Síntese de Nanogéis Responsivos a Estímulos utilizando Reticulação Aquosa de Uma Etapa e Co-nanopolimerização

Os nanogéis são uma plataforma de nanopartículas excelente e versátil para a entrega de produtos biológicos. Nanogéis poliméricos à base de polietilenoglicol responsivos a estímulos, capazes de encapsular cargas úteis à base de proteínas, foram sintetizados usando uma estratégia de co-nanopolimerização de reticulação de uma etapa em condições aquosas. A fabricação e caracterização ideais dessas novas nanopartículas são apresentadas aqui.

Os nanogéis constituídos por nanopartículas poliméricas reticuladas foram desenvolvidos para a entrega de inúmeras terapêuticas químicas e biológicas, devido à sua versátil síntese e biocompatibilidade de baixo para cima. Embora vários métodos tenham sido empregados para a síntese de nanogéis até o momento, muito poucos o alcançaram sem o uso de solventes orgânicos agressivos ou altas temperaturas que podem danificar a integridade da carga biológica. Em contraste, a metodologia apresentada aqui realiza a síntese de nanogéis carregados com proteínas de tamanho sub-100 nm usando condições de reação leves. Aqui, apresentamos um método para o encapsulamento não covalente de cargas úteis à base de proteínas dentro de nanogéis que foram sintetizados usando uma técnica de copolimerização de reticulação de etapa única à base de água. Nesta técnica, inicialmente ligamos eletrostaticamente uma carga útil baseada em proteína a um monômero de amônio quaternário catiônico e, simultaneamente, reticulamos e copolimerizamos usando persulfato de amônio e N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina para formar nanogéis que aprisionam a carga útil da proteína. O tamanho e o índice de polidispersidade dos nanogéis são determinados usando espalhamento dinâmico de luz (DLS), enquanto a morfologia da superfície é avaliada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A massa de proteína aprisionada dentro dos nanogéis é determinada calculando a eficiência de encapsulamento. Além disso, a capacidade de liberação controlada dos nanogéis por meio da degradação gradual de elementos estruturais responsivos a redox também é avaliada em ensaios de biorredução. Fornecemos exemplos de dados de otimização de nanopartículas para demonstrar todas as ressalvas da síntese e caracterização de nanogéis usando esta técnica. Em geral, nanogéis de tamanho uniforme foram obtidos com um tamanho médio de 57 nm e um valor de índice de polidispersidade de 0,093. Uma alta eficiência de encapsulamento de 76% foi alcançada. Além disso, os nanogéis exibiram liberação controlada de até 86% da proteína encapsulada pela degradação gradual de novos componentes responsivos a redox na presença de glutationa ao longo de 48 h.

Os nanogéis são hidrogéis tridimensionais, de tamanho submicrométrico, com estruturas de rede polimérica reticuladas que podem conter grandes quantidades de fluidos dentro de seu invólucro central sem afetar sua integridade morfológica¹. Em geral, os nanogéis são sintetizados pela polimerização de monômeros funcionais via reticulação física ou química em sistemas coloidais heterogêneos, como microemulsões inversas de água em óleo ^2,3. Os copolímeros anfifílicos podem se auto-montar em estruturas em nanoescala em ambientes aquosos. No entanto, eles devem ser estabilizados usando estratégias de reticulação química envolvendo dissulfetos ou acoplamento à base de amida, química de clique, ou podem ser fisicamente induzidos (estratégias hidrofóbicas, eletrostáticas ou de ligação de hidrogênio) ou foto-induzidos⁴. Dentre essas estratégias, a automontagem física de polímeros seguida de reticulação química tem sido relatada como uma técnica de fabricação de nanogel^{bem-sucedida 5}. Embora historicamente o primeiro nanogel tenha sido introduzido na década de 1990 por Vingradov et ^al.6, Akiyoshi et ^al.7 e Lemieux et ^al.8, ultimamente, uma variedade de nanogéis inteligentes compostos de polímeros naturais e sintéticos foram desenvolvidos e explorados para diversas aplicações biomédicas⁹.

Os nanogéis possuem ampla capacidade de retenção de carga, grande área de superfície, estabilidade in vivo, bem como propriedades químicas e mecânicas personalizáveis¹⁰. A síntese de nanogéis também é escalável e pode ser de base aquosa. Além disso, o maior teor de água dos nanogéis os torna portadores eficazes de cargas biológicas sensíveis¹¹. Além disso, a alta área de superfície pode satisfazer várias necessidades de bioconjugação, permitindo assim a anexação de modalidades de direcionamento para permitir o direcionamento ativo. Notavelmente, a versatilidade do design do nanogel permite o uso de uma ampla gama de monômeros responsivos a estímulos que permitem o controle preciso de suas propriedades físico-químicas⁹. Essa capacidade única de engenharia permite a melhoria racional do design de nanogel, o que é difícil de alcançar com lipossomas, micelas ou polimerossomos usados convencionalmente^12,13. Ao incorporar porções responsivas a estímulos em monômeros especificamente projetados, os nanogéis podem ser projetados para desencadear a liberação controlada de sua carga útil em resposta a vários estímulos fisiologicamente relevantes, como pH, condições redox, enzimas, ^etc.9,14. Esses nanogéis inteligentes são mais úteis do que os nanogéis convencionais, pois possuem estabilidade superior para circulação sanguínea prolongada e podem suportar condições fisiológicas para manter a integridade de sua carga e mediar sua liberação controlada nos locais-alvo desejados¹⁵. De fato, devido à sua natureza versátil, os nanogéis ganharam força na arena biomédica, com avanços notáveis no desenvolvimento de nanogéis responsivos a estímulos para inúmeras aplicações teranósticas e diagnósticas ^2,16,17.

