Recolección de campo e identificación rutinaria de laboratorio de Rhodiola crenulata

Aquí, describimos la identificación de Rhodiola Crenulata a partir del hábitat, la morfología de la planta, las propiedades medicinales, las características microscópicas y la cromatografía en capa fina.

La identificación de los materiales medicinales es la premisa y garantía de la seguridad de los medicamentos. La mayoría de los investigadores científicos están obligados a favorecer el proceso de identificación simple, rápido, efectivo y económico de las hierbas. La Rhodiola crenulata es una medicina tradicional tibetana que se cultiva a gran altitud, distribuida principalmente en las regiones chinas de Tíbet, Yunnan y Sichuan. La crenulato de Rhodiola posee múltiples bioactividades, como propiedades antiinflamatorias, antihipoxia y antioxidantes, y tiene un gran potencial de desarrollo. Con el aumento de la demanda del mercado y una rápida disminución en el contenido de recursos, una gran cantidad de productos confusos de Rhodiola crenulata han estado preocupando a las personas. Por lo tanto, este protocolo introduce un proceso estándar para la identificación de Rhodiola crenulata en el campo combinado con pruebas de laboratorio de rutina. La combinación del hábitat, las características microscópicas y la cromatografía de capa delgada sin duda identificará a Rhodiola crenulata de manera rápida, eficiente y económica, contribuyendo al desarrollo continuo de la medicina tibetana y al control de calidad de los materiales medicinales.

La medicina herbal tiene una larga historia y una rica experiencia de aplicación en China, y fue el primer registro sistemático en el clásico herbal de Shennong¹. El descubrimiento de la artemisinina aplicada a la malaria promovió el desarrollo de la medicina herbal en una nueva etapa¹. El uso de la tecnología científica moderna para descubrir el mecanismo exacto de la medicina herbaria aumenta la tasa de utilización y la demanda de la medicina herbal, abriendo un nuevo mercado internacional para ella ^2,3,4. Sin embargo, esto ha provocado una serie de efectos negativos. Los no profesionales tienen una comprensión vaga de las características de la fitoterapia, lo que hace que el uso de la fitoterapia se enfrente a un enorme riesgo de seguridad⁵.

Rhodiola crenulata, una de las plantas de la especie Rhodiola, se distribuye principalmente en el Tíbet, el noroeste de Yunnan y el oeste de Sichuan en China (Figura 1)^6,7. La Rhodiola crenulata comprende salidrósido, tirosol, ácido gálico y otros compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la hipóxica a través de la función de "vigorizar el qi y promover la circulación sanguínea, limpiar el pulso y calmar el asma"8,9,10,11. La investigación de campo muestra que Rhodiola crenulata se puede encontrar en las zonas de taludes alpinos, laderas de barrancos y grietas rocosas a una altitud de 4.000-5.600 m. Su entorno de cultivo es frío, lleno de sol y radiación intensa, y pertenece al ecosistema de la pradera alpina. Rhodiola crenulata puede distribuirse en poblaciones laminares y puntuales según el terreno de crecimiento, y el flujo génico puede llevarse a cabo a través de la polinización cruzada.

El aborto polínico del género Rhodiola, la ilegalidad de la excavación y el ambiente ecológico degenerado hacen de Rhodiola crenulata una especie en peligro de extinción ^6,12. En vista del alto valor medicinal de la Rhodiola crenulata, se espera que los productos falsificados fluyan hacia el mercado. Este artículo presenta el hábitat de Rhodiola crenulata y algunos métodos convenientes de identificación de laboratorio. En primer lugar, observamos el entorno de crecimiento de Rhodiola crenulata y sus propiedades medicinales. En segundo lugar, se observó la microestructura del polvo medicinal al microscopio. El último paso es el punto clave. Los componentes representativos de Rhodiola crenulata se separaron e identificaron de acuerdo con las diferentes propiedades de adsorción o disolución de estos componentes en una determinada sustancia. Los métodos de autenticación basada en el ADN o análisis metabolómico de plantas medicinales son complicados y costosos¹³. Estos métodos básicos, convenientes y económicos pueden identificar rápidamente la Rhodiola crenulata.

Rhodiola crenulata se recolecta en la montaña nevada de Zhuoda, condado de Ganzi, prefectura autónoma tibetana de Ganzi, provincia de Sichuan, China (N 31.44570°, E 99.96086°, 4892 m). Las plantas son autentificadas como genuinas por el profesor Yi Zhang de la Escuela de Medicina Étnica de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu.

