Rhodiola crenulata의 현장 수집 및 실험실 일상적인 식별

여기에서는 서식지, 식물 형태, 의약 특성, 미세한 특징 및 박층 크로마토그래피에서 Rhodiola Crenulata 의 식별에 대해 설명합니다.

의약품 성분의 식별은 의약품 안전성의 전제이자 보증입니다. 과학 연구자들의 대다수는 약초의 간단하고, 빠르고, 효과적이고, 저렴한 식별 과정을 선호할 수밖에 없습니다. 홍경천은 높은 고도에서 자라는 티베트 전통 약재로 주로 중국의 티베트, 윈난, 쓰촨 지역에 분포합니다. 홍경천은 항염증, 항저산소증, 항산화 등 여러 생체 활성을 가지고 있으며 발전 가능성이 큽니다. 시장 수요가 증가하고 자원 함량이 급격히 감소함에 따라 홍경천 crenulata 의 많은 혼란스러운 제품이 사람들을 괴롭히고 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 일상적인 실험실 테스트와 결합된 현장에서 Rhodiola crenulata 를 식별하기 위한 표준 프로세스를 도입합니다. 서식지, 미세한 특징 및 박층 크로마토그래피의 조합은 의심할 여지 없이 홍경 천을 빠르고 효율적이며 경제적으로 식별하여 티베트 의학의 지속적인 발전과 의약 재료의 품질 관리에 기여할 것입니다.

약초는 중국에서 오랜 역사와 풍부한 응용 경험을 가지고 있으며 Shennong의 약초 고전¹에서 최초의 체계적인 기록이었습니다. 말라리아에 적용된 아르테미시닌의 발견은 약초의 새로운 단계¹로의 발전을 촉진했습니다. 현대 과학 기술을 사용하여 약초의 정확한 메커니즘을 밝혀냄으로써 약초의 이용률과 수요가 증가하여 약초에 대한 새로운 국제 시장이 열렸습니다 ^2,3,4. 그러나 이것은 일련의 부정적인 영향으로 이어졌습니다. 비전문가는 한약의 특성에 대해 막연하게 이해하고 있어 한약의 사용이 큰 안전 위험에 직면하게 됩니다⁵.

홍경천의 식물 중 하나인 홍경천은 주로 티베트, 윈난 북서부, 중국 쓰촨성 서부에 분포한다(그림 1^)6,7. 홍경천은 살리드로사이드, 티로졸, 갈산 및 기타 화합물로 구성되어 있으며, "기를 활성화하고 혈액 순환을 촉진하며 맥박을 맑게 하고 천식을 진정시키는 기능"8,9,10,11 기능을 통해 저산소증 관련 질병을 치료합니다. 현장 조사에 따르면 홍경천은 고도 4,000-5,600m의 고산 거골 지대, 협곡 경사면 및 암석 틈새에서 발견 될 수 있습니다. 성장 환경은 춥고 햇빛과 강렬한 방사선으로 가득 차 있으며 고산 초원 생태계에 속합니다. Rhodiola crenulata는 성장 지형에 따라 라멜라 및 점형 개체군에 분포할 수 있으며, 유전자 흐름은 교차 수분을 통해 수행될 수 있습니다.

홍경천 속의 꽃가루 낙태, 불법 발굴 및 퇴화 된 생태 환경은 홍경천 crenulata를 멸종 위기에 처한 종으로 만듭니다 ^6,12. Rhodiola crenulata의 높은 약용 가치를 고려할 때 위조 제품이 시장에 유입될 것으로 예상됩니다. 이 기사에서는 Rhodiola crenulata의 서식지와 몇 가지 편리한 실험실 식별 방법을 제시합니다. 첫째, 홍경천의 생육 환경과 약효를 관찰하였다. 둘째, 약용 분말의 미세 구조를 현미경으로 관찰하였다. 마지막 단계가 핵심입니다. Rhodiola crenulata의 대표 성분은 특정 물질에서 이들 성분의 상이한 흡착 또는 용해 특성에 따라 분리되고 확인되었습니다. 약용 식물의 DNA 기반 인증 또는 대사체학 분석 방법은 복잡하고 비용이 많이 듭니다¹³. 이러한 기본적이고 편리하며 경제적인 방법으로 홍경천을 신속하게 식별할 수 있습니다.

