Coleta de campo e identificação de rotina laboratorial de Rhodiola crenulata

Aqui, descrevemos a identificação de Rhodiola Crenulata a partir de habitat, morfologia vegetal, propriedades medicinais, características microscópicas e cromatografia em camada delgada.

A identificação de materiais medicinais é premissa e garantia da segurança medicamentosa. A maioria dos pesquisadores científicos é obrigada a favorecer o processo de identificação simples, rápido, eficaz e barato de ervas. Rhodiola crenulata é um medicamento tradicional tibetano cultivado em grandes altitudes, distribuído principalmente no Tibete, Yunnan, e Sichuan regiões da China. Crenulato de Rhodiola possui múltiplas bioatividades, tais como anti-inflamatório, anti-hipóxia, e propriedades antioxidantes, e tem grande potencial para o desenvolvimento. Com a crescente demanda do mercado e uma rápida diminuição no conteúdo de recursos, um grande número de produtos confusos de Rhodiola crenulata têm incomodado as pessoas. Portanto, este protocolo introduz um processo padrão para a identificação de Rhodiola crenulata no campo combinado com testes laboratoriais de rotina. A combinação de habitat, características microscópicas e cromatografia em camada fina sem dúvida identificará Rhodiola crenulata de forma rápida, eficiente e econômica, contribuindo para o desenvolvimento contínuo da medicina tibetana e o controle de qualidade de materiais medicinais.

A fitoterapia tem uma longa história e rica experiência de aplicação na China, e foi o primeiro registro sistemático no clássico herbal de Shennong¹. A descoberta da artemisinina aplicada à malária promoveu o desenvolvimento da fitoterapia em uma nova etapa¹. O uso de tecnologia científica moderna para desvendar o mecanismo exato da fitoterapia aumenta a taxa de utilização e a demanda por fitoterápicos, abrindo um novo mercado internacional para a^mesma2,3,4. No entanto, isso levou a uma série de efeitos negativos. Os não-profissionais têm uma compreensão vaga das características da fitoterapia, o que faz com que o uso de fitoterápicos enfrente um enorme risco de segurança⁵.

Rhodiola crenulata, uma das plantas da espécie Rhodiola, distribui-se principalmente no Tibete, noroeste de Yunnan e oeste de Sichuan da China (Figura 1)^6,7. Rhodiola crenulata compreende salidrósido, tirosol, ácido gálico e outros compostos para o tratamento de doenças relacionadas à hipóxia através da função de "revigorar o qi e promover a circulação sanguínea, limpar o pulso e acalmar a asma"8,9,10,11. A investigação de campo mostra que Rhodiola crenulata pode ser encontrada nas zonas de talus alpino, encostas de voçorocas e fendas rochosas a uma altitude de 4.000-5.600 m. Seu ambiente de crescimento é frio, cheio de sol e intensa radiação, e pertence ao ecossistema de prados alpinos. Rhodiola crenulata pode ser distribuída em populações lamelares e pontiagudas de acordo com o terreno de crescimento, e o fluxo gênico pode ser realizado através da polinização cruzada.

O aborto polínico do gênero Rhodiola, a escavação ilegal e o ambiente ecológico degenerado fazem da Rhodiola crenulata uma espécie ameaçada de extinção ^6,12. Tendo em vista o alto valor medicinal da Rhodiola crenulata, espera-se que os produtos falsificados fluam para o mercado. Este artigo apresenta o habitat de Rhodiola crenulata e alguns métodos convenientes de identificação laboratorial. Primeiramente, observamos o ambiente de crescimento da Rhodiola crenulata e suas propriedades medicinais. Em segundo lugar, a microestrutura do pó medicinal foi observada ao microscópio. O último passo é o ponto-chave. Os componentes representativos de Rhodiola crenulata foram separados e identificados de acordo com as diferentes propriedades de adsorção ou dissolução desses componentes em uma determinada substância. Métodos de autenticação baseados em DNA ou análise metabolômica de plantas medicinais são complicados e caros¹³. Estes métodos básicos, convenientes, e econômicos podem identificar rapidamente Rhodiola crenulata.

Rhodiola crenulata é coletada da Montanha de Neve de Zhuoda, Condado de Ganzi, Prefeitura Autônoma Tibetana de Ganzi, Província de Sichuan, China (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 m). As plantas são autenticadas como genuínas pelo professor Yi Zhang na Escola de Medicina Étnica da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu.