1. Colección de Rhodiola crenulata

1. Fotografía el mapa del hábitat de Rhodiola crenulata.
2. Fotografía toda la planta, las hojas, el cáliz y el rizoma de Rhodiola crenulata.
3. Use una pala para limpiar las malezas y las piedras rotas dentro de 1 m de la Rhodiola crenulata para garantizar la extracción suave posterior.
4. Desentierra la tierra con una azada hasta que se vea toda la rizosfera y recoge la raíz principal.
   NOTA: Las raíces y rizomas de Rhodiola crenulata utilizados en partes medicinales deben recolectarse en otoño, cuando los tallos de las flores se marchitan.

2. Identificación de características

1. Observe los rasgos de apariencia de Rhodiola crenulata a simple vista: raíces y rizomas cilíndricos y cortos, superficie marrón, epidermis membranosa amarilla con un patrón rosado y rodajas de color rojo anaranjado o burdeos.
2. Identifícalo por el olor: Da un olor fragante cuando está cerca de la nariz.
3. Identifíquelo por su sabor: Tome un pequeño trozo de raíz en la boca, primero beba y luego mastique, tenga un sabor ligeramente amargo, luego dulce.

3. Identificación microscópica de gránulos de almidón en polvo medicinal

1. Retire la tierra de la superficie de la Rhodiola crenulata con un cepillo, póngala en el horno a 40 °C y voltee las hierbas cada 24 h.
   NOTA: La facilidad de rotura de los materiales medicinales se considera el estándar para secar la humedad.
2. Pulverizar los materiales medicinales secos con una máquina de polvo y filtrar el polvo medicinal con el tamiz medicado Nº 3 (véase la Tabla de Materiales).
3. Tome un portaobjetos limpio (ver Tabla de Materiales), excave el polvo con una aguja de disección (ver Tabla de Materiales) y colóquelo uniformemente en un tercio del portaobjetos dentro de 2 mm.
4. Use un gotero de vidrio (consulte la Tabla de materiales) para agregar una gota de agua desionizada al polvo. Use una pinza (ver Tabla de Materiales) para sostener un extremo de la cubierta de vidrio (ver Tabla de Materiales) para tocar el nivel de líquido rápidamente y cubrir el polvo.
   NOTA: Utilice una aguja anatómica para mezclar suavemente el agua y el polvo medicinal para garantizar una mezcla uniforme de la muestra. No debe haber burbujas de aire entre el portaobjetos, el polvo y la cubierta de vidrio.
5. Abra el microscopio (consulte la tabla de materiales) y coloque el portaobjetos del paso 3.4 sobre la plataforma para asegurarlo. Ajuste la fuente de luz y la espiral de enfoque grueso para ver el polvo. Ajuste la espiral parafocal fina hasta que los tejidos se vean claramente. Cambie a un objetivo de 40x y observe los gránulos de almidón.
   NOTA: El almidón de los granos se presenta como granos simples o múltiples, y el punto umbilical aparece en forma de espiga o grieta.

4. Identificación microscópica de catéteres, células de corcho, fibras, células del parénquima de la madera y masas pigmentarias en polvo medicinal

1. Tome un portaobjetos limpio (ver Tabla de Materiales), excave el polvo con una aguja de disección (ver Tabla de Materiales) y colóquelo en un tercio del portaobjetos.
2. Use un gotero de vidrio (ver Tabla de Materiales) para agregar una gota de hidrato de cloral (ver Tabla de Materiales) al polvo. Tome el portaobjetos con una pinza (ver Tabla de materiales) y caliéntelo en la lámpara de alcohol tres veces, cada vez durante 1 s.
   NOTA: Se deben evitar las burbujas durante el calentamiento. El líquido permanece sin fluir, lo que indica que la penetración es completa.
3. Use un gotero de vidrio para agregar una gota de glicerina (consulte la Tabla de materiales). Use una pinza para sostener un extremo de la cubierta de vidrio para tocar el nivel de líquido rápidamente.
4. Abra el microscopio y coloque el portaobjetos en la plataforma para asegurarlo. Ajuste la fuente de luz y la espiral de enfoque grueso para ver el polvo. Ajuste la espiral parafocal fina hasta que los tejidos se vean claramente. Observe el catéter, las células de corcho, las fibras, las células del parénquima de la madera y el bloque de pigmento cambiando a una lente de objetivo de 40x.
   NOTA: Poligonal o poligonal largo de las células de corcho, vaso espiral con estructura helicoidal evidente, parénquima del xilema que contiene cristales de arena de oxalato cálcico y bloque de pigmento rojo o rojo parduzco.