Os biológicos podem representar uma categoria de produtos farmacêuticos que consistem em proteínas, peptídeos e/ou ácidos nucléicos e revolucionaram o cenário terapêutico devido à sua notável seletividade, tornando-se assim a classe terapêutica de crescimento mais rápido¹⁸. De fato, o crescente mercado para essas terapias é evidente no aumento acentuado de sua aprovação pela Federal Drug Association (FDA) dos EUA, onde os produtos biológicos representaram ~40% do total de aprovações de medicamentos, em 2023¹⁹. Além de sua especificidade e potência, descobertas rápidas de novos alvos de drogas, processos de bioengenharia mais eficientes e maior conhecimento do destino in vivo dessas terapêuticas levaram ao aumento de seu uso²⁰. Os produtos biológicos tradicionais incluem RNA interferente, proteínas de reposição, citocinas e hormônios que geralmente são gerados usando a tecnologia de DNA recombinante²¹. Desde a aprovação da insulina recombinante humana em 1982, os produtos biológicos foram desenvolvidos para muitas condições, incluindo câncer (por exemplo, trastuzumabe, avelumabe), doença inflamatória intestinal (por exemplo, adalimumabe, certolizumabe) e doenças genéticas raras (por exemplo, mipomersan, miozima, aldurazima, fabrazima)²¹. Embora a alta especificidade das interações dos produtos biológicos com seus alvos deva teoricamente compensar quaisquer efeitos fora do alvo, várias preocupações clínicas surgiram com seu uso relacionado a efeitos colaterais indesejados²². Esses efeitos colaterais podem ser agrupados em duas categorias, incluindo farmacologia exagerada (superestimulação de alvos) e imunogenicidade. Além disso, suas meias-vidas curtas, biodisponibilidade limitada, danos à protease, vida útil curta e processos de produção caros limitam seus benefícios terapêuticos²¹. Os métodos convencionais de mitigação desses problemas envolvem modificação covalente desses biológicos que podem comprometer sua função e, portanto, eficácia²³. Alternativamente, a abordagem da nanomedicina para encapsular cargas terapêuticas pode conferir inúmeras vantagens às propriedades farmacológicas, mais importante, o direcionamento passivo ao local inflamado por meio do efeito de permeação e retenção aprimoradas (EPR)²⁴. Outros benefícios associados às nanopartículas podem incluir tempos de circulação aprimorados, taxa de depuração reduzida, maior flexibilidade da formulação, melhor permeação da vasculatura e captação celular²⁵. Embora uma enorme variedade de formulações de nanopartículas esteja atualmente sob investigação para a entrega de cargas biológicas, poucas podem emular a multifuncionalidade dos nanogéis. De fato, os nanogéis excedem as capacidades de carga alcançadas pelas nanopartículas à base de lipossomalas e micelas e exibem maior estabilidade coloidal do que a maioria das nanopartículas inorgânicas. Como tal, os nanogéis apresentam uma plataforma valiosa para a entrega de várias terapêuticas biológicas.

Anteriormente, entregamos com sucesso uma enzima antioxidante em novos nanogéis poliméricos reticulados responsivos à metaloproteinase da matriz, onde a estratégia de encapsulamento suave usada manteve a bioatividade da proteína após a liberação²⁶. Neste trabalho, demonstramos a síntese otimizada de nanogéis responsivos a redox para a entrega de cargas úteis baseadas em proteínas. Notavelmente, a metodologia sintética permite a síntese de nanogéis usando condições suaves para encapsular a carga útil desejada, sem o uso de solventes orgânicos agressivos ou altas temperaturas. Exploramos a homeostase redox dentro do ambiente intracelular para regular a liberação da carga útil encapsulada^27,28. Tipicamente, a glutationa antioxidante naturalmente abundante (GSH) controla os potenciais redox extracelular e intracelular, onde sua concentração varia entre 2-20 μM e 1-10 mM, respectivamente^29,30. Até o momento, numerosas nanopartículas sensíveis a redox foram relatadas, tornando esta uma estratégia comprovada e confiável para permitir a liberação controlada de medicamentos in vivo^27,28. De fato, as ligações dissulfeto foram instaladas em nanomateriais poliméricos usando reticuladores contendo dissulfeto^{31 , 32} , automontagem de polímeros biodegradáveis a partir de monômeros contendo dissulfeto³³ e pró-fármacos poliméricos responsivos a redox ou conjugados de medicamento / polímero^{34 , 35}. Portanto, este estudo investiga a incorporação de um reticulador dissulfeto exclusivo e altamente sensível ao GSH dentro das nanopartículas poliméricas, permitindo assim a liberação controlada de uma carga útil de proteína encapsulada.

Neste estudo, o design do nanogel foi centrado nos seguintes critérios para abordar a especificidade e a entrega da carga útil: tamanho pequeno (~ 100 nm) e uma distribuição de tamanho uniforme (índice de polidispersidade (PI) <0,3) para garantir a penetração eficiente do endotélio e estabilidade in vivo ²⁷; encapsulamento eficiente da carga útil da proteína e liberação controlada da carga útil em resposta ao GSH. Relatamos a síntese de nanogéis reticulados responsivos a GSH, que demonstraram nanopartículas homogêneas de tamanho sub-100 nm, com uma eficiência de encapsulamento de 76% da carga útil da proteína desejada.