홍경 천은 중국 쓰촨성 간쯔 티베트족 자치현 간쯔현 주오다 설산(N 31.44570°, E 99.96086°, 4892m)에서 채취됩니다. 이 식물은 청두 전통 중국 의학 대학 민족 의학 학교의 Yi Zhang 교수에 의해 진품으로 인증되었습니다.

1. 홍경천 채취

1. Rhodiola crenulata의 서식지 지도를 촬영하십시오.
2. Rhodiola crenulata의 전체 식물, 잎, 꽃받침 및 뿌리 줄기를 촬영하십시오.
3. 삽을 사용하여 Rhodiola crenulata 에서 1m 이내의 잡초와 부러진 돌을 제거하여 후속 원활한 채굴을 보장합니다.
4. 뿌리권 전체가 보일 때까지 괭이로 흙을 파내고 꼭지 뿌리를 모으십시오.
   참고 : 약재에 사용되는 Rhodiola crenulata 의 뿌리와 뿌리 줄기는 꽃 줄기가 시들어가는 가을에 수집해야합니다.

2. 특성 식별

1. 육안으로 홍경 천의 외관 특성을 관찰하십시오 : 원통형의 짧은 꼭지 뿌리와 뿌리 줄기, 갈색 표면, 분홍색 패턴이있는 막색 표피, 주황색-빨간색 또는 부르고뉴 조각.
2. 냄새로 식별: 코 근처에 있을 때 향긋한 냄새를 맡습니다.
3. 맛으로 식별: 작은 뿌리 조각을 입에 넣고 먼저 한 모금 씹은 다음 약간 쓴 맛이 나고 그 다음에는 단맛이 납니다.

3. 약용 분말에서 전분 과립의 현미경 식별

1. Rhodiola crenulata 표면의 흙을 브러시로 제거하고 40 °C의 오븐에 넣고 24 시간마다 허브를 뒤집습니다.
   알림: 의약 재료의 깨지기 쉬운 것은 수분 건조의 표준으로 간주됩니다.
2. 분말 기계를 사용하여 건조된 약재를 분말화하고 약용 3호 체를 사용하여 약용 분말을 여과합니다( 재료 표 참조).
3. 깨끗한 슬라이드( 재료 표 참조)를 가져와서 해부 바늘로 분말을 파고( 재료 표 참조) 2mm 이내의 슬라이드의 1/3에 고르게 놓습니다.
4. 유리 스포이드( 재료 표 참조)를 사용하여 분말에 탈이온수 한 방울을 추가합니다. 핀셋( 재료 표 참조)을 사용하여 덮개 유리의 한쪽 끝( 재료 표 참조)을 잡고 액체 레벨을 빠르게 만지고 분말을 덮습니다.
   알림: 해부학 바늘을 사용하여 물과 약용 분말을 부드럽게 혼합하여 균일한 샘플 혼합을 보장합니다. 슬라이드, 파우더 및 커버 유리 사이에 기포가 없어야 합니다.
5. 현미경을 열고( 재료 표 참조) 3.4단계의 슬라이드를 플랫폼에 놓아 고정합니다. 광원과 거친 초점 나선을 조정하여 분말을 확인합니다. 조직이 선명하게 보일 때까지 미세한 파라포컬 나선형을 조정합니다. 40x 대물렌즈로 전환하고 전분 과립을 관찰합니다.
   알림: 단일 또는 다중 곡물로 나타나는 곡물을 녹말로 처리하면 탯줄이 헤링본 또는 균열 모양으로 나타납니다.

