げっ歯類モデルにおける中大脳動脈閉塞前の脳血流モニタリングのためのレーザードップラープローブの眼窩周囲配置

ここでは、ラットやマウスに適した眼窩周囲位置である中大脳動脈(MCA)の遠位領域上の頭蓋骨にレーザードップラープローブを配置して、一過性MCA閉塞時の血流を評価する低侵襲手術を示します。

中大脳動脈閉塞術 (MCAO) は、げっ歯類の虚血性脳卒中の前臨床モデリングのゴールドスタンダード法です。しかし、咬合の成功は、最も熟練した外科手術の手によっても保証されるものではありません。エラーは主に、フィラメントが正しい深さに配置されていない場合に発生し、梗塞がない場合や血管の穿孔がある場合に発生し、死に至る可能性があります。レーザードップラー流量測定(LDF)は、MCAO手順中に局所脳血流(CBF)に関するリアルタイムのフィードバックを提供する信頼性の高い技術です。ここでは、マウスとラットの両方でCBFを測定するためのレーザードップラープローブの眼窩周囲配置の迅速な技術を示します。私たちの理論的根拠は、LDFの実施を簡素化し、手術の信頼性を向上させるために広くの使用を促進することでした。この技術により、頭蓋骨の薄化や特殊な機器が不要になり、背側ではなく眼窩周囲領域に配置されるため、効率と採用の容易さが促進されます。ここで説明するプロトコルには、術前の準備、眼窩周囲ドップラープローブの配置、および術後ケアが含まれます。代表的な結果には、手続き要素の視覚的描写と、成功したMCAO手術を示す代表的なLDFトレースが含まれ、フィラメントの配置が失敗した例が合併症につながります。このプロトコルは、適切なフィラメントの配置を確認するためのLDFを示しており、他の方法と比較して簡略化された手順を提供します。

中大脳動脈閉塞術(MCAO)法は、1986年にラットへの適用のために科学界に導入されて以来、げっ歯類で広く使用されており、1990年にロンガ適応が記載^され、2、その後すぐにマウスに適応しました³。Longaの出版物には記載されていませんが、フィラメントの配置を確認するためのレーザードップラーフローメトリー(LDF)信号の使用は、すぐに文献に記載されています⁴。MCAO手順中のLDFの使用は、文献で目立つように取り上げられていますが、現在の脳卒中前臨床評価ネットワーク(SPAN)標準手術手順(SOP⁾⁵ではオプションのステップとして指定されています。

LDFを使用すると、MCAO手順中のフィラメントの正しい配置が確認されるため、特に薬効を調査するために設計された実験において、研究デザインの厳密さとその後の結果に貢献します。LDFを使用すると、フィラメントの不適切な配置に起因する手術ミスが減少し、フィラメントが十分に配置されていないときに怪我をしないか、フィラメントが挿入されすぎると血管の穿孔が発生して動物が死亡するかという二分法の状況が発生します。一方、LDFの使用は、MCAO手順⁶の後に一般的に観察される梗塞サイズの変動とは関連していません。MCAO手順でのLDFの使用は、特にラットでは、頭蓋骨がマウスよりも厚く、LDF留置前に頭蓋骨を薄くする必要があるため、困難で面倒であると認識される可能性があります^7,8。また、背側プローブの配置は、特殊な機器または調製を必要とするいくつかのプロトコルでしばしば説明される^7,8,9。これらの障壁のいずれかを使用すると、フィラメントの配置を確認するためのLDFの実装が行われない可能性があります。

このプロトコルでは、マウスとラットの両方でMCAO手順中の血流を評価するために、頭蓋骨および中大脳動脈の遠位領域(眼窩周囲配置)に対するレーザードップラープローブの配置について説明します。私たちの理論的根拠は、文献 ^7,8,9,10 で報告されているいくつかの方法に比べて複数の利点を持つ手順を開発することでした。つまり、低侵襲で高速であり、頭蓋骨の薄化やレーザー ドップラー プローブ以外の特殊な機器を必要としません。