1. Síntese de reticulador responsivo a redox

1. Adicionar cloridrato de 2-aminoetilmetacrilato (44,79 mg, 0,270 mmol) e 0,063 ml de trietilamina a 3 ml de diclorometano anidro e deixar misturar durante 20 min sob um gás N₂ inerte num balão de fundo redondo de 25 ml.
2. Dissolver o éster di-N-succinimidílico do ácido 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-hexadecaoxa-28,29-ditiahexapentacontanedióico (100 mg, 0,045 mmol) em 1 ml de diclorometano anidro e adicionar ao balão.
3. Adicionar 4 ml de diclorometano anidro ao balão. Envolver o balão de reacção em folha de alumínio e deixar agitar sob N₂ à temperatura ambiente.
4. Confirmar a formação do produto por cromatografia em camada fina. Garanta as referências corretas para o material de partida enquanto confirma a formação do produto por este método.
   1. A cromatografia em camada fina é um método baseado em afinidade usado para separar os compostos desejados da mistura de reação. Aqui, use a placa de sílica altamente polar e adsorvente como uma fase estacionária. Colocar a amostra de matéria-prima e a amostra da mistura de reacção numa extremidade da placa de sílica e colocá-la verticalmente num copo de vidro fechado com o eluente (fase móvel: 5% de metanol: diclorometano).
   2. Por ação capilar, a fase móvel sobe pela placa de sílica e os compostos da amostra migram distâncias variadas, dependendo de suas afinidades com as fases estacionária e móvel. Quando a^{frente do} solvente tiver cruzado 3/4 da placa, remova a placa e seque-a. Os compostos separados aparecem como manchas na placa. Quantificar o factor de retenção (R_f) do composto pretendido como a distância percorrida pelo composto/distância percorrida pelo solvente. Aqui, R_f do produto foi 0,35. Luz ultravioleta ou coloração podem ser usadas para visualizar as manchas (permanganato de potássio).
5. Concentrar a mistura no vácuo e purificar por cromatografia em coluna flash (mistura isocrática de 5% de metanol: diclorometano)³⁶. Introduza a mistura de reação no topo de uma coluna de vidro cheia de sílica (fase estacionária) e, em seguida, elui com o sistema de solvente (fase móvel) ³⁶ . Recolha todas as frações e analise utilizando a TLC para distinguir as frações do produto utilizando o valor R_f previamente determinado.
6. Concentrar as fracções purificadas por evaporação do solvente utilizando um evaporador rotativo (temperatura: 40 °C), regular a pressão de vácuo para a pressão atmosférica para remover primeiro o diclorometano de ponto de ebulição mais baixo. Quando o nível do solvente parar de diminuir, ajuste a pressão de vácuo para 337 mbar para remover o metanol e obter um óleo amarelo-pálido, que será então submetido a uma caracterização adicional para confirmar a formação do produto³⁷.
7. Realize a análise de infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR)³⁸, ¹H NMR (em dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d ₆))³⁹, ¹³C NMR³⁹ e análise de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-ToF)⁴⁰ para confirmar a formação do produto antes de realizar as próximas etapas.
   1. Para análise FT-IR, carregue 1 mg do óleo no instrumento para obter os espectros.
   2. Para análises de RMN, dissolva novamente 10 mg do produto em 0,75 mL do solvente de RMN relevante, transfira para um tubo de RMN e feche bem para evitar vazamentos. Carregue a amostra no instrumento de RMN, após o que os espectros são obtidos³⁹.
   3. Para a análise por espectrometria de massa, sele 1 mg do produto em um frasco, dissolva em DMSO e carregue no instrumento.
      NOTA: A análise infravermelha fornece informações sobre os principais grupos funcionais no produto desejado, ou seja, os trechos de carbonila (C = O) identificados pelo pico agudo a 1650 ^cm-1 indicam a formação da ligação amida, destacando assim a formação do produto. A RMN ^{de 1}H e a ^{RMN de 13}C fornecem informações sobre os ambientes químicos e, portanto, podem ser usadas para determinar a composição química do produto desejado por meio da identificação dos ambientes químicos presentes no composto. Finalmente, o uso da espectrometria de massa pode verificar a massa exata do produto desejado.

2. Teste a clivagem do reticulador de dissulfeto com glutationa

1. Incubar o reticulador de dissulfeto (até uma concentração final de 4,55 mg / mL) com o agente redutor glutationa (final [GSH]: 10 mM), até um volume final de 1 mL, por 24 h em um frasco de vidro de 1,5 mL.
2. Para confirmar a clivagem do ligante dissulfeto, submeter o frasco para injetáveis^à análise MALDI-ToF ^26,40.