4. 약용 분말의 카테터, 코르크 세포, 섬유, 목재 실질 세포 및 색소 덩어리의 현미경 식별

1. 깨끗한 슬라이드( 재료 표 참조)를 가져와서 해부 바늘로 분말을 파고( 재료 표 참조) 슬라이드의 1/3에 놓습니다.
2. 유리 스포이드( 재료 표 참조)를 사용하여 분말에 클로랄 수화물 한 방울( 재료 표 참조)을 추가합니다. 핀셋으로 슬라이드를 가져 와서 ( 재료 표 참조) 알코올 램프에서 가열하십시오.amp 매번 1초 동안 세 번.
   알림: 가열하는 동안 기포를 피해야 합니다. 액체는 흐르지 않는 상태로 유지되어 침투가 완료되었음을 나타냅니다.
3. 유리 스포이드를 사용하여 글리세린 한 방울을 추가합니다( 재료 표 참조). 핀셋을 사용하여 커버 유리의 한쪽 끝을 잡고 액체 레벨을 빠르게 만집니다.
4. 현미경을 열고 슬라이드를 플랫폼에 올려 고정합니다. 광원과 거친 초점 나선을 조정하여 분말을 확인합니다. 조직이 선명하게 보일 때까지 미세한 파라포컬 나선형을 조정합니다. 40x 대물 렌즈로 전환하여 카테터, 코르크 세포, 섬유, 목재 실질 세포 및 색소 블록을 관찰합니다.
   참고: 코르크 세포의 다각형 또는 긴 다각형, 명백한 나선형 구조를 가진 나선형 용기, 옥살산 칼슘 모래 결정을 포함하는 물관부 실질, 적색 또는 갈색을 띤 적색 안료 블록.

5. Rhodiola crenulata의 박층 크로마토그래피(TLC) 샘플 및 그 참조 준비

1. 칭량 용지를 저울에 놓고( 재료 표 참조) Rhodiola crenulata 분말 3g의 무게를 잰다.
2. 분말을 100mL 원뿔형 병에 넣고 ( 재료 표 참조) 큰 배 피펫으로 25mL의 메탄올을 추가합니다 ( 재료 표 참조). 원뿔형 병을 초음파 기기에 넣습니다. 전력을 250W로, 주파수를 40kHz로, 시간을 30분으로 설정하고( 자료표 참조) 기기를 켭니다.
   알림: 초음파 기기의 목적은 Rhodiola crenulata 의 분말이 후속 박막 크로마토그래피 실험 결과에 영향을 주지 않고 완전히 용해되도록 하는 것입니다.
3. 원뿔형 병을 제거하고 외부 병을 흐르는 물로 실온(RT)으로 헹굽니다.
4. 5.3단계에서 준비한 액체 800μL를 1mL 주사기로 흡입합니다. 0.22μm 미세 다공성 필터 멤브레인( 재료 표 참조)으로 필터링하고 크로마토그래피 샘플 병에 Rhodiola crenulata 의 미드스트림 샘플 용액 400μL를 수집합니다.
5. 2mg의 살리드로사이드, 티로졸 및 갈산( 재료 표 참조)을 각각 3개의 개별 100mL 원뿔형 병에 넣습니다. 큰 배 피펫이 있는 메탄올 25mL를 모든 원뿔형 병에 넣습니다.
6. 원뿔형 병을 초음파 기기에 넣고 전력을 250W로, 주파수를 40kHz로, 시간을 30분으로 설정하고 5.3단계를 반복합니다( 재료 표 참조).
7. 1mL 주사기로 5.6단계에서 준비한 액체 800μL를 흡입합니다. 0.22μm 미세 다공성 필터 멤브레인( 재료 표 참조)으로 필터링하고 해당 크로마토그래피 샘플 병에 400μL의 미드스트림 살리드로사이드, 티로졸 및 갈산 표준 용액을 수집합니다.