成体マウスおよびラットを用いて、このプロトコルを例示した(25g、C57BL/6J、Jackson Laboratories;250g、Sprague Dawley、Envigo)。動物の取り扱いおよび実験手順は、承認を得て、アリゾナ大学施設動物管理および使用委員会、国内法、および実験動物管理の原則に従って実施されました¹¹。ラットとマウスは、12時間の明暗スケジュール(午前7時から午後7時)で飼育され、餌と水は 自由に利用可能でした。

1. 術前準備

注:通常、げっ歯類のMCAO手術は生存手術として行われ、施設固有のIACUCプロトコルで概説されているように、無菌または先端のみの手術技術を使用する必要があります。この場合、外科医は滅菌された器具と消耗品を使用してチップのみの技術を使用します。

1. 市販の消毒剤で手術面を消毒し、オートクレーブで器具、ドレープ、ガーゼ、綿棒、縫合糸、メスの刃の滅菌手術パックを準備します。サバイバル手術中は、顕微鏡のノブを覆ったり、食品グレードのプラスチックラップを使用してドレープしたりするなど、IACUCが承認した技術に従って無菌状態を維持します。
2. 1回のセッションで複数のげっ歯類の手術が行われる場合は、ジャーミネータードライビーズ滅菌器を使用して、手順の合間に手術器具を再滅菌します。
3. ラットまたはマウスを誘導チャンバーに入れ、3%〜5%イソフルラン(80%の空気と20%の酸素混合物を組み合わせて1L /分)で麻酔を誘発します。.
4. 動物をチャンバーからベンチとノーズコーンに移動して麻酔します(マウス:0.5 L / min 80%/ 20%酸素/空気混合物;ラット:1.5 L / min 80%/ 20%酸素/空気混合物)。両目に眼軟膏を塗り、クリッパーで皮膚を切らないように、MCAO手術の側面(通常は右側)の耳と眼窩の間のスペースを慎重に剃ります。ラットでは、剃ると、ひげのくぼみが眼窩と耳のほぼ中間に見えます。MCAO手順⁹ の必要に応じて、領域を引き続き剃ります(このホワイトペーパーの範囲外)。
5. 必要に応じて動物をチャンバーに戻すか、37°Cに温めた準備済みの手術台の上のノーズコーンに移します。 直腸体温計を挿入します。動物は、手順全体を通して、承認されたIACUCプロトコルに従って、約36°C±1°Cに保つ必要があります。
6. ベタジンを綿棒に塗布し、手術領域の中心から外側にらせん状に皮膚を消毒します。アルコール準備パッドで拭きます。両方の手順を合計 3 サイクル繰り返します。適切な麻酔を確認し、つま先のピンチ逆流を使用して、手順中に15分ごとに評価します。

2. 眼窩周囲ドップラープローブの配置

1. 小さなハサミで、 図2A (マウス)や 図3A (ラット)のように、目尻と耳のひだの間に縦に切り込み(マウス:~0.5cm、ラット:~0.7cm)をして、スーパーフェイシアとその下の筋肉を露出させます。
   注: IACUC プロトコルの承認に従って、術前に痛みを治療します。
2. 鋭い鉗子と湾曲したハサミを使用して、頭蓋骨に到達するまで筋肉層を慎重に切り抜きます。頭蓋骨は平らになり、鉗子の先端で触れにくくなります。これは、 図2Bに示すように、レーザードップラープローブが配置されるウィンドウです。
3. 鉗子焼灼ツールを使用して、出現する血液を凝固させ、窓を広げ、頭蓋骨へのルートを確保します。
4. 窓が開いたら、必要に応じて綿棒で拭き取り、余分な血液を取り除きます。
   マウスまたはラットを仰臥位に置きます。
5. 鉗子を使用して皮膚や組織を引っ込め、ドップラープローブを眼窩周囲窓に配置して、レーザー信号を妨げる皮膚や筋肉が存在しない状態で頭蓋骨に垂直に接するようにします。この領域は、 図1A、Bに示すように、遠位MCA上にあります。プローブの配置をラボ用テープで固定します。このプロトコルでは、ストレートプローブの使用について説明します。
   注:手術プロトコルは検査室によって異なることを認識しています。文献(報告されている場合)では、頭蓋骨を薄く削る人もいれば、そうでない人もいます⁹。眼窩周囲部で頭蓋骨が薄くなっているからかもしれませんが、これはあくまでも憶測です。私たちの経験では、マウスやラットでは、粉砕を伴わない直接配置を達成でき、このプロトコルで実証されています。
6. 適切なソフトウェアを使用して、モニター上の相対的な血流測定値を監視します(図2D、 図3C、D)。LDFの測定値は異なります。ただし、血流滴の検出に最適な範囲は>200灌流ユニット(PU)です。
7. MCAO手術⁹ に進みます(この論文の範囲外)。MCAO手術では、総頸動脈を短時間結んでプローブを留置しますが、これにより血流が急激に低下します(~50%)。