1. Coleção de Rhodiola crenulata

1. Fotografe o mapa de habitat de Rhodiola crenulata.
2. Fotografe toda a planta, folhas, cálice e rizoma de Rhodiola crenulata.
3. Use uma pá para limpar as ervas daninhas e pedras quebradas dentro de 1 m da Rhodiola crenulata para garantir a mineração suave subsequente.
4. Desenterre o solo com uma enxada até que toda a rizosfera seja vista e colete a raiz da torneira.
   NOTA: As raízes e rizomas de Rhodiola crenulata usados em partes medicinais devem ser coletados no outono, quando os caules da flor murcham.

2. Identificação das características

1. Observe os traços de aparência de Rhodiola crenulata a olho nu: raízes e rizomas cilíndricos e curtos, superfície marrom, epiderme amarela membranosa com padrão rosa e fatias vermelho-alaranjadas ou bordô.
2. Identifique-o pelo cheiro: Dá um cheiro perfumado quando perto do nariz.
3. Identifique-o pelo gosto: Leve um pequeno pedaço de raiz para a boca, primeiro beba e depois mastigue, gosto ligeiramente amargo, depois doce.

3. Identificação microscópica de grânulos de amido em pó medicinal

1. Retire o solo na superfície da Rhodiola crenulata com um pincel, coloque-o no forno a 40 °C e vire as ervas a cada 24 h.
   OBS: A facilidade de quebra de materiais medicinais é considerada o padrão para secagem de umidade.
2. Pulverizar os materiais medicinais secos usando uma máquina de pó e filtrar o pó medicinal usando a peneira medicamentosa nº 3 (ver Tabela de Materiais).
3. Pegue uma lâmina limpa (consulte Tabela de Materiais), cave o pó com uma agulha dissecante (consulte Tabela de Materiais) e coloque-o uniformemente em um terço da lâmina dentro de 2 mm.
4. Use um conta-gotas de vidro (consulte Tabela de Materiais) para adicionar uma gota de água deionizada ao pó. Use uma pinça (consulte Tabela de Materiais) para segurar uma extremidade do vidro da tampa (consulte Tabela de Materiais) para tocar o nível de líquido rapidamente e cobrir o pó.
   NOTA: Use uma agulha anatômica para misturar suavemente água e pó medicinal para garantir uma mistura uniforme da amostra. Não deve haver bolhas de ar entre a lâmina, o pó e o vidro da tampa.
5. Abra o microscópio (ver Tabela de Materiais) e coloque a lâmina na etapa 3.4 na plataforma para prendê-la. Ajuste a fonte de luz e a espiral de foco grosso para ver o pó. Ajuste a espiral parafocal fina até que os tecidos sejam vistos claramente. Mude para uma objetiva de 40x e observe os grânulos de amido.
   NOTA: Amido os grãos que se apresentam como grãos únicos ou múltiplos, e o ponto umbilical aparece em forma de espinha de arenque ou rachadura.

4. Identificação microscópica de cateteres, células de cortiça, fibras, células do parênquima da madeira e massas pigmentares em pó medicinal

1. Pegue uma lâmina limpa (consulte Tabela de Materiais), cave o pó com uma agulha dissecante (consulte Tabela de Materiais) e coloque-a em um terço da lâmina.
2. Use um conta-gotas de vidro (consulte a Tabela de Materiais) para adicionar uma gota de hidrato de cloral (consulte a Tabela de Materiais) ao pó. Pegue o slide com uma pinça (veja Tabela de Materiais) e aqueça-o na lâmpada de álcool três vezes, cada vez por 1 s.
   NOTA: As bolhas devem ser evitadas durante o aquecimento. O líquido permanece sem fluir, indicando que a penetração está completa.
3. Use um conta-gotas de vidro para adicionar uma gota de glicerina (consulte a Tabela de Materiais). Use uma pinça para segurar uma extremidade do vidro da tampa para tocar o nível do líquido rapidamente.
4. Abra o microscópio e coloque a lâmina na plataforma para prendê-la. Ajuste a fonte de luz e a espiral de foco grosso para ver o pó. Ajuste a espiral parafocal fina até que os tecidos sejam vistos claramente. Observe o cateter, as células de cortiça, as fibras, as células do parênquima da madeira e o bloqueio de pigmentos mudando para uma lente objetiva de 40x.
   NOTA: Poligonal ou poligonal longa de células de cortiça, vaso espiral com estrutura helicoidal óbvia, parênquima de xilema contendo cristais de areia de oxalato de cálcio e bloco de pigmento vermelho ou vermelho-acastanhado.