3. Síntese de nanogel responsiva a redox

1. Certifique-se de que todos os artigos de vidro a serem usados para a reação estejam livres de poeira, lavando com água deionizada filtrada (0.20 μm) e, posteriormente, secando os artigos de vidro usando ar comprimido que pode ser acessado através da rede de ar comprimido na lateral da capela. Conecte um bico seguro à saída de ar comprimido para facilitar a acessibilidade. Segure o frasco com firmeza e posicione o bico nele. Ative o ar comprimido, liberando um fluxo controlado no frasco. Observe o processo para garantir uma secagem eficaz, verificando se há contaminantes ou umidade restantes.
2. Prepare um frasco de vidro de 10 mL enchendo-o com água deionizada e sele o frasco com um septo de borracha. Desoxigene a água borbulhando N₂ por pelo menos 30 minutos antes de iniciar a reação. Para fazer isso, encha um balão com gás N₂ e prenda uma agulha no balão; coloque-o no septo e use a agulha para perfurar o septo de borracha e permitir o fluxo de N₂ . Colocar uma agulha de saída no balão para assegurar um fluxo constante de N₂.
3. Dissolva a albumina de soro bovino (BSA; 2 mg, 30 nmol) ou BSA marcada com Cy7 (2 mg, 30 nmol) em 1 mL de água desionizada desoxigenada e adicione a outro frasco de vidro limpo de 10 mL.
4. Adicionar a solução de cloreto de [2-(acriloiloxi)etil]trimetilamónio (AETC) (12,00 mg/10,86 μL, 0,060 mmol) ao balão e selá-lo com outro septo de borracha. Certifique-se de que a mistura de reação seja mantida sob um fluxo constante de gás N₂ e mexa por 30 min.
5. Dissolva a acrilamida (9,21 mg, 0,13 mmol) em 1 ml de água desoxigenada desionizada e adicione à mistura no frasco para injetáveis.
6. Dissolva o reticulador dissulfeto (4,44 mg, 0,004 mmol) em 1 mL de água deionizada e adicione à mistura no frasco. Lave a mistura com gás N₂ por 20 min.
7. Dissolva o dodecil sulfato de sódio (2 mg, 0,007 mmol) em 1 mL de água desoxigenada deionizada e adicione à mistura por meio de uma seringa com lavagem com gás N₂ e agite a mistura por 30 min.
   NOTA: Ao lavar a seringa com N₂ , minimizamos a exposição da mistura de reação ao oxigênio na atmosfera, o que pode inibir a reação de polimerização radical.
8. Adicione N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (1,5 μL, 0,010 mmol) e deixe a mistura de reação desoxigenar por 3 min sob gás N₂ .
9. Dissolva o persulfato de amônio (1 mg, 0,004 mmol) em 1 mL de água desoxigenada deionizada e adicione à mistura de reação. Certifique-se de que o gás N₂ esteja borbulhando através da mistura de reação por 10 min.
   NOTA: Se a etapa de adição de N₂ for omitida, é provável que partículas brancas se formem no balão de reação. Estas são partículas e/ou agregados de tamanho maior e podem confundir qualquer caracterização adicional.
10. Fechar o balão sob uma atmosfera de N₂ e deixar agitar durante 3 h e 30 min à temperatura ambiente.
11. Para terminar a reação, retire o selo do balão e deixe a mistura de reação mexer por pelo menos 10 min. Isso exporia a mistura de reação a níveis atmosféricos de gás O₂ , que então extinguiria quaisquer radicais remanescentes na mistura de reação. A reação termina quando a mistura assume uma aparência opalescente azul clara.
12. Para purificar os nanogéis, adicione a mistura de reação a uma unidade de filtro centrífugo de 15 mL (100 kDa MWCO) e adicione água deionizada para encher a unidade centrífuga. Centrifugue a mistura de reação a 1000 x g por 10 min. Isso removerá quaisquer produtos químicos não reagidos (ou carga útil não encapsulada) que sejam menores que 100 kDa e concentrará a amostra de nanogel.
13. Assim que o nível de água na unidade centrífuga diminuir, adicione 2 mL de água deionizada para diluir a amostra de nanogel e centrifugue para concentrar o produto. Repita esta etapa 3x.
14. Armazenar a amostra a 2-8 °C para evitar a degradação da proteína encapsulada.
15. Realize a análise de FT-IR e ^{RMN 1}H (em dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d ₆)) para confirmar a polimerização^39,41. Para preparar a amostra, liofilize 1 mL da solução de nanogel em um frasco de 1,5 mL. O processo de liofilização envolve o congelamento da amostra e, em seguida, a aplicação de vácuo para remover o solvente congelado por sublimação, deixando para trás um resíduo em pó. Após a liofilização, dissolva novamente a amostra no solvente de RMN relevante, transfira para um tubo de RMN e feche-o firmemente. Carregue a amostra na máquina de RMN, conforme descrito anteriormente³⁹. Para a análise FT-IR, 1 mg do pó seco deve ser carregado no instrumento para obter os espectros.

