 CBF의 뚜렷하고 즉각적인 감소로 추적에서 입증됩니다. 재관류는 두 번째 LDF 추적에서 상대 CBF의 뚜렷하고 즉각적인 증가로 입증되며, 그 후 경동맥이 풀리고 다시 필라멘트가 MCA의 골에서 철회될 때 입증됩니다. 안와 주위 도플러는 MCA의 원위 가지에 위치하므로 그림 4와 같이 MCAO 절차 중 혈류 감소로 입증 된 바와 같이 CBF의 관찰 된 감소와 함께 MCA의 혈액 분포 범위 내에 있습니다.

그림 5에서 실패한 MCAO 수술을 보여주는 LDF 추적을 보여줍니다. 그림 5A는 쥐 수술에서 성공적인 경동맥 폐색이 이루어졌으나 나중에 느슨해지고 필라멘트 배치에 실패하여 상대적 CBF가 천천히 떨어지는 LDF 추적을 요약한 것입니다. 이 LDF 패턴은 일반적으로 부검으로 확인할 수 있는 천공된 MCA와 관련이 있습니다. 마우스 MCAO 수술의 또 다른 추적(그림 5B)은 MCA ostia에서 필라멘트 배치를 감지할 수 없는 데 기여했을 가능성이 있는 결정적이지 않은 경동맥 폐색을 밝힙니다. MCA의 천공이 의심되는 이유는 필라멘트가 약간 후퇴했을 때 상대적인 CBF가 느린 회복을 보였기 때문입니다. 이러한 예는 MCAO 수술의 성공과 실패를 식별하는 데 있어 LDF 추적의 중요한 역할을 강조하고 신뢰할 수 있는 실험 결과를 위한 세심한 수술 절차와 측정의 중요성을 강조합니다.

그림 1: MCA와 관련된 대략적인 레이저 도플러 프로브 배치의 그림. (A) 시상 및 (B) 등쪽 보기에서 레이저 도플러 프로브 배치의 개략도. Biorender.com 로 만들어졌습니다. KT26JWLYF6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 레이저, 도플러 프로브를 마우스에 배치하기 위한 수술 단계 그림. (A) 마우스를 누운 상태에서 레이저 도플러 프로브를 배치하는 데 필요한 수직 절개 위치의 이미지. (B) 마우스의 집게 및/또는 가위로 준비한 안와 주위 창과 두개골의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐에 레이저 도플러 프로브를 배치하기 위한 수술 단계의 그림. (A) 레이저 도플러 프로브 배치에 필요한 수직 절개 위치의 이미지로, 쥐가 앙와위 위치에 있습니다. (B) 레이저 도플러 프로브를 앙와위 쥐의 안와 주위 영역에 배치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마우스와 랫트에서 성공적인 MCAO 절차를 확인하는 LDF 추적의 예. (A) 마우스 MCAO 절차 중 MCA 영역의 LDF 판독. 이 추적은 1의 확인을 보여줍니다. 넥타이를 사용한 경동맥 폐색; 2. MCA에서의 필라멘트 배치; 3. 지속적인 허혈의 60 분 후에 필라멘트 제거; 및 4. 경동맥이 풀렸을 때의 재관류. 요소 a. 및 b.는 판독 중에 경동맥이 풀렸다가 다시 묶일 때 도플러 추적이 어떻게 보이는지 보여줍니다. 이 기술은 프로브 배치를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. (B) 랫트 MCAO 절차 중 MCA 영역의 LDF 판독값. 마우스와 마찬가지로 이 추적은 1의 확인을 보여줍니다. 넥타이를 매고 경동맥 폐색술을 하고 2. MCA에서 필라멘트 배치. 쥐 MCAO 절차에서 도플러 프로브는 종종 제거되고 동물은 전체 허혈 시간을 깨어 있고 움직이는 데 보냅니다. 재관류의 경우, LDF는 재관류 전에 재확립됩니다: 3. 필라멘트 제거를 확인하고 4. 경동맥이 완전한 재관류를 위해 풀렸는지 확인합니다. 마우스 및 랫드 MCAO 절차 모두에서 성공적인 프로브 배치는 올바른 필라멘트 배치를 시각화하는 데 사용되며, 추적 결과 LDF의 두 가지 뚜렷하고 갑작스러운 감소(허혈의 경우)와 LDF(재관류)의 두 가지 뚜렷하고 갑작스러운 증가가 나타날 때 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마우스와 랫트에서 실패한 MCAO 절차를 나타내는 레이저 도플러 유량 측정 추적의 예. (A) 쥐에서 결정적이지 않은 필라멘트 배치를 나타내는 LDF 추적의 예. 경동맥이 묶여(1.), 느슨해졌다가(2.), 다시 묶여(3.), 필라멘트가 MCA Ostia에 있을 때 LDF가 갑자기 떨어지는 것이 아니라 불분명하고 느린 하락이 있습니다. 이 추적은 천공된 MCA를 나타낼 수 있으며 동물은 재관류의 처음 24시간 동안 생존하지 못할 수 있습니다. 필라멘트 천공은 부검으로 확인할 수 있습니다. (B) 마우스에서 결정적이지 않은 필라멘트 배치를 나타내는 LDF 추적의 예. 이 추적에서 경동맥 타이의 증거는 결정적이지 않으며(1.), MCA ostia에서 필라멘트 배치로 LDF가 불분명하게 감소합니다(2.). 또한 필라멘트가 약간 빠지면 상대 대뇌 혈류가 느리게 증가했습니다(3.). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MCAO는 설치류의 대뇌 동맥 폐색 및 재관류를 모델링하기 위한 표준 절차이며 전임상 뇌졸중 연구의 초석이 되어 설치류의 국소 허혈 유도를 통해 인간 뇌졸중 병태생리학을 모방할 수 있습니다. 이는 외과 의사 간 및 외과 의사 내 변동성이 상당한 엄격한 수술 절차입니다. LDF의 적용이 변동성을 줄인다는 증거는 없지만 일부 설계에서는 과학적 엄격성과 연구 결과를 향상시킬 수 있습니다. 이는 LDF가 필라멘트 배치를 검증하고 수술 중 CBF에 대한 실시간 정보를 제공하여 MCA의 폐색이 발생했는지 여부를 확인하기 때문에 수행됩니다. 생쥐 연구의 약 75%가 레이저 도플러 프로브(^12,13)의 사용을 설명하고 있지만, 이는 생쥐 연구⁽¹⁴)의 메타 분석에서는 보고된 매개변수가 아니었다. LDF에 대해 자주 사용되는 대안은 표시된 필라멘트를 사용하여 필라멘트 삽입(예: 쥐의 총경동맥 분기점에서 18-20mm)을 측정하거나 삽입 지점(예: 10mm)에서 돌출된 나머지 필라멘트를 측정하는 것입니다(예: 10mm)¹⁰. 그러나 이 대안은 필라멘트 삽입의 정확한 깊이가 쥐의 크기와 무게, 실험에 사용되는 특정 프로토콜과 같은 요인에 따라 약간 다를 수 있기 때문에 LDF보다 열등합니다. 이러한 차이는 혈관 천공 또는 불완전 폐색의 위험을 감안할 때 MCAO 수술의 재현성을 위한 필수 고려 사항이며, 둘 다 부정적인 수술 결과입니다.