5. Preparação de amostras cromatográficas em camada delgada (CCD) de Rhodiola crenulata e sua referência

1. Coloque o papel de pesagem na balança (ver Tabela de Materiais) e pese 3 g de pó de Rhodiola crenulata.
2. Leve o pó para um frasco cônico de 100 mL (consulte a Tabela de Materiais) e adicione 25 mL de metanol com uma pipeta de barriga grande (consulte a Tabela de Materiais). Coloque o frasco cônico no instrumento ultrassônico. Defina a potência para 250 W, frequência para 40 kHz e tempo para 30 min (consulte Tabela de Materiais) e ligue o instrumento.
   NOTA: O objetivo do instrumento de ultrassom é garantir que o pó de Rhodiola crenulata seja completamente dissolvido sem afetar os resultados de experimentos cromatográficos de camada fina subsequentes.
3. Retire o frasco cónico e lave o frasco exterior com água corrente até à temperatura ambiente (RT).
4. Aspirar 800 μL de líquido preparado na etapa 5.3 com uma seringa de 1 mL. Filtrar com membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) e coletar 400 μL de solução de amostra midstream de Rhodiola crenulata em um frasco de amostra cromatográfica.
5. Pesar e adicionar 2 mg de salidrósido, tirosol e ácido gálico (ver Tabela de Materiais) em 3 frascos cónicos separados de 100 ml, respetivamente. Adicione 25 mL de metanol com uma pipeta de barriga grande em cada frasco cônico.
6. Coloque o frasco cônico no instrumento ultrassônico, ajuste a potência para 250 W, a frequência para 40 kHz e o tempo para 30 minutos e repita a etapa 5.3 (consulte a Tabela de Materiais).
7. Aspirar 800 μL de líquido preparado na etapa 5.6 com uma seringa de 1 mL. Filtrar com membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) e recolher 400 μL de solução padrão de salidrósido, tirosol e ácido gálico nos frascos de amostra cromatográficos correspondentes.

6. Identificação do CPT

1. Pipeta triclorometano (5 mL), acetato de etila (4 mL), metanol (2 mL) e ácido fórmico (0,5 mL) (ver Tabela de Materiais). Adicione a um lado do cilindro de cromatografia de tanque duplo (consulte a Tabela de Materiais), agite e misture uniformemente. Cubra o cabeçote superior.
2. Coloque o ácido gálico, o salidrósido, a solução padrão de tirosol e a solução de Rhodiola crenulata no rack de amostras nas posições A1-A4.
3. Coloque a folha de silicone de 5 cm x 10 cm (ver Tabela de Materiais) na tabela de amostragem. Ligue a máquina de amostragem automática (consulte Tabela de Materiais) e abra a válvula de controle de ar.
4. Abra o software visionCATS (consulte a Tabela de Materiais). Clique em Nova > Nova pasta (chamada Rhodiola crenulata teste de exemplo) > OK. Clique em Novo método (nome Rhodiola crenulata sample test) > OK > ATS 4.
5. Clique em Concluir Definição da Etapa. Clique em Rastrear atribuição para editar a descrição (ácido gálico, salidrósido, tirosol e Rhodiola crenulata amostra).
6. Clique em Etapas HPTLC. Defina os parâmetros da camada fina (5 cm x 10 cm). Selecione Tipo de aplicativo (banda), defina os parâmetros (Tabela 1) e clique no botão OK .
7. Qualidade de enxágue/enxágue aberto. Marque Preencher somente Volume Programado. Defina o nível inferior do frasco para injetáveis (mm) como 0,5 e clique no botão OK.
8. Clique em Executar método.
9. Clique no botão Controlar Atribuição , marque Central e defina os parâmetros (Tabela 2).
10. Clique no botão Continuar para obter amostras automáticas.
11. Desligue a máquina de amostragem automática e a válvula de ar. Remova a folha de silicone da máquina de amostragem automática.
12. Coloque a folha de silicone no outro lado do cilindro de cromatografia de tanque duplo na etapa 6.1, cubra o cabeçote superior e pré-saturar por 20 min.
13. Aperte suavemente a extremidade superior da placa de camada fina com um tweezer, coloque rapidamente a folha de silicone no agente revelador e cubra a cabeça superior do cilindro.
    NOTA: Retire a folha de silicone quando a borda frontal de desdobramento estiver a 0,5-1,0 cm de distância da extremidade superior da placa de camada fina.
14. Depois que o solvente orgânico evaporar, pulverize a solução cromogênica na superfície da folha de silicone à temperatura ambiente para obter resultados cromogênicos.
    NOTA: A solução cromogênica é uma solução aquosa contendo 2% de FeCl₃ e 1% de K₃[Fe(CN)₆].