4. Caracterização morfológica de nanogel

1. Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
   NOTA: O diâmetro hidrodinâmico (nm), o índice de polidispersidade (PI) e o potencial zeta foram medidos a 25 ° C, comprimento de onda do laser de 632,8 nm e detector de sinal de 173 ° usando uma máquina DLS. Cada execução mediu 25 ciclos de sub-varredura.
   1. Medição de tamanho hidrodinâmico (nm)
      1. Prepare uma cubeta ou uma célula capilar dobrada descartável limpando-a com água deionizada filtrada. Sopre ar comprimido na cubeta (adequado para medições de potencial DLS e zeta) para garantir que esteja livre de grandes partículas de poeira.
      2. Encha a cubeta com pelo menos 50-100 μL da amostra e dilua em 750-1000 μL de água deionizada filtrada. Ao usar uma cubeta de potencial zeta, certifique-se de que a cubeta foi preenchida com sample sem formação de bolhas, o que pode perturbar as medições.
      3. Coloque a cubeta dentro do instrumento DLS, certificando-se de que foi inserida corretamente. Para fazer isso, abra o sample tampa do compartimento do instrumento DLS. Segure a cubeta pelas bordas superiores para evitar impressões digitais nas janelas ópticas. Certifique-se de que a cubeta esteja encaixada corretamente no suporte da cubeta, certificando-se de que esteja nivelada e alinhada com o caminho óptico do instrumento. Feche o sample compartimento para evitar interferência de luz ambiente.
         NOTA: O meio de diluição é filtrado com um filtro de seringa de poros de 0,45 μm.
      4. Clique para iniciar a medição do tamanho das partículas no software da máquina DLS relevante.
      5. Selecione os resultados correspondentes à amostra para obter a média z (tamanho médio da partícula), PI médio, quilocontagens por segundo (kcps), potencial zeta e gráficos relevantes. Certifique-se de que a função de correlação exiba uma curva sigmoidal suave, pois isso sugere uma amostra uniforme.
      6. Quando a análise estiver concluída, remova a cubeta do DLS.
2. Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
   1. Prepare as amostras colocando 10 μL da solução de nanopartículas (0,077 mg/mL) em grades de cobre revestidas de carbono. Seque ao ar em temperatura ambiente por 1 h.
   2. Lave as grades com água deionizada filtrada e manche com 5 μL de acetato de uranila a 1% filtrado em água por 2 min.
   3. Depois de embeber o excesso de agente de coloração com papel de filtro, seque as grades durante a noite em temperatura ambiente. Capture imagens TEM no dia seguinte com ampliação de 45.000x usando uma câmera de campo claro.
   4. Use o software fornecido para processamento de imagem (resolução: 2048 x 2048 pixels).

5. Quantificação da proteína (BSA) encapsulada nos nanogéis usando um ensaio de ácido micro-bicinconínico (BCA)

1. De acordo com o protocolo de ensaio microBCA (fornecido no site do fabricante), gere uma curva padrão com base em uma concentração de proteína pré-definida⁴².
2. Após a sua síntese, purificar os nanogéis encapsulantes de proteínas utilizando unidades de filtro centrífugo de 15 ml com 100 kDa MWCO (1000 x g, 10 min), conforme descrito nos passos 3.12-3.14.
3. Colete o filtrado e analise usando o ensaio microBCA (protocolo disponível no site do fabricante). Medir a absorvância a 562 nm utilizando um leitor de placas. Como essa medição se correlaciona com a concentração de proteína não encapsulada, determine a massa da proteína encapsulada. Para calcular a eficiência de encapsulamento (EE) %, use a seguinte equação:
   

6. Quantificação da liberação de proteínas de nanogéis na presença de glutationa

1. Incubar 200 μL de 5 mg/mL de nanogéis carregados com Cy7BSA com 200 μL de glutationa 10 mM (GSH) nas unidades de filtro centrífugo de 0,5 mL (100 kDa MWCO). Coloque as unidades filtrantes em banho-maria para manter a temperatura a 37 °C.
2. Centrifugue a 1000 x g por 3 min a cada 10 min por pelo menos 1 h - depois a cada 2-8 h.
3. Recolher o filtrado e utilizar para análise posterior. Mantenha o volume do filtrado dentro das unidades de filtro centrífugo em 500 μL adicionando mais água deionizada ou PBS.
4. Meça a quantidade de proteína nos filtrados consultando uma curva padrão para nanogéis carregados com Cy7BSA, onde a absorbância da proteína fluorescente foi medida usando um instrumento nanodrop a 750 nm.
   NOTA: Esta curva padrão pode ser calculada preparando diluições seriadas de Cy7BSA na faixa de 0 mg / mL a 2 mg / mL. Os valores obtidos do nanodrop podem ser interpolados contra esta curva de calibração para determinar a eficiência do encapsulamento.

Síntese e caracterização do reticulador de diacrilato de dissulfeto de poli(etilenoglicol) (PEG) O reticulador responsivo a redox foi sintetizado pela substituição nucleofílica de um éster N-hidroxisuccinimida (NHS) pelo metacrilato de 2-aminoetila por meio da formação de uma ligação amida (Figura 1). A síntese do produto requerido foi validada principalmente por RMN ^{de 1}H (Figura Suplementar 1), que foi realizada dissolvendo a amostra do produto em DMSO deuterado, onde a combinação das ressonâncias correspondentes às unidades de etileno das cadeias PEG em δ3,48-3,53 e os trigêmeos correspondentes a (N)CH_{2-CH 2} Grupos em δ3,59-3,65 podem ser usados para identificar a formação do produto. A caracterização adicional do produto formado também foi realizada usando FT-IR (Figura Suplementar 2), MALDI-ToF (Figura Suplementar 3) e ^{RMN de 13}C (Figura Suplementar 4).

Antes de sua incorporação nos nanogéis, a clivagem do reticulador (4,55 mg / mL) foi avaliada por incubação com GSH (11 mM) por 24 h a 37 ° C em PBS. Os produtos resultantes foram então examinados usando APCI-MS (Figura 2). Foi possível identificar o pico do fragmento clivado a 586,2969 m/z ([M + H]⁺ onde M = CH₃C(CH₂) COOCH₂CH₂NHOOCCH₂CH₂O[CH₂CH₂O]₇CH₂CH₂SH) (Figura 2).