LDF는 필라멘트 배치를 검증하는 방법이며 SPAN에서 지원되지만 게시된 SPAN-SOP⁵에서는 필수 단계가 아닙니다. 설명된 프로토콜은 주요 절차가 누운 위치에 있는 동물에서 수행될 때 특수 장비의 사용 및 두개골의 등쪽 부분에 어려운 프로브 배치와 같은 장벽을 극복합니다. 이러한 요인으로 인해 수술 시간이 길어지는 경우가 많습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 단일 직선 레이저 도플러 프로브 및 모니터, 안와 주위 배치 위치 및 두개골 얇아짐이 없는 것을 사용합니다. 이러한 단계를 결합하면 절차가 크게 단순화되고 단축(종종 5분 미만)되며, 이는 문헌 ^7,8,9,10에 설명된 유사하지만 대안적인 방법에서 크게 개선됩니다. 이 프로토콜은 필요에 따라 외과의가 조정할 수도 있습니다. 설명된 기술의 문제 해결은 특히 단계 2.8에서 혈류의 감소가 관찰되지 않는 경우 프로브 재배치를 필요로 하고 포함할 수 있습니다.

LDF의 사용은 필라멘트 배치를 확인하는 것으로 제한되며 마우스 및 랫트 방법에서 >20%가 될 수 있는 경색 크기 변동성과 관련이 없습니다^12,14. 경색 변동성은 전임상 뇌졸중 연구에서 오랫동안 지속되어 온 문제였습니다. 이러한 증가된 변동성은 인간 조건¹³에서 관찰된 경색 크기의 다양성을 모방할 수 있지만, 적절하게 설명되지 않을 경우 관찰된 변동성은 적절하게 전원이 공급되지 않는 연구를 초래할 수 있습니다. 분석법의 변동성을 예측하는 단일 요인은 없지만, 배치를 확인하는 것은 약물 효능 연구에서 중요한 요소입니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 마우스 MCAO 절차에서 이미 사용되었을 가능성이 있지만, 문헌⁹에서 등쪽 배치에 대한 더 빈번한 설명을 감안할 때, 랫트에서는 충분히 활용되지 않을 수 있다. 우리는 단순화된 레이저 도플러 프로브 배치에 대한 이러한 설명이 전임상 뇌졸중 연구 방법론을 개선하여 실험 정밀도와 중개 관련성을 높이는 데 기여한다고 믿습니다.

저자는 밝힐 것이 없습니다.

이 연구는 NINDS 1R41NS124450의 지원을 받았습니다. 바이오렌더: KT26JWLYF6

This corrects the article 10.3791/66839