5. Preparación de muestras cromatográficas en capa fina (TLC) de Rhodiola crenulata y su referencia

1. Coloque el papel de pesaje en la balanza (consulte la tabla de materiales) y pese 3 g de polvo de Rhodiola crenulata.
2. Tome el polvo en un frasco cónico de 100 ml (consulte la tabla de materiales) y agregue 25 ml de metanol con una pipeta de vientre grande (consulte la tabla de materiales). Coloque el frasco cónico en el instrumento ultrasónico. Ajuste la potencia a 250 W, la frecuencia a 40 kHz y el tiempo a 30 min (consulte la Tabla de materiales) y encienda el instrumento.
   NOTA: El propósito del instrumento de ultrasonido es asegurar que el polvo de Rhodiola crenulata se disuelva completamente sin afectar los resultados de los experimentos cromatográficos de capa delgada posteriores.
3. Retire la botella cónica y enjuague la botella exterior con agua corriente hasta que esté a temperatura ambiente (RT).
4. Aspirar 800 μL de líquido preparado en el paso 5.3 con una jeringa de 1 mL. Filtrar con una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabla de materiales) y recoger 400 μL de solución de muestra de Rhodiola crenulata en un frasco de muestra cromatográfica.
5. Pesar y agregar 2 mg de salidrósido, tirosol y ácido gálico (ver Tabla de materiales) en 3 frascos cónicos separados de 100 ml, respectivamente. Agregue 25 ml de metanol con una pipeta de vientre grande en cada botella cónica.
6. Coloque la botella cónica en el instrumento ultrasónico, ajuste la potencia a 250 W, la frecuencia a 40 kHz y el tiempo a 30 min, y repita el paso 5.3 (consulte la Tabla de materiales).
7. Aspirar 800 μL de líquido preparado en el paso 5.6 con una jeringa de 1 mL. Filtrar con una membrana filtrante microporosa de 0,22 μm (ver Tabla de materiales) y recolectar 400 μL de solución estándar de salidrósido, tirosol y ácido gálico en los frascos de muestra cromatográfica correspondientes.

6. Identificación TLC

1. Pipeta triclorometano (5 mL), acetato de etilo (4 mL), metanol (2 mL) y ácido fórmico (0,5 mL) (ver Tabla de Materiales). Agregue a un lado del cilindro de cromatografía de doble tanque (consulte la Tabla de materiales), agite y mezcle uniformemente. Cubra la culata superior.
2. Coloque el ácido gálico, el salidrósido, la solución estándar de tirosol y la solución de Rhodiola crenulata en la gradilla de muestras en las posiciones A1-A4.
3. Coloque la lámina de silicona de 5 cm x 10 cm (ver Tabla de Materiales) sobre la mesa de muestreo. Encienda la máquina de muestreo automático (consulte la Tabla de materiales) y abra la válvula de control de aire.
4. Abra el software visionCATS (consulte la tabla de materiales). Haga clic en Nueva > Nueva carpeta ( denominada Rhodiola crenulata sample test) > Aceptar. Haga clic en Nuevo método (nombre prueba de muestra de Rhodiola crenulata ) > Aceptar > ATS 4.
5. Haga clic en Finalizar definición de paso. Haga clic en Asignación de pista para editar la descripción (muestra de ácido gálico, salidrósido, tirosol y Rhodiola crenulata ).
6. Haga clic en Pasos de HPTLC. Establezca los parámetros de la capa fina (5 cm x 10 cm). Seleccione Tipo de aplicación (banda), establezca los parámetros (Tabla 1) y haga clic en el botón Aceptar .
7. Calidad de llenado/enjuague abierta. Marque Rellenar solo volumen programado. Ajuste el nivel inferior del vial (mm) a 0,5 y haga clic en el botón Aceptar.
8. Haga clic en Ejecutar método.
9. Haga clic en el botón Asignación de pistas , marque Centro y establezca los parámetros (Tabla 2).
10. Haga clic en el botón Continuar para el muestreo automático.
11. Apague la máquina de muestreo automático y la válvula de aire. Retire la lámina de silicona de la máquina de muestreo automático.
12. Coloque la lámina de silicona en el otro lado del cilindro de cromatografía de doble tanque en el paso 6.1, cubra la culata superior y sature previamente durante 20 minutos.
13. Sujete suavemente el extremo superior de la placa de capa delgada con una pinza, coloque rápidamente la lámina de silicona en el agente de desarrollo y cubra la culata superior.
    NOTA: Saque la lámina de silicona cuando el borde frontal desplegado esté a 0,5-1,0 cm del extremo superior de la placa de capa delgada.
14. Después de que el solvente orgánico se evapore, rocíe la solución cromogénica sobre la superficie de la lámina de silicona a temperatura ambiente para obtener resultados cromogénicos.
    NOTA: La solución cromogénica es una solución acuosa que contiene un 2% de FeCl₃ y un 1% de K₃[Fe(CN)₆].