Síntese de nanogéis e caracterização físico-química
O procedimento de síntese para nanogéis é mostrado na Figura 3. Para confirmar a síntese dos nanogéis, foram realizados RMN ¹H e FT-IR, após a liofilização dos nanogéis. Para o espectro de RMN, os picos em δ1,25 e δ2,10 denotam os átomos de hidrogênio metanotriil e metanililidieno na estrutura do polímero (Figura Suplementar 5). Além disso, o pico amplo em δ3,70 corresponde aos átomos de hidrogênio de metileno do PEG (Figura Suplementar 5). Portanto, o espectro de RMN confirma a presença da cadeia de acrilamida e, portanto, a ocorrência de polimerização para formar o produto desejado. Para o espectro FT-IR, a falta do pico na região 1637-1640 ^cm-1 que corresponde ao trecho C = C da acrilamida é indicativa de polimerização (Figura Suplementar 6). Para confirmar ainda mais a polimerização e o encapsulamento da carga útil, a mistura de reação de nanogel foi submetida a medições de DLS em intervalos de tempo regulares ao longo do tempo de reação fornecido no protocolo (Figura 4). Aqui, o pico correspondente ao BSA a 8,302 nm diminui gradualmente à medida que mais é encapsulado no nanogel, e nenhum pico de BSA é visível após a purificação, sugerindo encapsulamento da proteína dentro da estrutura do nanogel²⁶.

A Tabela 1 mostra os resultados da caracterização físico-química dos nanogéis carregados com albumina de soro bovino (Cy7BSA) marcados com Cy7, como prova de conceito. Após sua síntese, os nanogéis foram purificados por centrifugação ou diálise, e suas propriedades físico-químicas foram caracterizadas por TEM e DLS (Figura 5A,B). O raio hidrodinâmico dos nanogéis é considerado adequado quando varia entre 50-100 nm. Observe que, se houver vários picos demonstrados no gráfico de distribuição de intensidade, é mais provável que seja devido à presença de populações de nanogéis de tamanhos variados (Figura Suplementar 7A). Além disso, com essas amostras de produtos, a função de correlação parece errática, em oposição a uma curva sigmoidal suave. Isso deve ser interpretado como um resultado negativo e deve ser descartado. Um resultado de tamanho DLS aceitável seria observável pela presença de um único pico definido no tamanho de interesse (Figura Suplementar 7B). Além disso, o PI deve ser constante e é aceitável até 0,2²⁷. Em comparação, os nanogéis vazios demonstram tamanhos inconsistentes e maiores ( Figura 5C , D ). O potencial zeta dos nanogéis também foi caracterizado para garantir a carga positiva dos nanogéis, o que permitiria a interação eletrostática com a membrana celular, facilitando assim a captação celular (Tabela 1).

A estabilidade dos nanogéis vazios e carregados com Cy7BSA após o armazenamento também foi investigada após 1 mês de armazenamento a 4 ° C e medindo seu tamanho e potencial zeta em água deionizada a 25 ° C (Figura suplementar 8A, B). Pouca mudança foi observada no tamanho geral ou no potencial zeta, indicando assim a estabilidade aprimorada desses nanogéis reticulados covalentemente.

Outro parâmetro crítico a ser medido é a eficiência de encapsulamento dos nanogéis, que é necessária para proteger a carga útil da degradação fisiológica^43,44. O protocolo foi desenvolvido para analisar a eficiência de encapsulamento (EE%) do aprisionamento de proteínas seguindo as instruções do fornecedor. Portanto, o protocolo envolve essencialmente a interpolação da concentração desconhecida de proteína nas lavagens, referindo-se a uma curva de concentração padrão de BSA. O valor obtido a partir do ensaio de micro-BCA dá uma ideia sobre a porcentagem de proteína que está presente nas lavagens dos nanogéis purificados. Portanto, indica indiretamente a porcentagem de proteína que é aprisionada com sucesso nos nanogéis (Tabela 1). Os valores de eficiência obtidos devem ser superiores a 70% e não devem apresentar diferenças significativas entre cada síntese. Valores mais baixos de eficiência de encapsulação representam um resultado negativo e indicam que essas formulações devem ser descartadas. Esses resultados confirmam a alta capacidade de encapsulação dos nanogéis, destacando assim sua aplicação promissora na entrega de proteínas.

Avaliação da responsividade redox de nanogéis
A responsividade ao GSH dos nanogéis foi investigada na concentração fisiológica de GSH (10 mM) a 37 ° C (Figura 6A) ²⁹ . Essa concentração de GSH foi determinada por referência à literatura sobre medições fisiológicas de GSH e nanomateriais responsivos a GSH^28,32. Até 86% do Cy7BSA encapsulado foi liberado em 48 h ( Figura 6B ). Por outro lado, experimentos de controle sem adição de GSH levaram a apenas 15% de proteína liberada, o que poderia refletir a liberação de explosão de qualquer proteína adsorvida na superfície^14,45.