3.ドップラープローブの取り外しと術後のケア

1. MCAOの終了時または血流の読み取りが完了したら、レーザードップラープローブを手術窓から取り外します。ドップラープローブは、虚血時間が90分未満であることが多いため、通常、マウスのMCAO手術期間中は所定の位置に留まります。一方、ラットMCAOの手順では、フィラメントを配置した後、虚血中(通常は90分>)にドップラープローブを取り外し、その後、手順2.6と2.7を繰り返して再灌流を確認するために眼窩周囲ウィンドウに再度配置できます。
   注:マウスMCAOからの典型的なLDF連続トレースを 図4Aに示します。ラットMCAO手順からの典型的なLDFトレースを 図4Bに示します。
2. IACUC 承認の局所麻酔薬を、切開予定部位に沿って皮下注射します。
3. 承認されたIACUCプロトコルに従って、吸収性縫合糸または外科用接着剤を備えた標準的な外科用結び目を使用して、1〜2本の縫合糸で皮膚を閉じます。IACUC プロトコルの承認に従って術後の痛みを治療します (例: マウスとラットの切開内 1 回、ブピバカイン HCL 0.5% とリドカイン 2%)。動物は、胸骨の横臥を維持できるようになるまで放置しておかず、完全に回復するまで動物を他の動物と一緒に戻すことはありません。

MCA領域におけるレーザードップラープローブの配置を 図1に視覚的に示し、血管系のピクトグラフを提供し、矢状および背側の観点からの視覚的なガイドとして機能します。 図2 は、レーザードップラープローブをマウスに配置するための重要な手順と結果をまとめたものです。 図2A は、麻酔をかけ、準備したマウスの画像を示しており、その後のレーザードップラープローブの配置に必要な垂直切開の部位に破線のマーキングが付いています。頭蓋骨への眼窩周囲窓を 図2Bに示します。

図3は、ラットのレーザードップラープローブの配置をまとめたものです。その後のレーザードップラープローブの配置に必要な垂直切開の部位に破線のマーキングが付いた麻酔をかけ、準備したラットの画像を 図3Aに示します。眼窩周囲窓はマウスよりも深いため、見ることができません。この場合、ステップ2.3で述べたように、頭蓋骨を感じることができます。仰臥位ラットの眼窩周囲領域に配置されたレーザードップラープローブを 図3Bに示します。

マウスMCAO手順中の典型的なLDFトレースを 図4Aに示します。これは、頸動脈が結ばれているとき、およびフィラメントがMCAの口に進められたときに、相対脳血流(CBF)の明確かつ即時の低下によって証明されるように、虚血の成功した誘発を示しています。再灌流の開始は、トレーシングの終了時に示され、頸動脈が解かれたとき、およびフィラメントがMCAから引き抜かれたときに、相対的なCBFが明確かつ即時に増加することによって証明されます。ラットMCAO手術中の虚血の典型的なLDF測定値を 図4Bに示し、虚血の誘導が成功し、その後、再灌流中のLDF測定のためのプローブの除去と再配置が行われたことを示しています。ラットの手術では、虚血時間が60分を超える場合があり、動物は虚血期間中に回復する可能性があり、再 ?? 流のために再麻酔する必要があります。.この場合、プローブは眼窩周囲ウィンドウに再配置され、LDFトレースが続行されます。虚血は、頸動脈が結ばれ、フィラメントがMCA口に進んだときに、相対的なCBFが明確かつ即時に低下することによってトレースで証明されます。再灌流は、2 回目の LDF トレースで、相対的な CBF の明確かつ即時の増加によって証明され、その後、頸動脈が解かれ、再びフィラメントが MCA の口から引き抜かれます。眼窩周囲ドップラーはMCAの遠位枝上に配置されているため、 図4に示すように、MCAO手順中の血流の減少によって証明されるように、CBFの減少が観察されるMCAの血液分布の範囲内です。