6. TLC 식별

1. 피펫 트리클로로메탄(5mL), 에틸 아세테이트(4mL), 메탄올(2mL) 및 포름산(0.5mL)( 재료 표 참조). 이중 탱크 크로마토그래피 실린더의 한쪽 면에 추가하고( 재료 표 참조) 흔든 후 골고루 섞습니다. 상부 실린더 헤드를 덮습니다.
2. 갈산, 살리드로사이드, 티로솔 표준 용액 및 홍경천 크레눌라타 용액을 A1-A4 위치의 샘플 랙에 놓습니다.
3. 5cm x 10cm 실리콘 시트( 재료 표 참조)를 샘플링 테이블에 놓습니다. 자동 s를 시작amp기계( 재료 표 참조)를 클릭하고 공기 제어 밸브를 엽니다.
4. visionCATS 소프트웨어를 엽니다( 자료표 참조). 새로 만들기(New) > 새 폴더 ( Rhodiola crenulata sample test)를 클릭한 > 확인(OK)을 클릭합니다. New Method(이름 : Rhodiola crenulata sample test)를 클릭하고 OK > ATS 4> 클릭합니다.
5. 단계 정의 완료(Finish Step Definition)를 클릭합니다. Track Assignment(할당 추적)를 클릭하여 설명(gallic acid, salidroside, tyrosol 및 Rhodiola crenulata 샘플)을 편집합니다.
6. HPTLC 단계를 클릭합니다. 얇은 레이어 매개 변수 (5cm x 10cm)를 설정합니다. 응용 프로그램 유형(밴드)을 선택하고 매개변수(표 1)를 설정한 다음 확인 버튼을 클릭합니다.
7. 충전/헹굼 품질을 엽니다. Fill only Programmed Volume(프로그래밍된 볼륨만 채우기)을 선택합니다. 바이알 바닥 레벨(mm)을 0.5로 설정하고 OK 버튼을 클릭합니다.
8. Execute Method(메서드 실행)를 클릭합니다.
9. Track Assignment 버튼을 클릭하고 Center를 선택한 다음 매개변수를 설정합니다(표 2).
10. 자동 샘플링을 위해 계속 버튼을 클릭합니다.
11. 자동 샘플링 기계와 공기 밸브를 끕니다. 자동 샘플링 기계에서 실리콘 시트를 제거합니다.
12. 실리콘 시트를 6.1단계에서 이중 탱크 크로마토그래피 실린더의 반대쪽에 넣고 상부 실린더 헤드를 덮고 20분 동안 사전 포화시킵니다.
13. 얇은 층판의 상단을 핀셋으로 부드럽게 고정하고 실리콘 시트를 현상제에 빠르게 넣고 상부 실린더 헤드를 덮습니다.
    알림: 펼쳐지는 전면 가장자리가 얇은 층판의 상단에서 0.5-1.0cm 떨어져 있을 때 실리콘 시트를 꺼냅니다.
14. 유기 용매가 증발한 후 실온에서 실리콘 시트 표면에 발색 용액을 분사하여 발색 결과를 얻습니다.
    참고 : 발색 용액은 2 % FeCl₃ 및 1 % K₃ [Fe (CN) ₆]를 포함하는 수용액입니다.