Para determinar se a integridade biológica da proteína encapsulada foi comprometida durante a síntese, degradação ou armazenamento do nanogel, a proteína isolada via filtração foi liofilizada e submetida à análise FT-IR (Figura 7A). A estrutura tridimensional da proteína é composta de estruturas secundárias, incluindo α-hélices, folhas de β, β voltas e bobinas aleatórias, que são criadas por ligações de hidrogênio de grupos C = O e NH de ligações peptídicas dentro das cadeias polipeptídicas⁴⁶. A absorção infravermelha relacionada a tais estruturas secundárias aparece na região de 1700 ^cm-1 e 1600 ^cm-1. A análise da banda de amida I que aparece nessa região pode indicar se a proteína sofre desnaturação em algum estágio durante a síntese, degradação e armazenamento do nanogel⁴⁷. A absorção infravermelha da BSA nativa foi comparada com a BSA isolada da mistura de reação, pós-incubação dos nanogéis com GSH e após armazenamento de nanogel por 30 dias. Para a BSA isolada durante a síntese de nanogel e incubação pós-GSH, o pico em 1662 ^cm-1 representa a predominância de β intactas na estrutura da BSA. No entanto, o aparecimento do pico a 1613 ^cm-1 na BSA isolada de nanogéis armazenados por 30 dias é indicativo da formação de estrutura de folha de β intermolecular resultante da agregação de proteínas. A análise de dicroísmo circular (CD) também foi realizada para confirmar os resultados obtidos por meio da análise FT-IR (Figura 7B). Como é evidente nas curvas que coincidem com a da BSA nativa, a proteína isolada da mistura de reação do nanogel e a incubação pós-GSH permaneceram inalteradas, pois não há alterações nas duas bandas negativas na região ultravioleta em 208 nm e 222 nm dos espectros de CD, que são características da estrutura α-helicoidal da proteína. Para a BSA isolada dos nanogéis após 30 dias, foram visíveis pequenas aberrações nesses picos, que poderiam ser indicativas de alguma agregação.

Figura 1: Esquema demonstrando a síntese do reticulador de diacrilato de dissulfeto de PEG. Em condições básicas, o ataque nucleofílico da amina primária, 2-aminoetilmetacrilato, nos ésteres NHS resulta na formação de ligações amida, gerando assim o reticulador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ionização química da pressão atmosférica - espectros de massa do produto de dissulfeto de diacrilato de PEG clivado após incubação com GSH. Os dados mostram o pico do íon molecular do produto clivado M = C₂₆H₄₉NO₁₁SH⁺, onde [M + H]⁺ = 586,2969 m/z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Síntese de nanogéis poliméricos responsivos a redox. Síntese de nanogel de polimerização radical aquosa em uma etapa. Os monômeros foram inicialmente encapsulados em micelas de dodecil sulfato de sódio (SDS), onde a polimerização in situ foi iniciada por N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e persulfato de amônio (APS). A acrilamida (AM) altamente solúvel mantém a estabilidade do nanogel em ambientes aquosos, o cloreto de 2-(acriloiloxi)etiltrimetilamônio (AETC) mantém a modelagem eletrostática da carga útil da proteína desejada e reduz a liberação prematura. Além disso, o reticulador de diacrilato de dissulfeto PEG permite a liberação controlada de carga útil. O SDS é posteriormente removido por métodos de purificação; centrifugação com três lavagens contra água deionizada ou por diálise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Medições dinâmicas de espalhamento de luz (DLS) da mistura de reação de nanogel em intervalos de tempo específicos. A diminuição gradual na intensidade do pico associado à proteína BSA (8,302 nm) foi usada para rastrear o encapsulamento da proteína e a progressão da polimerização ao longo de 4 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Caracterização de Cy7-BSA_NG3 e Empty_NG1. (A) TEM de coloração negativa de nanogéis carregados com Cy7BSA (Cy7BSA_NG3). Barra de escala a 200 nm. (B) Traços DLS exibindo distribuição de tamanho e função de correlação para Cy7BSA_NG3. D_H no eixo X refere-se ao diâmetro hidrodinâmico, ou tamanho, dos nanogéis. (C) TEM de coloração negativa de nanogéis vazios (Empty_NG1). Barra de escala a 200 nm. (D) Traços DLS exibindo distribuição de tamanho e função de correlação para Empty_NG1. D_H no eixo X refere-se ao diâmetro hidrodinâmico, ou tamanho, dos nanogéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Investigações da atividade de GSH em nanogéis encapsulados Cy7BSA (Cy7BSA_NG3). (A) Liberação controlada mediada por GSH de carga útil encapsulada. (B) Liberação cumulativa de Cy7BSA a 37 ° C com incubação de 10 mM GSH por 48 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Impacto das condições de reação do nanogel, degradação do nanogel mediada por GSH e armazenamento prolongado do nanogel na integridade estrutural do BSA encapsulado. Alterações na estrutura secundária da BSA após exposição a várias condições foram confirmadas por (A) FT-IR e (B) dicroísmo circular (CD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Caracterização físico-química completa dos nanogéis. As propriedades estruturais do nanogel são resumidas, incluindo o tamanho, polidispersidade (PI), taxa de contagem média derivada e potencial zeta. As respectivas eficiências de encapsulamento também foram incluídas para comparação.