図5に、失敗したMCAO手術を例示するLDFトレースを示します。図5Aは、頸動脈閉塞が成功し、後に緩んだフィラメント留置が失敗し、相対的なCBFがゆっくりと低下したラット手術からのLDFトレースをまとめたものです。このLDFパターンは、通常、剖検で確認できる穿孔MCAに関連しています。マウスのMCAO手術による別のトレース(図5B)は、MCA口でのフィラメントの配置を検出できない原因となった可能性が高い、決定的でない頸動脈閉塞を明らかにしています。MCAの穿孔が疑われたのは、フィラメントがわずかに引き抜かれたときに、相対的なCBFの回復が遅かったためです。これらの例は、成功したMCAO手術と失敗したMCAO手術の特定におけるLDFトレーシングの重要な役割を強調し、信頼性の高い実験結果のための綿密な外科的処置と対策の重要性を強調しています。

図1:MCAに対するレーザードップラープローブのおおよその配置のピクトグラフ。 レーザードップラープローブの配置を(A)矢状図と(B)背側から見た模式図。Biorender.com で作成。KT26JWLYF6。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:レーザードップラープローブをマウスに留置するための手術手順の図(A)マウスを仰臥位にしてレーザードップラープローブを留置するために必要な垂直切開の位置の画像。(B)マウスの鉗子および/またはハサミによって調製された眼窩周囲窓および頭蓋骨の画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ラットにレーザードップラープローブを留置するための手術手順の図。 (A)ラットを仰臥位にしてレーザードップラープローブを留置するために必要な垂直切開の位置の画像。(B)仰臥位ラットの眼窩周囲領域におけるレーザードップラープローブの配置。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マウスおよびラットにおけるMCAO処置の成功を確認したLDFトレーシングの例(A)マウスMCAO処置中のMCA領域のLDF読み取り。このトレースは、1 の確認を示しています。ネクタイによる頸動脈閉塞;2. MCAのフィラメントの配置;3.連続虚血の60分後のフィラメント除去;そして4。頸動脈がほどかれたときの再灌流。要素 a. と b. は、読み取り中に頸動脈をほどいて再度結んだときにドップラー トレースがどのように見えるかを示しています。この手法は、プローブの配置を確認するために使用できます。(B)ラットMCAO手順中のMCA領域のLDF読み取り。マウスと同様に、このトレースは 1 の確認を示しています。ネクタイと2による頸動脈閉塞。MCAでのフィラメントの配置。ラットMCAOの手順では、ドップラープローブがしばしば取り外され、動物は完全な虚血時間を目を覚まして動いています。再灌流のために、LDFは再灌流の前に再確立されます:3.フィラメントの除去を確認し、4.頸動脈が完全な再灌流に解かれていることを確認します。マウスとラットの両方のMCAO手順では、プローブの配置が成功した場合に、正しいフィラメントの配置を視覚化し、トレースがLDFの2つの明確で突然の減少(虚血の場合)を示し、続いてLDFの2つの明確で突然の増加(再灌流)を示す場合に示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:マウスとラットにおけるMCAO処置の失敗を示すレーザードップラーフローメトリートレースの例(A)ラットにおけるフィラメントの配置が決定的でないことを示すLDFトレースの例。頸動脈が結ばれ(1.)、緩み(2.)、再び結ばれた(3.)一方で、フィラメントがMCA OstiaにあったときのLDFの突然の低下ではなく、不明瞭でゆっくりとした低下が見られます。このトレースは、穿孔されたMCAを示している可能性があり、動物は再灌流の最初の24時間生き残れない可能性があります。フィラメントの穿孔は剖検で確認することができます。(B)マウスにおけるフィラメントの配置が決定的でないことを示すLDFトレースの例。このトレースでは、頸動脈の結びつきの証拠は決定的ではなく(1.)、続いてMCAオスティアでのフィラメントの配置に伴うLDFの不明瞭な低下が続きます(2.)。また、フィラメントをわずかに引き抜くと、相対的な脳血流の増加が緩慢になりました(3.)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