Este protocolo experimental descreve a identificação e coleta de crenulato de Rhodiola no campo. Rhodiola crenulate tende a viver nas zonas de talus alpino, encostas de voçorocas, e fendas rochosas em grandes altitudes. O habitat, planta inteira, flor e folhas de Rhodiola crenulate podem ser mostrados na Figura 2. O crenulado de Rhodiola tem um rizoma marrom-avermelhado (Figura 3A). Uma imagem representativa do pó medicinal é mostrada na Figura 3B. De acordo com o protocolo experimental acima, os resultados microscópicos podem ser listados da seguinte forma: 1) células de cortiça amareladas acastanhadas ou incolores, de aparência grande, poligonais ou poligonais longas, com paredes ligeiramente mais espessas (Figura 3C); 2) grãos de amido apresentando-se como grãos únicos ou múltiplos, e ponto umbilical aparecendo em forma de espinha de arenque ou fissura (Figura 3D); 3) principalmente vasos espirais que estão intimamente dispostos (Figura 3E); 4) parênquima acromático e oval do xilema apresentando-se em folhas e contendo cristais de areia de oxalato de cálcio (Figura 3F); 5) bloco pigmentar de forma irregular, marrom-avermelhado (Figura 3G). Os resultados da separação por camada delgada mostraram que a amostra de Rhodiola crenulata (A4) apareceu como manchas da mesma cor na posição correspondente ao cromatograma do ácido gálico (A1), salidrósido (A2), solução padrão de tirosol (A3) (Figura 3H). Ácido gálico, salidrósido, e tirosol são os componentes principais e representativos do crenulato de Rhodiola. Estes resultados mostram que uma identificação preliminar de Rhodiola crenulata é possível com os testes discutidos no protocolo.

Figura 1: Mapa de distribuição de Rhodiola crenulata. (A) Rhodiola crenulata é distribuída principalmente na China, Índia, Nepal e Butão¹⁴. (B) Rhodiola crenulata é distribuída principalmente no Tibete, Qinghai, Sichuan, Yunnan, e Guizhou da China (produzido por ArcGis 10.6 macio). Os dados estatísticos são provenientes dos sites do Instituto de Botânica^15,16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem da planta Rhodiola crenulata (A) Biótopo de Rhodiola crenulate. (B) Tiro próximo de Rhodiola crenulate. (C) Planta inteira de Rhodiola crenulate. (D) Flor de Rhodiola crenulata. (E) Folhas de Rhodiola crenulate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Características microscópicas e cromatograma em camada delgada de Rhodiola crenulata. (A) Raiz medicinal de Rhodiola crenulata. (B) Poder material medicinal de Rhodiola crenulata. (C) Célula de cortiça. (D) Grãos de amido. (E) Vaso espiral. (F) Parênquima de xilema (cristal de oxalato de cálcio). (G) Pigmento. (H) A separação cromatográfica em camada delgada de salidrósido (A1), ácido gálico (A2), tirosol (A3) e Rhodiola crenulata (A4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Configurações de parâmetros da posição de amostragem automática.

Tabela 2: Configurações de parâmetros da ordem automática de amostragem.