이 실험 프로토콜은 현장에서 Rhodiola crenulate 를 식별하고 수집하는 방법을 설명합니다. Rhodiola crenulate 는 고산 거골 지역, 협곡 경사면 및 높은 고도의 암석 틈새에 서식하는 경향이 있습니다. Rhodiola crenulate 의 서식지, 전체 식물, 꽃 및 잎은 그림 2에 나와 있습니다. Rhodiola crenulate 는 적갈색의 뿌리줄기를 가지고 있습니다(그림 3A). 상기 약용 분말의 대표 이미지는 도 3B에 나타내었다. 위의 실험 프로토콜에 따르면, 현미경 결과는 다음과 같이 나열될 수 있습니다: 1) 갈색을 띤 노란색 또는 무색의 코르크 세포, 큰 외관, 다각형 또는 긴 다각형, 약간 더 두꺼운 벽(그림 3C); 2) 단일 또는 다중 곡물로 나타나는 전분 입자 및 헤링본 또는 균열 모양으로 나타나는 탯줄(그림 3D); 3) 밀접하게 배열된 주로 나선형 선박(그림 3E); 4) 시트에 나타나고 옥살산 칼슘 모래 결정을 포함하는 무채종 및 타원형 물관 실질(그림 3F); 5) 불규칙한 모양의 갈색-적색 안료 블록(그림 3G). 박막 분리 결과는 로디올라 크레뉼라타 샘플(A4)이 갈산(A1), 살리드로사이드(A2), 티로졸 표준 용액(A3)의 크로마토그램에 해당하는 위치에서 동일한 색상의 반점으로 나타났음을 보여주었습니다(그림 3H). Gallic acid, salidroside 및 tyrosol은 Rhodiola crenulate의 주요 및 대표 성분입니다. 이러한 결과는 로 디올라 크레뉼라타 의 예비적 식별이 프로토콜에서 논의된 테스트로 가능하다는 것을 보여줍니다.

그림 1: Rhodiola crenulata의 분포도. (A) 홍경천은 주로 중국, 인도, 네팔, 부탄에 분포한다¹⁴. (B) 홍경천은 주로 중국의 티베트, 칭하이, 쓰촨, 윈난, 구이저우에 분포합니다(소프트 ArcGis 10.6 생산). 통계 자료는 식물학 학회^15,16의 웹사이트에서 온다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: Rhodiola crenulata 식물의 사진. (A) Rhodiola crenulate의 비오톱. (B) Rhodiola crenulate의 클로즈샷. (C) Rhodiola crenulate의 전체 식물. (D) Rhodiola crenulata의 꽃. (E) 홍경천의 잎은 crenulate. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Rhodiola crenulata의 미세한 특성과 박층 크로마토그램. (A) Rhodiola crenulata의 약용 뿌리. (B) Rhodiola crenulata의 약용 물질력. (C) 코르크 셀. (D) 전분 곡물. (E) 나선형 선박. (F) Xylem parenchyma (칼슘 옥살레이트 결정). (G) 안료. (H) 살리드로사이드(A1), 갈산(A2), 티로솔(A3) 및 홍경 천(A4)의 박층 크로마토그래피 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 자동 샘플링 위치의 파라미터 설정.

표 2: 자동 샘플링 순서의 파라미터 설정.

세계에는 90 종 이상의 홍경천 식물이 있으며 모든 종의 60 % 이상이 중국에서 발견되며 홍경천, 홍경천, 홍경천 achalinensis 및 홍경천 17을 포함한 일반적인 식물이 있습니다. 중국 약전(2020)의 첫 번째 부분에 기록된 홍경천은 높은 고도에서 재배되는 티베트 전통 약재입니다. 홍경천에 대한 시장 수요는 매년 증가하고 있으므로 공급원의 올바른 사용을 보장하는 것이 안전한 사용을 보장하는 열쇠입니다. 특히, 현장 피킹에서 간단하고 신속한 실험실 일상 식별로의 표준화는 무시할 수 없습니다. 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 간단한 시퀀스 간 반복은 시간이 많이 걸리고 복잡하며 비용이 많이 드는 다른 홍경천 종과 홍경천을 정확하게 식별할 수 있는 것으로 보고되었습니다 18,19,20. 한편, 감각 인식의 다차원 평가 방법(E-nose 및 색상 분석)과 Rhodiola crenulate^21,22를 구별하기 위한 HPLC 방법을 확립했습니다.