Este protocolo experimental describe la identificación y recolección de crenulato de Rhodiola en el campo. La crenula de Rhodiola tiende a vivir en las zonas de talud alpino, laderas de barrancos y grietas rocosas a grandes altitudes. El hábitat, la planta entera, la flor y las hojas de Rhodiola crenulate se pueden mostrar en la Figura 2. La crenula de Rhodiola tiene un rizoma de color marrón rojizo (Figura 3A). En la Figura 3B se muestra una imagen representativa del polvo medicinal. De acuerdo con el protocolo experimental anterior, los resultados microscópicos se pueden enumerar de la siguiente manera: 1) células de corcho de color amarillo parduzco o incoloro, de apariencia grande, poligonales o poligonales largas, con paredes ligeramente más gruesas (Figura 3C); 2) granos de almidón que se presentan como granos simples o múltiples, y punto umbilical que aparece en forma de espiga o grieta (Figura 3D); 3) principalmente vasos espirales que están muy cerca (Figura 3E); 4) parénquima de xilema acromático y ovalado que se presenta en láminas y contiene cristales de arena de oxalato cálcico (Figura 3F); 5) bloque de pigmento de color marrón rojizo de forma irregular (Figura 3G). Los resultados de la separación en capa delgada mostraron que la muestra de Rhodiola crenulata (A4) apareció como manchas del mismo color en la posición correspondiente al cromatograma de la solución estándar de ácido gálico (A1), salidrósido (A2), tirosol (A3) (Figura 3H). El ácido gálico, el salidrósido y el tirosol son los componentes principales y representativos del crenulato de Rhodiola. Estos resultados muestran que es posible una identificación preliminar de Rhodiola crenulata con las pruebas discutidas en el protocolo.

Figura 1: Mapa de distribución de Rhodiola crenulata. (A) Rhodiola crenulata se distribuye principalmente en China, India, Nepal y Bután¹⁴. (B) Rhodiola crenulata se distribuye principalmente en el Tíbet, Qinghai, Sichuan, Yunnan y Guizhou de China (producida por ArcGis 10.6). Los datos estadísticos provienen de los sitios web del Instituto de Botánica ^15,16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen de la planta de Rhodiola crenulata . (A) Biotopo de Rhodiola crenulate. (B) Primer plano de crenulato de Rhodiola. (C) Planta entera de crenulato de Rhodiola. d) Flor de Rhodiola crenulata. e) Hojas de Rhodiola crenulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Características microscópicas y cromatograma en capa fina de Rhodiola crenulata. (A) Raíz medicinal de Rhodiola crenulata. (B) Poder material medicinal de Rhodiola crenulata. (C) Célula de corcho. (D) Grano de almidón. (E) Vaso en espiral. (F) Parénquima del xilema (cristal de oxalato cálcico). g) Pigmento. (H) La separación por cromatografía en capa fina de salidrósido (A1), ácido gálico (A2), tirosol (A3) y Rhodiola crenulata (A4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ajustes de parámetros de la posición de muestreo automático.

Tabla 2: Ajustes de parámetros del orden de muestreo automático.