MCAO は、げっ歯類の脳動脈閉塞と再灌流をモデル化するためのゴールドスタンダードの手順であり、前臨床脳卒中研究の基礎であり、げっ歯類の限局性虚血の誘導を可能にして、ヒトの脳卒中病態生理学を模倣しています。これは、外科医間および外科医内の大きな変動性を伴う厳格な外科的処置です。LDFの適用がばらつきを減少させるという証拠はありませんが、一部のデザインでは科学的な厳密さと研究結果を改善する可能性があります。これは、LDFがフィラメントの配置を検証し、手術中にCBFに関するリアルタイムの情報を提供し、MCAの閉塞が発生したかどうかを確認するために実現されます。マウス研究の約75%がレーザードップラープローブの使用について述べている^12,13が、ラット研究のメタアナリシスでは報告されていない^{パラメータ14}である。LDFのよく使用される代替手段は、マークされたフィラメントを使用してフィラメントの挿入(例えば、ラットの総頸動脈分岐部から18〜20mm)を測定すること、または挿入点から突き出た残りのフィラメント(例えば、10mm)を測定することである¹⁰。しかし、この代替品はLDFよりも劣っており、フィラメント挿入の正確な深さは、ラットのサイズや体重、実験で使用される特定のプロトコルなどの要因によってわずかに異なる場合があります。このような違いは、血管穿孔または不完全な閉塞のリスクを考えると、MCAO手術の再現性にとって重要な考慮事項であり、どちらも否定的な手術結果です。

LDFはフィラメントの配置を検証する方法であり、SPANでサポートされていますが、公開されているSPAN-SOP⁵では必須のステップではありません。記載されているプロトコルは、主要な手順が仰臥位の動物に対して行われる場合、特別な装置の使用や頭蓋骨の背側部分への困難なプローブの配置などの障壁を克服します。これらの要因は、多くの場合、手術時間を延長します。対照的に、このプロトコルでは、単一のストレート レーザー ドップラー プローブとモニター、眼窩周囲配置位置を使用し、頭蓋骨の薄化は行いません。これらのステップを組み合わせると、手順が大幅に簡素化され短縮され(多くの場合5分未満)、文献^7,8,9,10に記載されている類似しているが代替の方法から大幅に改善されます。このプロトコルは、必要に応じて外科医が適応させることもできます。記載されている技術のトラブルシューティングには、特にステップ2.8で血流の減少が観察されない場合、プローブの再配置が必要であり、それが含まれる場合があります。

LDFの使用は、フィラメントの配置を確認することに限定されており、マウスおよびラットの方法^12,14で>20%であり得る梗塞サイズの変動とは関連していない。梗塞の変動性は、脳卒中前臨床研究における長年の問題でした。この増大した変動性は、ヒトの疾患¹³で観察される梗塞サイズの多様性を模倣しているかもしれないが、適切に考慮されていない場合、観察された変動性は、適切に検出力のない研究をもたらす可能性がある。分析法のばらつきを予測する単一の要因はありませんが、配置を確認することは薬効試験にとって重要な要素です。ここで説明するプロトコルは、マウスのMCAO手順ですでに採用されている可能性がありますが、文献⁹で背側配置についてより頻繁に説明されていることを考えると、ラットでは十分に活用されていない可能性があります。この簡略化されたレーザードップラープローブの配置の説明は、実験の精度とトランスレーショナルな関連性の向上を目指して、前臨床脳卒中研究方法論の改良に貢献すると考えています。

著者は何も開示していません。

この研究は、NINDS 1R41NS124450によって資金提供されました。バイオレンダリング:KT26JWLYF6

This corrects the article 10.3791/66839