각 의약 물질은 고유한 성장 환경, 미세한 구조 특성 및 지수 성분을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 현장 식별부터 실험실 현미경 검사 및 박층 크로마토그래피를 사용한 검증에 이르기까지 홍경천을 식별하기 위한 포괄적인 방법을 제공합니다. 홍경천은 주로 해발 3,000m 이상, 저온, 저산소, 고자외선 지역에서 자란다²³. 홍경천은 즙이 많은 허브로, 직관적인 시각적 특징이 특징입니다. 그 가루는 향긋한 냄새와 함께 적갈색으로 보입니다. 습성, 식물 형태, 꽃 및 잎에 따라 Rhodiola crenulata 는 현장의 다른 홍경천 종과 구별됩니다. 의약 물질의 현미경 결과는 전분 과립, 목재 실질 세포(옥살산 칼슘 모래 결정 포함), 코르크 세포, 도관(주로 나사산 도관) 및 다량의 적색 안료의 존재를 보여주었습니다. TLC는 다성분 시료 분리를 위한 크로마토그래피 분리 기술로, 중국 의약 물질의 식별에 일반적으로 사용됩니다. Gallic acid, tyrosol 및 salidroside는 종종 Rhodiola crenulate²⁴의 지표 성분으로 확인됩니다. 박층 크로마토그래피의 결과는 Rhodiola crenulata 의 용액이 대조군과 동일한 위치에서 동일한 색 반점(갈산, 티로졸 및 살리드로사이드)을 나타냄을 보여주었습니다. 로디올라 크레눌라타 에는 갈산, 티로졸, 살리드로사이드가 함유되어 있음을 알 수 있습니다. 성장 환경에 대한 지식과 현미경 결과와 결합하여 Rhodiola crenulata 를 예비적으로 식별할 수 있습니다.

독특한 재배 환경으로 인해 고도 3000m 이하에서 야생 홍경천 crenulata 를 키우는 것이 거의 불가능하다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 또한 개화 기간 동안 Rhodiola crenulata 의 뿌리와 뿌리 줄기를 수확하는 것은 권장하지 않습니다. 실험실 현미경 식별을 위해 뿌리를 건조하고 분말을 체로 치는 것은 현미경 샘플의 성공적인 준비를 위한 전제 조건입니다. 슬라이드, 약용 분말 및 커버 유리 사이에 기포가 없는지 확인하는 것도 현미경으로 특성 조성을 관찰하는 데 중요합니다. 박층 크로마토그래피의 경우 실리카겔 플레이트의 사전 포화, 합리적인 현상제 및 시료 농도는 테스트 시료의 다양한 성분을 성공적으로 분리하는 데 중요한 요소입니다. 기존의 수동 샘플링과 비교할 때 이 프로토콜의 자동 샘플링 프로세스는 의심할 여지 없이 결과의 정확성과 실험의 반복성을 증가시킵니다. 향과 맛의 주관성이 너무 강하여 오판으로 이어질 수 있습니다. 고성능 액체 크로마토그래피, H-핵 자기 공명 및 질량 분석법과 비교할 때 박층 크로마토그래피는 의약 물질의 화합물 함량을 정량적으로 분석할 수 없습니다²⁵. DNA 바코드는 약초 식별에서 우수한 정확도를 가지고 있지만, 높은 가격으로 인해 의약 물질 식별에 보편적이지 않다는 것을 결정합니다²⁶. 또한 이 프로토콜에서 제공하는 박층 크로마토그래피 기술과 결합된 현장 간 식별 및 현미경은 거의 모든 의약 재료에 적용할 수 있습니다. 이것은 약초 물질을 식별하기 위한 저렴하고 간단하며 빠른 프로세스입니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(81973569, 82274207 및 82104533), 청두 중의학 대학의 Xinglin Scholar Research Promotion Project(XKTD2022013) 및 Ningxia의 주요 연구 개발 프로그램(2023BEG02012)의 지원을 받았습니다.