Hay más de 90 especies de plantas de Rhodiola en el mundo, y más del 60% de todas las especies se encuentran en China, las comunes incluyen Rhodiola crenulata, Rhodiola rosea, Rhodiolas achalinensis y Rhodiola algida¹⁷. Rhodiola crenulata, registrada en la primera parte de la Farmacopea China (2020), es una medicina tradicional tibetana cultivada a gran altitud. La demanda del mercado de Rhodiola crenulata aumenta cada año, por lo que garantizar el uso correcto de la fuente es la clave para garantizar un uso seguro. En particular, no se puede ignorar la estandarización desde la selección de campo hasta la identificación simple y rápida de la rutina de laboratorio. Se ha reportado que la cromatografía líquida de alta resolución, la espectrometría de masas y las repeticiones de secuencias intersimples pueden identificar con precisión el crenulato de Rhodiola de otras especies de Rhodiola, lo cual requiere mucho tiempo, es complejo y costoso 18,19,20. Mientras tanto, hemos establecido un método de evaluación multidimensional de reconocimiento sensorial (E-nariz y análisis de color) y un método de HPLC para distinguir la crenula de Rhodiola^21,22.

Cada material medicinal tiene su entorno de cultivo único, características de estructura microscópica y componentes índice. Este protocolo proporciona un método integral para identificar Rhodiola crenulata, desde la identificación de campo hasta la microscopía de laboratorio y la validación mediante cromatografía en capa fina. Rhodiola crenulata crece principalmente en altitudes superiores a los 3000 m, baja temperatura, bajo oxígeno y alta radiación ultravioleta²³. La Rhodiola crenulata es una hierba suculenta, que es su característica visual intuitiva. Su polvo aparece de color marrón rojizo con un olor fragante. Según sus hábitos, morfología de la planta, flores y hojas, Rhodiola crenulata se distingue de otras especies de Rhodiola en el campo. Los resultados microscópicos de los materiales medicinales mostraron la existencia de gránulos de almidón, células de parénquima de madera (incluidos cristales de arena de oxalato de calcio), células de corcho, conductos (principalmente conductos roscados) y grandes cantidades de pigmento rojo. TLC es una técnica de separación cromatográfica para la separación de muestras multicomponente, comúnmente utilizada en la identificación de materiales medicinales chinos. El ácido gálico, el tirosol y el salidrósido a menudo se identifican como los componentes índice del crenulato de Rhodiola²⁴. Los resultados de la cromatografía en capa fina mostraron que la solución de Rhodiola crenulata mostraba las mismas manchas de color en la posición correspondiente que el control (ácido gálico, tirosol y salidrósido). Muestra que Rhodiola crenulata contiene ácido gálico, tirosol y salidrósido. Combinado con el conocimiento del entorno de cultivo y los resultados microscópicos, la Rhodiola crenulata se puede identificar preliminarmente.

Vale la pena señalar que el entorno de cultivo único determina que es casi imposible tener Rhodiola crenulata silvestre por debajo de la altitud de 3000 m. Además, no se recomienda cosechar las raíces y el rizoma de Rhodiola crenulata durante el período de floración. Para la identificación microscópica de laboratorio, el secado de las raíces y el tamizado del polvo son requisitos previos para la preparación exitosa de muestras microscópicas. Asegurarse de que no haya burbujas de aire entre el portaobjetos, el polvo medicinal y el cubreobjetos también es clave para observar la composición característica bajo el microscopio. Para la cromatografía en capa fina, la presaturación de la placa de gel de sílice, el agente de desarrollo razonable y la concentración de la muestra son factores importantes para separar con éxito los diferentes componentes de la muestra de prueba. En comparación con el muestreo manual tradicional, el proceso de muestreo automático de este protocolo aumenta indudablemente la precisión de los resultados y la repetibilidad del experimento. La subjetividad de la identificación del aroma y el sabor es demasiado fuerte y puede dar lugar a errores de juicio. En comparación con la cromatografía líquida de alta resolución, la resonancia magnética nuclear H y la espectrometría de masas, la cromatografía en capa fina no puede analizar cuantitativamente el contenido de compuestos en materiales medicinales²⁵. A pesar de que el código de barras de ADN tiene una precisión superior en la identificación de hierbas, su alto precio determina que no sea universal en la identificación de materiales medicinales²⁶. Además, la identificación de campo a laboratorio y la microscopía combinadas con la técnica de cromatografía en capa fina proporcionada en este protocolo es aplicable a casi todos los materiales medicinales. Este es un proceso barato, simple y rápido para la identificación de cualquier material herbal medicinal.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973569, 82274207 y 82104533), el Proyecto de Promoción de la Investigación Xinglin Scholar de la Universidad de Chengdu de MTC (XKTD2022013) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012).