Figura suplementar 1: Espectro de RMN de ¹H do reticulador de dissulfeto de diacrilato de PEG. RMN ^{de 1}H (400 MHz, (CD₃)₂SO): δ8,05 (t, 2H), 6,07 (s,2H), 5,69-76 (m, 2H), 4,05-4,09 (m, 8H), 3,61-3,65 (t, 4H), 3,57-3,59 (t, 4H), 3,48-3,53 (m, 56H), 2,88-20,91 (t, 4H), 2,31-2,34 (t, 4H), 1,88 (s, 6H). *Solventes residuais (CH₃)₂SO (δ 2.50). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) do reticulador de dissulfeto de diacrilato PEG. N-amina C(O)N-H estiramento: 3700-3200 ^cm-1 (largo); alquil sp³ estiramento CH: 2950-2850 ^cm-1 (forte), carbonila C = O estiramento: 1650 ^cm-1 (forte). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Espectro de dessorção a laser assistida por matriz/tempo de voo de ionização (MALDI-ToF) do dissulfeto de diacrilato de PEG. Massa calculada (C₅₀H₉₂N₂O₂₂S₂⁺): 1137,5656 m/z, real: 1137,5660 m/z. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) ¹³C do reticulador de dissulfeto de diacrilato de PEG. ¹³C RMN (400 MHz, (CD₃)₂SO): δ171,04, 166,89, 135,18, 125,36, 69,98-70,24, 69,20, 64,38, 64,54, 38,23, 36,79, 35,58, 18,49. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Espectro de RMN ^{de 1}H de nanogéis liofilizados. ^{RMN de 1}H (400 MHz, D₂O): δ3,70 (s), δ2,1 (m), δ1,25 (m). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 6: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) de nanogéis liofilizados. N-amina C(O)N-H estiramento: 3700-3200 ^cm-1; alquil sp³ C-H estiramento: 2950-2850 ^cm-1 (forte), carbonila C=O estiramento: 1655 ^cm-1 (forte); Trecho OC: 1095 ^cm-1 (nítido). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 7: Caracterização de nanogéis. (A) Resultado negativo de DLS, caracterizado pela presença de múltiplos picos e uma curva de correlação errática. (B) Resultado positivo de DLS, caracterizado pela presença de um pico único e bem definido e uma curva de correlação sigmoidal suave. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 8: Investigando a estabilidade a longo prazo de nanogéis por tamanho e medições de potencial zeta. Ambos os nanogéis vazios e os nanogéis carregados com Cy7BSA foram submetidos à análise DLS durante um período de 30 dias. Clique aqui para baixar este arquivo.

A crescente demanda por produtos biológicos específicos na indústria biofarmacêutica impulsionou a necessidade de tecnologias que possam melhorar seus perfis farmacológicos in vivo, evitando sua rápida degradação fisiológica e compensando quaisquer efeitos colaterais indesejados. Com isso em mente, é descrito um procedimento simples para a síntese de nanogéis carregados de proteínas. Conforme indicado no protocolo, o reticulador responsivo a redox precisa ser sintetizado antes da síntese do nanogel. Em seguida, os principais monômeros restantes são adicionados e, após a adição de dodecil sulfato de sódio (SDS), a polimerização radical in situ é iniciada por N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e persulfato de amônio (APS). A acrilamida (AM) altamente solúvel mantém a estabilidade do nanogel em ambientes aquosos, o sal de cloreto de 2-(acriloiloxi)etil trimetilamônio (AETC) mantém a modelagem eletrostática da carga útil de proteína desejada e reduz a liberação prematura²⁶. Além disso, o reticulador de diacrilato de dissulfeto PEG permite a liberação controlada da carga útil^28,32. O SDS é posteriormente removido por métodos de purificação; centrifugação com três lavagens contra água deionizada ou diálise.

Muitos pesquisadores em todo o mundo sintetizaram nanopartículas poliméricas usando uma variedade de diferentes estratégias sintéticas ^1,48,49. Nosso protocolo sintético difere dos métodos comumente usados de maneira fundamental, pois não envolve o uso de solventes orgânicos ou altas temperaturas. Levando isso em consideração, a novidade do nosso procedimento significa que a capacidade do usuário pode desempenhar um papel fundamental na síntese bem-sucedida dos nanogéis. Um passo importante na síntese de nanogéis é garantir a manutenção da atmosfera inerte, que deve ocorrer de forma controlada para evitar a perda do produto desejado, pois o oxigênio no ar pode dificultar a polimerização de acrilatos e metacrilatos. Portanto, a mistura e a adição de cada reagente em condições inertes podem exigir alguma prática para serem alcançadas corretamente. No entanto, o protocolo descrito oferece uma metodologia versátil, pois vários outros monômeros podem ser adicionados à síntese para dotar os nanogéis de propriedades específicas, por exemplo, o uso de monômeros heterobifuncionais acrilados para tornar os nanogéis passíveis de outros procedimentos bioconjugativos. Além disso, é possível, com otimização suficiente, explorar o encapsulamento de cargas úteis baseadas em ácidos nucleicos, pois houve um imenso ressurgimento no uso de terapias gênicas para tratar não apenas doenças monogênicas raras, mas também doenças crônicas e progressivas⁵⁰.

Em resumo, apresentamos uma estratégia de base aquosa leve para sintetizar nanogéis de forma reprodutível com tamanhos abaixo de 100 nm e habilidades eficientes de retenção de carga útil. Além disso, ao incorporar um novo reticulador de dissulfeto dentro dos nanogéis, demonstramos a liberação controlada da carga útil aprisionada em resposta a um agente redutor intracelular. Também demonstramos que essa estratégia sintética não compromete a carga útil. Este protocolo fornecerá uma base para mais inovações no campo da nanoterapia responsiva a estímulos. Devido às suas condições sintéticas únicas e flexíveis, espera-se que os nanogéis desempenhem um papel crítico no campo de entrega de medicamentos daqui para frente.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar. Não há detalhes financeiros a serem declarados.

Agradecemos ao Departamento de Química do Imperial College London e ao Instituto de Ciências da Vida do Conselho de Pesquisa Médica por seu apoio.