Existem mais de 90 espécies de plantas Rhodiola no mundo, e mais de 60% de todas as espécies são encontradas na China, incluindo Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis, e Rhodiola algida¹⁷. Rhodiola crenulata, registrada na primeira parte da Farmacopeia Chinesa (2020), é um medicamento tradicional tibetano cultivado em grandes altitudes. A demanda do mercado para Rhodiola crenulata está aumentando anualmente, portanto, garantir o uso correto da fonte é a chave para garantir o uso seguro. Particularmente, a padronização desde a seleção de campo até a simples e rápida identificação da rotina laboratorial não pode ser ignorada. Tem sido relatado que cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e repetições de sequência simples podem identificar com precisão o crenulato de Rhodiola de outras espécies de Rhodiola, o que é demorado, complexo e caro 18,19,20. Enquanto isso, estabelecemos um método de avaliação multidimensional de reconhecimento sensorial (nariz E e análise de cor) e método de HPLC para distinguir o crenulato de Rhodiola^21,22.

Cada material medicinal tem seu ambiente de cultivo único, características de estrutura microscópica e componentes índices. Este protocolo fornece um método abrangente para identificar Rhodiola crenulata, desde a identificação de campo até a microscopia de laboratório e validação usando cromatografia em camada delgada. Rhodiola crenulata cresce principalmente em altitudes superiores a 3000 m, baixa temperatura, baixo oxigênio e áreas de alta radiação ultravioleta²³. Rhodiola crenulata é uma erva suculenta, que é sua característica visual intuitiva. Seu pó aparece marrom avermelhado com um cheiro perfumado. Com base em seus hábitos, morfologia da planta, flores, e folhas, Rhodiola crenulata é distinguido de outras espécies de Rhodiola no campo. Os resultados microscópicos dos materiais medicinais mostraram a existência de grânulos de amido, células do parênquima da madeira (incluindo cristais de areia de oxalato de cálcio), células de cortiça, conduto (principalmente conduto roscado) e grandes quantidades de pigmento vermelho. TLC é uma técnica de separação cromatográfica para a separação de amostras multicomponentes, comumente usada na identificação de materiais medicinais chineses. Ácido gálico, tirosol e salidrósido são frequentemente identificados como os componentes índice do crenulato de Rhodiola²⁴. Os resultados da cromatografia em camada delgada mostraram que a solução de Rhodiola crenulata apresentou as mesmas manchas coloridas na posição correspondente ao controle (ácido gálico, tirosol e salidrósido). Ele mostra que Rhodiola crenulata contém ácido gálico, tirosol, e salidrósido. Combinado com o conhecimento do ambiente de crescimento e resultados microscópicos, Rhodiola crenulata pode ser preliminarmente identificado.

Vale a pena notar que o ambiente de cultivo único determina que é quase impossível ter Rhodiola crenulata selvagem abaixo da altitude de 3000 m. Além disso, não é recomendado colher as raízes e rizoma de Rhodiola crenulata durante o período de floração. Para a identificação microscópica laboratorial, a secagem das raízes e a peneiração do pó são pré-requisitos para a preparação bem-sucedida de amostras microscópicas. Garantir que não haja bolha de ar entre a lâmina, o pó medicinal e o vidro da tampa também é fundamental para observar a composição característica sob o microscópio. Para cromatografia em camada delgada, a pré-saturação da placa de sílica gel, o agente de revelação razoável e a concentração da amostra são fatores importantes para separar com sucesso diferentes componentes na amostra de teste. Em comparação com a amostragem manual tradicional, o processo de amostragem automática deste protocolo sem dúvida aumenta a precisão dos resultados e a repetibilidade do experimento. A subjetividade da identificação do aroma e do sabor é muito forte e pode levar a julgamentos equivocados. Em comparação com cromatografia líquida de alta eficiência, ressonância magnética nuclear H e espectrometria de massas, a cromatografia em camada delgada não pode analisar quantitativamente o conteúdo de compostos em materiais medicinais²⁵. Embora o DNA barcoding tenha acurácia superior na identificação fitoterápica, seu alto preço determina que ele não seja universal na identificação de materiais medicinais²⁶. Além disso, a identificação campo-laboratório e a microscopia combinadas com a técnica de cromatografia em camada delgada fornecida neste protocolo são aplicáveis a quase todos os materiais medicinais. Este é um processo barato, simples e rápido para a identificação de quaisquer materiais medicinais à base de plantas.

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973569, 82274207 e 82104533), pelo Xinglin Scholar Research Promotion Project da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013) e pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Chave de Ningxia (2023BEG02012).